腫瘤免疫細胞治療平臺及CAR-T技術(shù)的建立臨床重點項目計劃書

1、臨床學(xué)科重點項目計劃書項目名稱：腫瘤免疫細胞治療平臺及CAR-T技術(shù)的建立資助金額：萬元科室（單位）：血液科項目負責(zé)人：項目負責(zé)人聯(lián)系電話：項目負責(zé)人手機：項目負責(zé)人電子信箱：執(zhí)行年限：年1月1日年12月31日項目組人員情況廳P姓名職稱出生日期學(xué)位1主任醫(yī)師博士2教授/主任醫(yī)師博士3研究員博士4主治醫(yī)師碩士5助理研究員博士6助理研究員博士7助理研究員碩士8主治醫(yī)師學(xué)士9主治醫(yī)師博士10主治醫(yī)師碩士11主治醫(yī)師碩士12主治醫(yī)師學(xué)士13主任醫(yī)師學(xué)士14主治醫(yī)師博士15助理研究員博士16主治醫(yī)師博士17住院醫(yī)師博士項目簡介近年來淋巴瘤的發(fā)病率逐年上升，已超過所有血液惡性月中瘤的總和，占惡性 血液病之

2、首。淋巴瘤已成為一個威脅國民健康的重要病種，具類型較多、異質(zhì)性較強，侵襲性亦不同。隨著化療體系的完善和靶向新藥的應(yīng)用， 淋巴瘤的療效顯 著提高，已達到60%以上，但其中有部分患者仍會耐藥或復(fù)發(fā)，成為目前治療 的難點和重點。免疫細胞治療是月中瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。自體免疫細胞治療技術(shù)是指從自體外周血中分離的單個核細胞經(jīng)過體外激活和擴增，達到一定數(shù)量后回輸 患者體內(nèi)，以發(fā)揮其直接殺傷月中瘤細胞和病毒感染細胞的作用，調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。嵌合抗原受體修飾 T細胞(Chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T) 技術(shù)是一種革命性的治療血液系統(tǒng)惡性月中瘤的免疫細

3、胞治療方法，該技術(shù)將抗體 對月中瘤抗原的高親和性與 T淋巴細胞的殺傷功能相結(jié)合，使其具有特異性識別 并殺傷月中瘤細胞的能力。CAR-T細胞技術(shù)已成功應(yīng)用于難治復(fù)發(fā)白血病的治療， 美國的臨床研究顯示對很大一部分B淋巴細胞復(fù)發(fā)難治的白血病患者可以起到很好的療效，是月中瘤治療領(lǐng)域的革命，本研究組也在2例難治復(fù)發(fā)B細胞淋巴瘤患者中應(yīng)用了 CAR-T治療，取得了較好療效。該治療策略臨床風(fēng)險較小， 對患者療效較好，可延長患者無病生存時間、降低患者復(fù)發(fā)率，明顯改善患者的 生活質(zhì)量。與傳統(tǒng)的化療比較，該療法對患者毒副作用小，患者易于接受。近年國際血液、月中瘤界免疫治療相關(guān)研究非常活躍，但CAR-T技術(shù)仍在探索

4、中，國際僅部分月中瘤中心在進行臨床試驗， 尚未普遍開展，我國在這方面剛剛 起步，且在淋巴瘤治療中尚未見報道。如果我們能夠抓住這一契機，開展CAR-T 治療，將可明顯改善難治、復(fù)發(fā)淋巴瘤患者的治療效果，使更多的患者從中受益， 并可使我院的淋巴瘤免疫治療居國內(nèi)領(lǐng)先地位，提高醫(yī)院及科室聲譽和經(jīng)濟效 益。報告正文三、立項依據(jù)目前淋巴瘤的發(fā)病率在所有惡性血液病中居首位，近年來我國淋巴瘤的發(fā)病 率也逐年上升。由于淋巴瘤現(xiàn)在已成為可以治愈的月中瘤，60%以上患者經(jīng)規(guī)范化治 療可長期生存，但本病類型較多、異質(zhì)性較強，侵襲性亦不同，難治、復(fù)發(fā)疾病 的治療仍是臨床醫(yī)師面臨的難題：針對其不同分類、分期及預(yù)后因素，探

