植物細胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物制備

1、植物細胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物制備Chapter 5細胞工程細胞工程plant cells culture：指在離體條件下，將指在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養(yǎng)增殖獲得大量分離的植物細胞通過繼代培養(yǎng)增殖獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。細胞群體的一種技術(shù)。 植物細胞培養(yǎng)是在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上植物細胞培養(yǎng)是在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的一發(fā)展起來的，是生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的一種技術(shù)。種技術(shù)。 5.1 5.1 植物細胞培養(yǎng)及其特點植物細胞培養(yǎng)及其特點Chapter 5細胞工程細胞工程與微生物細胞相比，植物細胞：與微生物細胞相比，植物細胞： 平均直徑平均直徑 Large

2、r in 30-100 times Tend to occur in aggregates形成細胞團形成細胞團 Shear-sensitive易被剪切力損傷易被剪切力損傷 Slow growing生長慢，周期長生長慢，周期長 Easily contaminated易受微生物污染易受微生物污染 Light, oxygen, CO2 demandCharacteristics of plant cells cultureChapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.1、植物細胞培養(yǎng)基植物細胞培養(yǎng)基 無機鹽（大量、

3、微量）無機鹽（大量、微量） 碳源（蔗糖）碳源（蔗糖） 有機氮源（水解酪蛋白）有機氮源（水解酪蛋白） 有機酸、維生素有機酸、維生素 植物生長激素植物生長激素等等5.2 5.2 植物細胞培養(yǎng)技術(shù)植物細胞培養(yǎng)技術(shù)29Chapter 5細胞工程細胞工程2.1 Single cell separation酶解方法：纖維素酶和果膠酸酶 水解掉細胞壁愈傷組織誘導(dǎo)法：(常用)2、植物單細胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)、植物單細胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)Chapter 5細胞工程細胞工程由愈傷組織分離單細胞步驟步驟： 莖段1） 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；2） 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織松散性；Chapter 5細胞工程

4、細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.由愈傷組織分離單細胞步驟3）將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物 優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。懸浮振蕩培養(yǎng) 4）振動或酶解處理，獲得單細胞。Chapter 5細胞工程細胞工程:用一塊活躍生長用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個的愈傷組織來看護單個細胞，并使其持續(xù)分裂細胞，并使其持續(xù)分裂和增殖的培養(yǎng)方法。這和增殖的培養(yǎng)方法。這個愈傷組織塊稱為看護個愈傷組織塊稱為看護 愈傷組織。愈傷組織。

5、方法：接種于濾紙上培養(yǎng)方法：接種于濾紙上培養(yǎng)(1) Nursing culture2.2 植物單細胞小規(guī)模培養(yǎng)植物單細胞小規(guī)模培養(yǎng)注：注：離體單細胞在直接培養(yǎng)技術(shù)下不分離體單細胞在直接培養(yǎng)技術(shù)下不分裂，看護培養(yǎng)下則分裂裂，看護培養(yǎng)下則分裂 Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division.細胞工程細胞工程（在兩層細胞之間放置兩層濾紙）(2) 飼養(yǎng)層培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng)：指用飼養(yǎng)層培養(yǎng)：指用X射線等處理過的無活性或分裂很慢的射線等處理過的無活性或分裂很慢的細胞來飼養(yǎng)需要培養(yǎng)的植物細

6、胞。具體方法：細胞來飼養(yǎng)需要培養(yǎng)的植物細胞。具體方法：Chapter 5Chapter 5細胞工程細胞工程 將飼養(yǎng)細胞與需要培養(yǎng)細胞共混合于培養(yǎng)基中將飼養(yǎng)細胞與需要培養(yǎng)細胞共混合于培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)將飼養(yǎng)細胞放于下層，培養(yǎng)細胞置于上層培養(yǎng)將飼養(yǎng)細胞放于下層，培養(yǎng)細胞置于上層培養(yǎng)二者細胞共培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中二者細胞共培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中（2）飼養(yǎng)層培養(yǎng)）飼養(yǎng)層培養(yǎng)（3）液體淺層靜置培養(yǎng)）液體淺層靜置培養(yǎng) 將一定密度的懸浮細胞接種在三角瓶中封口靜將一定密度的懸浮細胞接種在三角瓶中封口靜置培養(yǎng)。置培養(yǎng)。Chapter 5細胞工程細胞工程體積選擇法：體積選擇法：用大、小孔徑篩網(wǎng)過濾、收集單用大、小孔徑篩網(wǎng)