5、索新的、 規(guī)范化的診療方案對患者具有重要意義。與發(fā)達國家比較，我國 T細胞淋巴瘤、 高惡性淋巴瘤、侵襲性淋巴瘤及結(jié)外非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率高，因此我國淋巴 瘤預(yù)后不良的亞型較多，臨床表現(xiàn)為難治性及侵襲性臨床過程，預(yù)后較差。常規(guī) 化療近期療效尚可，但遠期生存率低，預(yù)后不良，需進一步研究患者的預(yù)后相關(guān) 因素，并探索新的治療策略。免疫細胞治療因其是只針對月中瘤細胞進行的特異性治療，對正常組織損傷較 小，逐漸成為一種全新的有希望的治療模式。目前針對淋巴瘤的免疫治療有了很 多進展和突破，近幾十年人們一直嘗試采用免疫學(xué)方法治療月中瘤，如輸注異基因 淋巴細胞(donor lymphocyte infusio

6、n, DLI)及輸注樹突狀細胞(Dentritic cell)疫 苗。樹突狀細胞疫苗用于月中瘤免疫治療包括如肽、蛋白、月中瘤細胞及提取物的體 外致敏，月中瘤相關(guān)抗原(TAA)、RNA或細胞因子的基因轉(zhuǎn)移，與月中瘤細胞形成 融合細胞等。目前，細胞免疫治療己經(jīng)成為月中瘤生物治療中重要的發(fā)展方向，包 括淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、浸潤月中瘤淋巴細胞(TIL)、CD3單抗激活的殺傷 細胞(CD3AK)和細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer ,CIK)等。同時針 對乙肝病毒、EBV的免疫細胞治療也在臨床取得了一定療效。嵌合抗原受體修飾 T細胞(chimeric an

7、tigen receptor T cell, CAR-T)是近年來受 體迅速發(fā)展的月中瘤過繼免疫治療新手段，是將識別月中瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(scFv) 和T細胞受體TCR復(fù)合體的CD3七胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合為一體，即將抗體對月中瘤 抗原的高親和性與T淋巴細胞的殺傷功能相結(jié)合，使其具有特異性識別并殺傷月中 瘤細胞的能力，同時也可以刺激體內(nèi) T細胞增殖。CAR-T技術(shù)自提出后至目前共 有3代，第1代CAR-T不包括修飾因素，治療效果不太理想，之后的學(xué)者在細胞的胞內(nèi)區(qū)增加了 1-2個共刺激信號結(jié)構(gòu)域，根據(jù)修飾分子的多少及類型分為第2代和第3代CAR-T,第一個共刺激信號為CD28或4-1BB,第2個

8、共刺激信號可能 有：CD27, CD28, 4-1BB, ICOS或OX40等。自體T細胞可以通過基因修飾后逆 轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)來長期表達 CARs,因此CAR-T治療可能實現(xiàn)對 疾病的長期控制，患者體內(nèi)可在幾年內(nèi)均檢測到CAR-T細胞，但是，靶向治療的毒副反應(yīng)及轉(zhuǎn)染的風(fēng)險還需得到進一步關(guān)注。如同任何基因表達治療方法，CART表達框架在人體染色體基因組的隨機插入，仍存在著對重要功能基因的不確定影 響（如增強、阻斷、突變、癌變等），故其潛在的臨床應(yīng)用安全性和副作用仍然 是阻礙這一方法未來廣泛普及的障礙。表達框架的安全精確定點插入，是解決這 一問題的關(guān)鍵。2011年美國Dr. June

9、研究小組在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了應(yīng)用 CART 細胞成功治療慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL ）的臨床研 究報告，這項工作中他們嘗試治療了 3例復(fù)發(fā)難治的成年白血病患者，其中2例 完全緩解并保持至今。2013年12月，美國血液學(xué)年會新聞發(fā)布會報道全美共治 療了 59例復(fù)發(fā)難治白血病患者，其中 24名獲得了完全緩解。2014年10月， Dr. June報告了最新治療的30例復(fù)發(fā)難治白血病患者中有 27例達到完全緩解， 完全緩解率達90%。CART技術(shù)獨特的作用機制和驚人的治療效果使人們切實地 領(lǐng)悟到基因工程修飾的T細胞方法一CAR-T細胞治

10、療方法，將成為未來免疫細胞 治療諸多方法中威力最強、前景最好的方法，是月中瘤治療領(lǐng)域的一次革命。血液 科在醫(yī)院的大力支持下，較早開展了血液月中瘤及部分實體瘤的細胞治療，前期已 有成熟的DC+CIK細胞治療經(jīng)驗，而且已經(jīng)在 2例難治復(fù)發(fā)彌漫大B細胞淋巴瘤 患者中應(yīng)用了 CAR-T治療技術(shù)，患者均取得了較好療效，并無較重毒副反應(yīng)，也 顯示該技術(shù)具有一定的臨床推廣應(yīng)用前景。CAR-T細胞治療的毒副反應(yīng)主要來自成指數(shù)增殖的 T細胞，但這也是CAR-T 細胞發(fā)揮效應(yīng)所必需的，因此還需平衡風(fēng)險及收益。細胞因子釋放綜合征（CRS）是常見且最突出的毒副反應(yīng)，是由細胞因子激增所致的炎癥過程，包括流感樣癥 狀、血

11、管滲漏和多器官功能衰竭所致的低血壓等。研究表明，患者不論腫瘤負荷 高低均會出現(xiàn)程度不等的CRS表現(xiàn)，目前較高的月中瘤負荷是唯一明確的預(yù)測嚴(yán)重CRS的指標(biāo)，較CRP而言，細胞因子水平可能是更好的標(biāo)記物，但還需要更多的 臨床數(shù)據(jù)來驗證。目前我科已經(jīng)開展了患者的免疫功能全套檢測，可以對患者的 免疫細胞及細胞因子進行治療前后的監(jiān)測，在預(yù)防CRS中具有重要的臨床意義。因此，本課題擬依托我院的臨床干細胞中心，進行如下工作： 1、建立免疫細 胞治療平臺，規(guī)范血液科免疫細胞治療流程；2、建立常規(guī)CIK、DC+CIK、EBV-CIK 等細胞治療及細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程；3、新技術(shù)的探索：選擇難治復(fù)發(fā)B細胞淋 巴瘤

12、患者，評估其一般情況及免疫功能，并對患者進行 CAR-T免疫細胞治療，治 療后監(jiān)測其免疫功能，并對患者進行隨訪及評估，以期評價 CAR-T免疫細胞治療 的有效性及安全性。四、項目的研究目標(biāo)、研究內(nèi)容、以及擬解決的關(guān)鍵問題（一）研究目標(biāo)1. 建立細胞治療平臺，規(guī)范治療流程2. 建立臨床級CAR-T制備技術(shù)平臺3. 新一代CAR-T技術(shù)的應(yīng)用（二）研究內(nèi)容1. 免疫細胞治療技術(shù)1） 細胞毒性T淋巴細胞（CTL） +/-樹突狀細胞（DC）免疫細胞治療：血細 胞分離機分離患者外周淋巴細胞 50-70ml,離心后在我院GMP實驗室培 養(yǎng)CTL及DC細胞，分2-3次回輸至患者體內(nèi)。2） 過繼性NK免疫細胞