7、過濾、收集單 細胞。細胞。冷處理法冷處理法：4低溫下處理幾天使細胞同步化低溫下處理幾天使細胞同步化后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。饑餓法：饑餓法：控制營養(yǎng)液濃度，通過饑餓使細胞達控制營養(yǎng)液濃度，通過饑餓使細胞達到同步化，再添加營養(yǎng)液培養(yǎng)。到同步化，再添加營養(yǎng)液培養(yǎng)。抑制法：抑制法：使用抑制劑如尿苷、使用抑制劑如尿苷、5-5-氟脫氧尿苷、氟脫氧尿苷、秋水仙素等使細胞達到同步化。秋水仙素等使細胞達到同步化。（4）細胞同步化培養(yǎng)）細胞同步化培養(yǎng)細胞系細胞系(Cell line)：是由原：是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的

8、不得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。均一的細胞群體。細胞株細胞株(Cell strain)：是指從：是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的細一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。再由原細胞株進一步分細胞增殖形成的細胞群。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株亞株(Substrain)。2.3 細胞系與細胞株細胞系與細胞株 細胞株工業(yè)化生產(chǎn)需滿足條件細胞株工業(yè)化生產(chǎn)需滿足條件（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。分散性好，適合大

9、規(guī)模懸浮培養(yǎng)。（2）均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致。均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致。（3）生長速度快，培養(yǎng)周期短，不易染菌。）生長速度快，培養(yǎng)周期短，不易染菌。（4）目標產(chǎn)物含量高，容易分離提取。）目標產(chǎn)物含量高，容易分離提取。（5）細胞遺傳穩(wěn)定。）細胞遺傳穩(wěn)定。3.1 細胞株篩選細胞株篩選1.愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)：選用植物的目標化合物高產(chǎn)部位作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。愈傷組織形成后，進行繼代培養(yǎng)。2.單細胞分離：選取生長快速而疏松的愈傷組織，通過固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，挑選生長快速的細胞。3.細胞無性系的分離：轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，從中選擇分散性好、生長速度快的細胞。4.細胞株篩選：

10、檢測目標產(chǎn)物含量，從（3）中選擇目標產(chǎn)物含量高的細胞株。5.性能評價：進行較大規(guī)模培養(yǎng)，考察細胞生長與目標產(chǎn)物合成的穩(wěn)定性。6.細胞株獲得：得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株，保種。（1）一般步驟：）一般步驟：（2）細胞株定向富集馴化）細胞株定向富集馴化激素自養(yǎng)型細胞株的篩選馴化：激素自養(yǎng)型細胞株的篩選馴化： 將愈傷組織或分離到的細胞接種在將愈傷組織或分離到的細胞接種在不含生長素、不含生長素、分裂素的繼代培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，挑選生長分裂素的繼代培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，挑選生長好的細胞進行反復(fù)繼代培養(yǎng)馴化，可以獲得激素好的細胞進行反復(fù)繼代培養(yǎng)馴化，可以獲得激素自養(yǎng)型細胞。自養(yǎng)型細胞。耐受高劑量有毒物質(zhì)細

11、胞株的篩選馴化：耐受高劑量有毒物質(zhì)細胞株的篩選馴化： 將愈傷組織或分離到的細胞接種在將愈傷組織或分離到的細胞接種在含高濃度的乙含高濃度的乙酸鹽、苯甲酸鈉等可能對細胞產(chǎn)生毒害的化合物的培酸鹽、苯甲酸鈉等可能對細胞產(chǎn)生毒害的化合物的培養(yǎng)基中反復(fù)繼代培養(yǎng)訓(xùn)化，不斷提高這些成分含量，養(yǎng)基中反復(fù)繼代培養(yǎng)訓(xùn)化，不斷提高這些成分含量，可以獲得耐受高劑量有毒物質(zhì)細胞株。可以獲得耐受高劑量有毒物質(zhì)細胞株。（3）人工誘變篩選細胞株）人工誘變篩選細胞株懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)： 誘變劑處理后，根據(jù)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞生長較誘變劑處理后，根據(jù)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞生長較快、細胞群體比較均勻的特點進行篩選快、細胞群體比較均

12、勻的特點進行篩選。愈傷組織系統(tǒng)：愈傷組織系統(tǒng)：在前面篩選的基礎(chǔ)上，用誘變劑篩選，系統(tǒng)包括在前面篩選的基礎(chǔ)上，用誘變劑篩選，系統(tǒng)包括： 對愈傷組織誘變處理后，再通過選擇壓進行篩選。對愈傷組織誘變處理后，再通過選擇壓進行篩選。原生質(zhì)體系統(tǒng)：原生質(zhì)體系統(tǒng)： 裸露的原生體容易進行誘變和篩選。裸露的原生體容易進行誘變和篩選。繼代培養(yǎng)保存法：繼代培養(yǎng)保存法： 將懸浮培養(yǎng)細胞每隔將懸浮培養(yǎng)細胞每隔1-2周進行繼代培養(yǎng)保存周進行繼代培養(yǎng)保存。低溫保存法：低溫保存法： 5-10下培養(yǎng)，但每隔下培養(yǎng)，但每隔1010天左右更換一次培養(yǎng)液天左右更換一次培養(yǎng)液。冰凍保存法：冰凍保存法： -20 或液氮下保存?；蛞旱卤?/p>

13、存。3.2 細胞株保存細胞株保存Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved. 懸浮培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)：將離體的植物細胞接種在液體培養(yǎng)將離體的植物細胞接種在液體培養(yǎng)基中，保持良好分散狀態(tài)下的培養(yǎng)?；?，保持良好分散狀態(tài)下的培養(yǎng)。 特點：特點：1）增加細胞與培養(yǎng)液的接觸，促進營養(yǎng)吸收和）增加細胞與培養(yǎng)液的接觸，促進營養(yǎng)吸收和氣體的良好傳遞；氣體的良好傳遞；2）細胞生長快，能大量提供比較均勻的細胞；）細胞生長快，能大量提供比較均勻的細胞； 3）容易實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)。）容易實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)。2.4 植物細胞大規(guī)

14、模懸浮培養(yǎng)植物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng) Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.Steps of cell suspension cultureChapter 5細胞工程細胞工程1延遲期延遲期3直線期直線期 延遲期：適應(yīng)新培養(yǎng)基環(huán)延遲期：適應(yīng)新培養(yǎng)基環(huán)境，很少分裂；境，很少分裂； 對數(shù)期：細胞開始分裂，對數(shù)期：細胞開始分裂，數(shù)目緩慢增加；數(shù)目緩慢增加； 直線期：細胞分裂旺盛，直線期：細胞分裂旺盛，數(shù)目快速增加；數(shù)目快速增加； 減緩期：細胞因營養(yǎng)消減緩期：細胞因營養(yǎng)消耗、老化，分裂速度減慢；耗、老化，分裂速度減

15、慢； 平臺期：死亡與生成細平臺期：死亡與生成細胞數(shù)目平衡，凈增長為零；胞數(shù)目平衡，凈增長為零； 衰亡期：細胞死亡速度衰亡期：細胞死亡速度加快，細胞自溶、死亡。加快，細胞自溶、死亡。Growth patterns in suspension cell culture2對數(shù)生長期對數(shù)生長期4 減緩期減緩期6 衰亡期衰亡期5 平臺期平臺期Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved. 懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器要求：懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器要求： 良好的良好的O O2 2傳遞、液體流動性和低的剪切力。傳遞、液體流動性和低的剪切力