13、治療：血細胞分離機分離患者外周淋巴細胞 50-70ml, 離心后在我院GMP實驗室培養(yǎng)NK細胞，分2-3次回輸至患者體內(nèi)。2. 建立標(biāo)準(zhǔn)化管理體系1） GMP實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的建立2） 完善細胞培養(yǎng)的SOP保證標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)3） 人員培訓(xùn)：臨床醫(yī)師及實驗室工作人員的培訓(xùn)3. 質(zhì)量控制1） 細胞數(shù)量、成分、活性的質(zhì)量控制2） 微生物及病原體的控制4. 建立臨床級CAR-T細胞制備技術(shù)平臺1）篩選CD19+淋巴瘤患者2）進行10-20例CAR-T細胞治療5. 進行CRISPR聯(lián)合CAR-T技術(shù)的基礎(chǔ)研究：常規(guī) CAR-T方案基因插入具 有隨意性，而應(yīng)用CRISPR技術(shù)可以做到精確定點插入目的基因。

14、（三）擬解決的關(guān)鍵問題1、 選擇難V臺復(fù)發(fā)B細胞淋巴瘤患者，進行第三代 CAR-T免疫細胞治療；2、 在CAR-T免疫細胞治療前后檢測患者各種免疫細胞及細胞因子，并評價 這些指標(biāo)在預(yù)測細胞因子風(fēng)暴（CRS）嚴(yán)重程度中的作用；3、 建立常規(guī)CTL、DC+CTL等細胞治療及細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程；建立我院免疫細胞治療平臺，規(guī)范血液科免疫細胞治療流程。五、擬采取的研究方案及可行性分析。研究方案本研究擬進行10-20例復(fù)發(fā)難治白血病病人的自體 19CART細胞治療。患者簽署 知情同意書，篩選合格后注冊登記入組，采用細胞治療聯(lián)合化療方法治療。通過觀察細 胞治療后的副作用，評估19CART治療方案的安全性；

15、與病人自身過去標(biāo)準(zhǔn)方案治療的 結(jié)果比較，定期隨訪評估19CART治療方案的有效性和可行性。（一）入選標(biāo)準(zhǔn)：1）符合以下條件的CD19陽性的白血病患者：符合以下條件的ALL患者：不適合異體干細胞移植條件或由于條件限制放棄異體干細胞移植的。符合以下條件的CLL患者：I先前至少經(jīng)過2次化療方案（不包括單藥的利妥昔單抗）治療的；II最后一次化療與疾病進展間隔不足 1年的；III不適合異體干細胞移植條件或由于條件限制放棄移植異體干細胞移植的。2）年齡18-60歲；3）預(yù)計生存期3個月至2年；4）自體移植患者，無論其之前經(jīng)過怎樣的治療，復(fù)發(fā)后都是符合條件的；5）育齡婦女在給藥開始前尿妊娠試驗陰性，并同意在

16、試驗期間直至最后一次隨訪采取有效的避孕措施者；6）自愿參加本實驗并簽署知情同意書者。（二）排除標(biāo)準(zhǔn)：具備下述排除標(biāo)準(zhǔn)中任何一項的患者不能入選本試驗：1）具有癲癇病史或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；2）具有移植物抗宿主反應(yīng)，需要使用免疫抑制劑者；3）既往有QT期間延長或嚴(yán)重心臟疾病者；4）懷孕或哺乳期婦女（本療法對未出生的孩子的安全性尚未知）；5）未治愈的有活動性感染者：6）活動性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染者；7）參加治療前2周內(nèi)合并使用全身性類固醇藥物者（最近或目前正在使用吸入類固 醇的除外）；8）之前使用過任何基因治療產(chǎn)品者；9） T細胞被復(fù)制缺陷型慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率低于 30%,或應(yīng)答CD3 /

17、CD28共刺激信 號時擴增能力不足（5倍）者；10）肌酸酊2.5mg/dl或ALT / AST3倍正常量或膽紅素2.0 mg/dl者；11）患有其他未被控制的疾病，研究者認(rèn)為不適合加入者；12）艾滋病病毒感染者；13） CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的白血病患者；14）研究者認(rèn)為可能增加受試者危險性或干擾試驗結(jié)果的任何情況。（三）剔除標(biāo)準(zhǔn)：受試者符合以下任何一項標(biāo)準(zhǔn)的，將提前退出試驗：1 .受試者要求退出試驗；2 .嚴(yán)重違背方案；3 .發(fā)生不良事件，研究者判斷需要終止試驗的情況，包括：NCI CTC3級癥狀；細胞輸注24周內(nèi)的任何時間發(fā)生可能、很可能或確定與本研究有關(guān)的實驗室毒性 和臨床事件，包括但不

18、限于輸注毒性和任何可能與19CART細胞有關(guān)的任何毒性，如發(fā)燒、皮疹、中性粒細胞減少，血小板減少，骨髓再生障礙性貧血，肝功能異常、肺浸 潤或其他肺毒性等；4 .受試者懷孕；5 .從受試者采集的T細胞數(shù)量不足以制備滿足標(biāo)準(zhǔn)的 19CART細胞的；6 .受試者新發(fā)繼發(fā)惡性月中瘤。（四）治療方案1 .細胞治療前的化療方案：化療在細胞輸注前-4-1天進行，以保障19CART細胞能夠在化療結(jié)束12天后 輸注?；煹哪康氖菧p少淋巴細胞數(shù)量，以促進 19CRAT細胞的移植和穩(wěn)定的擴增?；熞彩菫榱藴p小腫瘤負荷。CART細胞治療后發(fā)生細胞因子釋放綜合征（CRS）的概 率和嚴(yán)重程度與月中瘤細胞負荷呈正相關(guān)?；?/p>

19、藥物可將月中瘤細胞數(shù)目降低，從而降低細 胞因子釋放綜合征發(fā)生的概率和嚴(yán)重程度。減瘤化療是可選方案，不是本研究方案的必 須部分，可以根據(jù)月中瘤醫(yī)生的建議做出選擇?；煹倪x擇將取決于患者病情和既往的治 療。根據(jù)美國臨床研究報道的成熟方案設(shè)計化療方案如下：輸注前第4,3,2天：連續(xù)3天靜脈注射福達華（fludarabine）,注射劑量為2530mg /m2/day;輸注前第2天：同時靜脈注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）,注射劑量為900mg /m2/day;2 .病人CART細胞回輸方案：根據(jù)美國已有的文獻報道，CAR修飾的T細胞回輸量為1 x1051x107細胞/公斤 體重。本研究

20、參照此范圍，并根據(jù)收集到的病人T細胞數(shù)量來酌情制定回輸方案。輸注劑量：1 x1051x107細胞/公斤體重 輸注形式：采用分次輸注。第一次輸注過程分 3天進行。第0天按照輸注劑量的10%將CART細胞經(jīng)靜脈緩 慢輸注入病人體內(nèi)，輸注過程約持續(xù)30分鐘。第1天按照輸注劑量的30%,第2天 按照輸注劑量的60%進行輸注；輸注后嚴(yán)密監(jiān)控病人是否有臨床并發(fā)病癥， 對于有足夠的19C ART細胞可用 且無 臨床并發(fā)癥的患者可于第11天酌情進行第二次靜脈輸注。3 .細胞因子釋放綜合征（CRS）應(yīng)對策略根據(jù)美國臨床試驗的文獻發(fā)現(xiàn)，由于 19CART細胞殺滅月中瘤細胞的效率非常 高， 大量的細胞因子會在短時間

21、內(nèi)被釋放到血液中，病人在19CART細胞回輸后 的第714天可能發(fā)生細胞因子釋放綜合征（CRS）,即所謂的 細胞因子風(fēng)暴19CART細 胞治療后發(fā)生細胞因子風(fēng)暴的概率和嚴(yán)重程度與月中瘤負荷正相關(guān)。細胞因子風(fēng)暴的直接臨床表現(xiàn)為發(fā)熱。我們擬采用在美國同類臨床研究中被證明有效的抗白介素-6R抗體Tociluzuma b （8mg /kg）來控制細胞因子釋放綜合征（CRS）,同時酌情結(jié)合糖皮 質(zhì)類 激素來配合治療。4 . B細胞耗竭的應(yīng)對方案由于正常 B細胞也具有 CD19抗原，所以19CART細胞攻擊 CD19陽性的月中瘤 細胞時會同時攻擊 CD19陽性的正常B細胞，可能使B細胞耗竭而發(fā)生低丙 球蛋