16、。 按攪拌方式分為：機械式和氣動式按攪拌方式分為：機械式和氣動式（1）機械攪拌式機械攪拌式生物反應(yīng)器：生物反應(yīng)器： 動力：利用攪拌器使懸液產(chǎn)生徑向和軸向流動；動力：利用攪拌器使懸液產(chǎn)生徑向和軸向流動； 擋板擋板: :將渦流由徑向改為軸向流動，增加將渦流由徑向改為軸向流動，增加O O2 2溶解。溶解。 優(yōu)點：攪拌充分，供優(yōu)點：攪拌充分，供O O2 2、混合效果好；、混合效果好； 缺點：剪切力對細胞損傷大。缺點：剪切力對細胞損傷大。2.4.1 植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器Chapter 5細胞工程細胞工程氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器優(yōu)點：剪切力小對細胞損傷少，結(jié)構(gòu)簡單，耗能

17、低。優(yōu)點：剪切力小對細胞損傷少，結(jié)構(gòu)簡單，耗能低。缺點：在低氣速和后期細胞密度高時，混合效果不缺點：在低氣速和后期細胞密度高時，混合效果不良。良。 包括：包括：（2）氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器： 動力：氣量差在底部產(chǎn)生的壓力；動力：氣量差在底部產(chǎn)生的壓力； 類型類型: :內(nèi)環(huán)流與外環(huán)流。特點：混合較均一內(nèi)環(huán)流與外環(huán)流。特點：混合較均一（3）鼓泡式生物反應(yīng)器：）鼓泡式生物反應(yīng)器： 動力：底部噴出的氣體沖力，液體呈無序湍流；動力：底部噴出的氣體沖力，液體呈無序湍流；特點特點: :適合剪切力敏感的細胞；缺點：混合效率低。適合剪切力敏感的細胞；缺點：混合效率低。2.4.1 植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物

18、反應(yīng)器植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器Chapter 5細胞工程細胞工程Airlift systemsChapter 5細胞工程細胞工程2.4.2 植物細胞培養(yǎng)方式植物細胞培養(yǎng)方式（1 1）分批培養(yǎng)（）分批培養(yǎng)（Batch culture） 特點：一次性添加和收獲培養(yǎng)液體，期間不更換。特點：一次性添加和收獲培養(yǎng)液體，期間不更換。 缺點：培養(yǎng)后期營養(yǎng)不足，產(chǎn)率降低；缺點：培養(yǎng)后期營養(yǎng)不足，產(chǎn)率降低；（2 2）流加式培養(yǎng)：）流加式培養(yǎng)： 特點：間歇或連續(xù)補加一種或多種營養(yǎng)特點：間歇或連續(xù)補加一種或多種營養(yǎng)（細胞初細胞初始接種的培養(yǎng)液體積一般為終體積的始接種的培養(yǎng)液體積一般為終體積的1/21/3） ；

19、整個培養(yǎng)過程沒有培養(yǎng)液流出或細胞產(chǎn)品的收集。整個培養(yǎng)過程沒有培養(yǎng)液流出或細胞產(chǎn)品的收集。Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.（3）半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng)（半連續(xù)式培養(yǎng)（Semi-continuous culture）又稱）又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細胞增長和產(chǎn)為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間從中取出部分培物形成過程中，每間隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或者細胞，剩余的細胞作為種子，再用新的養(yǎng)液或者細胞，剩余的細胞作為種子，再用新的培養(yǎng)液補足

20、到原有體積，使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體培養(yǎng)液補足到原有體積，使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變積不變。 每次稀釋培養(yǎng)體積的每次稀釋培養(yǎng)體積的1/2-3/4，以維持細胞的指數(shù)，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)。生長狀態(tài)。Chapter 5細胞工程細胞工程（4）連續(xù)培養(yǎng)（）連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）含義：含義：指在培養(yǎng)過程中，指在培養(yǎng)過程中，以一定速度不斷添加營養(yǎng)液，以一定速度不斷添加營養(yǎng)液，同時以同樣速度排出同時以同樣速度排出培養(yǎng)物，維持恒定體積的培培養(yǎng)物，維持恒定體積的培養(yǎng)。養(yǎng)。特點：特點：（1）新鮮培養(yǎng)基不）新鮮培養(yǎng)基不斷加入，斷加入，保證了養(yǎng)分的充分供應(yīng)；保證了養(yǎng)分的充分供應(yīng)；（2）可使細

21、胞保持在增殖）可使細胞保持在增殖旺盛的對數(shù)生長期中；旺盛的對數(shù)生長期中；（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物Chapter 5細胞工程細胞工程2.5 植物細胞固定化培養(yǎng)植物細胞固定化培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：（1 1）細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產(chǎn)物的細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產(chǎn)物的積累。積累。 （2 2）利于保持培養(yǎng)液液體性質(zhì)，利于傳質(zhì)；利于保持培養(yǎng)液液體性質(zhì)，利于傳質(zhì)；（3 3）細胞經(jīng)包埋后使所受的剪切力損傷減小細胞經(jīng)包埋后使所受的剪切力損傷減?。唬? 4）利于進行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化（利于進行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化（細胞生長與

22、產(chǎn)物細胞生長與產(chǎn)物合成分成兩個階段，次級代謝產(chǎn)物合成在生長停止后才大量合成合成分成兩個階段，次級代謝產(chǎn)物合成在生長停止后才大量合成）。Chapter 5細胞工程細胞工程 植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。1、海藻酸鹽、海藻酸鹽固定化固定化在在Ca2+離子等多離子等多價陽離子的存價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和在下，海藻酸鹽的羧基和Ca2+之間以離子鍵形成不溶于水的之間以離子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣，從而在細胞海藻酸鈣，從而在細胞表面形表面形

23、成凝膠。成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將等螯合劑處理將Ca2+離離子除去，又能使膠體子除去，又能使膠體溶解釋放溶解釋放出細胞。出細胞。無菌空氣入口無菌空氣入口玻璃瓶玻璃瓶細胞和褐藻酸鈉混合液細胞和褐藻酸鈉混合液空氣出口空氣出口形成膠體顆粒的噴射口形成膠體顆粒的噴射口隔濾板隔濾板裝有裝有CaCl2溶液溶液的燒瓶的燒瓶2.5.1 植物細胞固定化方法海藻酸鹽固定化細胞步驟海藻酸鹽固定化細胞步驟Chapter 5細胞工程細胞工程 常用方法：常用方法：（1 1）滴入法：）滴入法：將細胞懸浮液與滅菌的含將細胞懸浮液與滅菌的含NaClNaCl的卡拉膠溶液混的卡拉膠溶

24、液混勻，然后滴入含中勻，然后滴入含中KClKCl的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過濾、的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過濾、清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2 2）模鑄法：）模鑄法：將細胞將細胞- -卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒?？ɡz溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。（3 3）兩相法：）兩相法：將細胞將細胞- -卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。心除去油相和大部分溶液。2 2、卡拉膠固定化、卡

25、拉膠固定化Chapter 5細胞工程細胞工程 瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)固定化：固定化：（1 1）凝塊法：）凝塊法：將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結(jié)包埋細胞后，將凝塊擠進無菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小結(jié)包埋細胞后，將凝塊擠進無菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2 2）模鑄法：同卡拉膠法）模鑄法：同卡拉膠法（3 3）兩相法：同卡拉膠法）兩相法：同卡拉膠法 優(yōu)點：與海藻酸鹽、優(yōu)點：與海藻酸鹽、卡拉卡拉膠等固定化方法相比，不膠等固定化方法相比，不需要其它離需要其它離子來保證膠的穩(wěn)