22、白 血癥。對于低丙球蛋白血癥的案例，在臨床上受試者按照臨床劑量準(zhǔn)則給予靜脈免疫球 蛋白（IVIG）治療，以恢復(fù)正常血清免疫球蛋白水平。5 .不受控制的T細胞擴增應(yīng)對方案19CART細胞的擴增可能不受正常的體內(nèi)正常的平衡機制控制。美國臨床前研究表明，19CART細胞的增殖只對生理信號或針對 CD19有反應(yīng)。本研究中T細胞可能 對月中瘤細胞或正常 B細胞產(chǎn)生的信號有反應(yīng)而增殖。這可能是有益的也可能是有害的，取決于T細胞增殖的程度。以往的試驗表明，T細胞克隆數(shù)占 主導(dǎo)地位與月中瘤細 胞的減少有關(guān)。如果受試者發(fā)生T細胞過度增殖的情況，可以使用糖皮質(zhì)激素予以干 預(yù)。（五）觀察項目與時點、試驗流程1 .安

23、全性觀察項目根據(jù)國家衛(wèi)生部藥政局制定的新藥臨床及臨床前研究指導(dǎo)原則中的毒性分級標(biāo) 準(zhǔn)和可能出現(xiàn)的副作用進行各項指標(biāo)的記錄：、體格檢查；、一般情況：心率、心律、呼吸、血壓、體溫；、實驗室檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、凝血功能、血生化、心電圖、其他實 驗室檢查（乙肝表抗、胸透、B超）；、不良反應(yīng)觀測（NCI-CTC 3.0標(biāo)準(zhǔn)）。2 .療效性觀測項目主要相關(guān)癥狀與體征；瘤體變化觀測（影像學(xué)）；相關(guān)理化檢查（月中瘤標(biāo)志物、免疫 功能）；道常駐菌指標(biāo)；體重變化觀測；行為狀況觀測（卡氏評分、生活質(zhì)量評分）。3 .時點1）受試者在回輸后第1個月，按照每周一次、連續(xù)三周接受體檢及不良反應(yīng)記錄 存檔。體檢包括

24、：成像，MRD評估，骨髓 穿刺，活檢和/或淋巴結(jié) 活檢，抽血進行血 清中細胞因子水平檢測，化學(xué)檢測，以及 19CART細胞存有量的實驗室檢測。2）受試者在回輸后第 26個月，按照每月一次進行評估。3）受試者在回輸后0.52年內(nèi)，按照每3個月一次進行評估。4）受試者在回輸后的35年內(nèi)，按照每年一次進行評估。（六）療效評定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)以上觀測結(jié)果，進行療效判定：以月中瘤細胞比例變化作為療效的主要標(biāo)準(zhǔn)（治愈情況）；臨床癥狀改善情況；治后生存期（生存率）；月中瘤無進展時間；生活質(zhì)量評價；免疫功能評價；毒性反應(yīng)（不良反應(yīng)）評價。（七）統(tǒng)計方法：1、患者入組及分析人群描述描述入組人數(shù)，全分析集、符合方案集和安

25、全集人數(shù)及其剔除人數(shù)，描述試驗病例 脫落情況。2、基線數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述和分析描述治療前各種醫(yī)學(xué)檢查指標(biāo)基本情況。對分類數(shù)據(jù)，計算各類例數(shù)及比例。3、安全性分析安全評估指標(biāo)包含所有的不良反應(yīng)，嚴(yán)重不良反應(yīng)，血液學(xué)及生化學(xué)資料等所有的 毒性評估根據(jù)NCI一般毒性標(biāo)準(zhǔn)4.0版分級。停止后30天內(nèi)PD死亡的不需要報，PD死亡 的或PD住院的不需要報。4、療效分析受試者接收19CART細胞輸注后隨訪時或受試者需要替代治療時，醫(yī)生判定療效 和評估病情的依據(jù)包括：癥狀體征、血常規(guī)、血清生化、外周血涂片檢查、骨髓涂片檢 查、骨髓染色體核型分析、臟器功能檢測、淋巴結(jié)活檢、CT、白血病微小殘留檢測、免疫功能檢測、抗白