26、定性。子來保證膠的穩(wěn)定性。 不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。3 3、瓊脂糖、瓊脂糖(Agarose)固定化固定化Chapter 5細胞工程細胞工程 固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：（1 1）熒光染色觀察法：）熒光染色觀察法：根據(jù)活細胞對根據(jù)活細胞對FDAFDA（二乙酸熒光素）（二乙酸熒光素）黃綠色黃綠色熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。（2 2）呼吸強度測定：）呼吸強度測定： 用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度判斷存活率。用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度判

27、斷存活率。（3 3）細胞分解和生長速率的測定：）細胞分解和生長速率的測定： 通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。2.5.2 2.5.2 固定化細胞活力測定固定化細胞活力測定Chapter 5細胞工程細胞工程常用的反應(yīng)系統(tǒng)有常用的反應(yīng)系統(tǒng)有2 2種：種： 流化床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器(Fluid-bed bioreactor)：通過通通過通入液體或氣體使固定化細胞懸浮于反應(yīng)器中；入液體或氣體使固定化細胞懸浮于反應(yīng)器中；優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質(zhì)效率高；缺點：剪切力優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質(zhì)效率高；缺點：剪切力或碰撞會破壞固定化細胞。

28、或碰撞會破壞固定化細胞。2.5.3 植物細胞固定化生物反應(yīng)器植物細胞固定化生物反應(yīng)器細胞固定在支持物（如篩網(wǎng)）的內(nèi)部細胞固定在支持物（如篩網(wǎng)）的內(nèi)部或表面，細胞固定不動，培養(yǎng)物流體或表面，細胞固定不動，培養(yǎng)物流體按一定方向（從下向上）從反應(yīng)器中按一定方向（從下向上）從反應(yīng)器中流過實現(xiàn)混合和傳質(zhì)。流過實現(xiàn)混合和傳質(zhì)。優(yōu)點：單位體積細胞的容量大。優(yōu)點：單位體積細胞的容量大。缺點：缺點：混合效率低、細胞顆粒大，混合效率低、細胞顆粒大，易造成傳質(zhì)困難；易造成傳質(zhì)困難；固定床顆?；蚬潭ù差w?；蛑С治锼槠瑫枞后w的流動；支持物碎片會阻塞液體的流動；固定材料易變形，阻塞篩網(wǎng)。固定材料易變形，阻塞篩網(wǎng)。細胞

29、固定化生物反應(yīng)器 填充床生物反應(yīng)器填充床生物反應(yīng)器(Pipe-conebio-filter reactor)兩相培養(yǎng)技術(shù)：指在細胞培養(yǎng)體系中加入有機溶劑（如兩相培養(yǎng)技術(shù)：指在細胞培養(yǎng)體系中加入有機溶劑（如豆油、石蠟油）或吸附性的多聚化合物，而細胞在水相豆油、石蠟油）或吸附性的多聚化合物，而細胞在水相生長，合成的次級代謝產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)移到有機相，減少了生長，合成的次級代謝產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)移到有機相，減少了對產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高了產(chǎn)量，再通過對有機相對產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高了產(chǎn)量，再通過對有機相的不斷回收與循環(huán)利用，實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。的不斷回收與循環(huán)利用，實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。要求：要求：有機相對細胞無毒，不影響

30、細胞生產(chǎn)與產(chǎn)物合成；有機相對細胞無毒，不影響細胞生產(chǎn)與產(chǎn)物合成；產(chǎn)物易溶于有機相中；產(chǎn)物易溶于有機相中； 水相與有機相易分離；水相與有機相易分離；有機相或多聚化合物不能吸附培養(yǎng)基營養(yǎng)成份。有機相或多聚化合物不能吸附培養(yǎng)基營養(yǎng)成份。2.6 植物細胞兩相培養(yǎng)植物細胞兩相培養(yǎng)植物天然產(chǎn)物包括初級和次級代謝產(chǎn)物：植物天然產(chǎn)物包括初級和次級代謝產(chǎn)物： 初級代謝產(chǎn)物（初級代謝產(chǎn)物（Primary metabolites） 是通過初級代謝是通過初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。在不同種類的細胞中，初級代謝多糖