26、血病效應(yīng)（GVL/RVL ）等。（八）試驗的質(zhì)量控制與保證為確保本研究嚴(yán)格按臨床研究方案進行，在本研究整個過程中，臨床研究者、中辦者及臨床監(jiān)查員均應(yīng)嚴(yán)格按照GCP要求進行操作，務(wù)必做到試驗程序規(guī)范，試驗數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確，研究結(jié)論可靠。所有的有效病歷均需最終數(shù)據(jù)審核合格后， 方可確認(rèn)為有效病歷。（九）進行CRISPR聯(lián)合CAR-T技術(shù)的基礎(chǔ)研究常規(guī)CAR-T方案基因插入具有隨意性，而應(yīng)用 CRISPR技術(shù)可以做到精確定點插 入目的基因，完成2-3例患者的基礎(chǔ)研究。可行性分析我科在醫(yī)院的大力支持下已經(jīng)開展了 CTL+DC細胞治療，共進行了 130余例次的 免疫細胞輸注，積累了豐富的免疫細胞治療經(jīng)驗，同時

27、培養(yǎng)了一批具有豐富細胞治療經(jīng) 驗的臨床醫(yī)師、護士及實驗室人員。本研究的細胞制備擬在我院臨床干細胞中心進行，我院臨床干細胞研究中心成立 于2006年，占地面積約500平米，目前主要由2個GMP車間、科研區(qū)及各自的附屬區(qū) 構(gòu)成，GMP車間及附屬區(qū)因功能不同而分別達到 B級、C級潔凈度，可以滿足臨床級 細胞移植時制備細胞的要求?？蒲袇^(qū)及附屬區(qū)配置有先進的能夠快速分選干細胞的流式 細胞分選儀、全自動化的免疫組織化學(xué)染色成像系統(tǒng)、尼康共聚焦成像顯微鏡、定量 PCR儀等各類實驗儀器。臨床干細胞中心可以為本項目開展免疫細胞制備、研究提供良好的工作平臺。六、項目組成員的人才培養(yǎng)計劃：本研究課題在臨床方面可培養(yǎng)

28、一批對淋巴瘤免疫細胞治療尤其是CART治療具有豐富經(jīng)驗的臨床醫(yī)師，在臨床干細胞中心GMP實驗室可建立免疫細胞治療完整的操作流程及規(guī)范，為我院其他科室免疫細胞治療提供參考依據(jù)。本研究可培養(yǎng)博士研究生1-2人，碩士研究生2-3人。七、項目預(yù)期目標(biāo)1、項目解決的關(guān)鍵問題以及預(yù)期達到的水平：（限500字）（國際領(lǐng)先、國際先進、國內(nèi)領(lǐng)先或填補院內(nèi)空白）1、選擇難治復(fù)發(fā)B細胞淋巴瘤患者，進行第三代 CAR-T免疫細胞治療，評價 CAR-T免疫細胞治療的有效性及安全性，國際先進；2、在CAR-T免疫細胞治療前后檢測患者各種免疫細胞及細胞因子，評價這些指標(biāo)在預(yù)測細胞因子風(fēng)暴（CRS）嚴(yán)重程度中的作用，國際先進；3、建立常規(guī)CTL、DC+CTL等細胞治療及細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程，國內(nèi)領(lǐng)先；4、建立我院免疫細胞治療平臺，規(guī)范血液科免疫細胞治療流程，國內(nèi)領(lǐng)先。2、社會效益（限500字）