31、、脂類、維生素等。在不同種類的細胞中，初級代謝產(chǎn)物的種類基本相同。任何一種初級產(chǎn)物的合成發(fā)生障礙產(chǎn)物的種類基本相同。任何一種初級產(chǎn)物的合成發(fā)生障礙都會影響細胞正常的生命活動，甚至導(dǎo)致死亡。都會影響細胞正常的生命活動，甚至導(dǎo)致死亡。 次級代謝產(chǎn)物（次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites） 是通過次級代是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產(chǎn)物例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。大多具有生物活性，

32、因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。5.3 植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物優(yōu)點：優(yōu)點： 減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限制；減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限制； 可以排除病菌和害蟲的影響可以排除病菌和害蟲的影響( (密閉無菌操作密閉無菌操作) )；可通過選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝可通過選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝物產(chǎn)量；物產(chǎn)量；能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。 由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物提取天然的次級代謝產(chǎn)物途徑很難滿足人類需求，提取天然的次級代謝產(chǎn)物途徑很難滿足人類

33、需求，而利用植物細胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)而利用植物細胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物成為最有效途徑。物成為最有效途徑。Chapter 5細胞工程細胞工程1 1、藥用代謝產(chǎn)物、藥用代謝產(chǎn)物 這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。 例如，紫杉醇（例如，紫杉醇（TaxolTaxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種二萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。一種二萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)

34、物需求：僅美國每年就有需求：僅美國每年就有50 000名婦女患卵巢名婦女患卵巢癌，每年需約癌，每年需約24kg紫杉醇；還有約紫杉醇；還有約40 000名名婦女死于乳腺癌，年需求量將增至婦女死于乳腺癌，年需求量將增至100kg。全世界每年需要全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。癌癥患者需求。 生產(chǎn)生產(chǎn)1 kg紫杉醇需要砍伐紫杉醇需要砍伐60年生大樹年生大樹3000-4000棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量最高。若光從樹皮中提取紫杉，每年需砍伐最高。若光從樹皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。萬棵左右的大樹。2 2、天

35、然食品和食品添加劑、天然食品和食品添加劑 如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學合成如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學合成色素和甜味劑越來越受到擔心和嚴格限制。色素和甜味劑越來越受到擔心和嚴格限制。3 3、殺蟲劑和殺菌劑、殺蟲劑和殺菌劑 如利用萬壽菊細胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚藤酮殺蟲劑。如利用萬壽菊細胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚藤酮殺蟲劑。4 4、飼料、精細化工等產(chǎn)品、飼料、精細化工等產(chǎn)品 如用培養(yǎng)的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可如用培養(yǎng)的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。充足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。 精細化工產(chǎn)品種類繁多（精細化工產(chǎn)品種類繁

36、多（3636類），附加值高，具有功能性類），附加值高，具有功能性或最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、或最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產(chǎn)品。金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產(chǎn)品。通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物 聚酮途徑：聚酮類聚酮途徑：聚酮類化合物包括抗生素、化合物包括抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤免疫抑制劑、抗腫瘤藥物等。藥物等。 莽草酸途徑：類黃莽草酸途徑：類黃酮，生物堿包括喹啉酮，生物堿包括喹啉類、異喹啉類、吡咯類、異

37、喹啉類、吡咯啶類、烏頭類、吲哚啶類、烏頭類、吲哚類、大環(huán)類等。類、大環(huán)類等。 甲瓦龍（戊二羥）甲瓦龍（戊二羥）酸途徑酸途徑：主要是萜類：主要是萜類、甾體類化合物。甾體類化合物。3.1 植物次級代謝產(chǎn)物的合成途徑植物次級代謝產(chǎn)物的合成途徑Chapter 5細胞工程細胞工程（1）細胞株）細胞株 植物不同部位的細胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是植物不同部位的細胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，所以不同的，所以在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時，代謝產(chǎn)物時，必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就，也就是應(yīng)該考慮到不同部位來源細胞的特性。是應(yīng)該考慮到不同部位

38、來源細胞的特性。 篩選出篩選出穩(wěn)定、高產(chǎn)、穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長速度快生長速度快的細胞株是細胞的細胞株是細胞大規(guī)模培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的前提。缺乏適合的細大規(guī)模培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的前提。缺乏適合的細胞株是目前許多代謝產(chǎn)物無法利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)胞株是目前許多代謝產(chǎn)物無法利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的主要限制之一。的主要限制之一。1、細胞遺傳特性、細胞遺傳特性3.2 植物次級代謝產(chǎn)物合成的影響因素植物次級代謝產(chǎn)物合成的影響因素Chapter 5細胞工程細胞工程 次級代謝產(chǎn)物的生物合成涉及多基因參與（基因次級代謝產(chǎn)物的生物合成涉及多基因參與（基因簇），機制非常復(fù)雜，不同于蛋白質(zhì)合成，影響因素簇），機制非常復(fù)雜，不同于蛋白質(zhì)合

39、成，影響因素非常多。非常多。 結(jié)合目標產(chǎn)物進行生物合成機制研究，揭示代謝結(jié)合目標產(chǎn)物進行生物合成機制研究，揭示代謝途徑及誘導(dǎo)合成機制是細胞培養(yǎng)的重要生物學問途徑及誘導(dǎo)合成機制是細胞培養(yǎng)的重要生物學問題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。（2 2）生物合成機制）生物合成機制植物次級代謝產(chǎn)物合成的影響因素植物次級代謝產(chǎn)物合成的影響因素Chapter 5細胞工程細胞工程 化學因素：化學因素： 主要包括培養(yǎng)基、前體和調(diào)節(jié)因子等。主要包括培養(yǎng)基、前體和調(diào)節(jié)因子等。（1）培養(yǎng)基：）培養(yǎng)基：一方面是保證植物細胞生物量的增長；一方面是保證植物細胞生物量的增長；另外一方

40、面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產(chǎn)物。另外一方面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產(chǎn)物。 普通的培養(yǎng)基一般僅能滿足第一方面的需要，對普通的培養(yǎng)基一般僅能滿足第一方面的需要，對于第二方面的需求，必須針對具體的培養(yǎng)對象和目的，于第二方面的需求，必須針對具體的培養(yǎng)對象和目的，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而保證最大限度地對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而保證最大限度地積聚目積聚目標產(chǎn)物。標產(chǎn)物。2、培養(yǎng)條件的影響、培養(yǎng)條件的影響Chapter 5細胞工程細胞工程 前體前體指在生物合成反應(yīng)的中間過程中某一階段前的指在生物合成反應(yīng)的中間過程中某一階段前的物質(zhì)，都可以說是該階段物質(zhì)的前體物質(zhì)。物質(zhì)，都可以說是該階段物質(zhì)的前體物

41、質(zhì)。 如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會有助于合成該代如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會有助于合成該代謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。但同一前體物，在細胞不同生謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。但同一前體物，在細胞不同生長時期加入，對次級代謝產(chǎn)物合成所起作用也不同，甚長時期加入，對次級代謝產(chǎn)物合成所起作用也不同，甚至起抑制作用。例如見至起抑制作用。例如見P59P59（2 2）前體（）前體（precursor precursor ）（3 3）調(diào)節(jié)因子：是指那些通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于細）調(diào)節(jié)因子：是指那些通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于細胞次生代謝相關(guān)的基因表達，改變細胞次生代謝相關(guān)酶胞次生代謝相關(guān)的基因表達，改變細胞次生代謝相關(guān)酶活力

42、，最終使細胞次生代謝水平發(fā)生改變的生長調(diào)節(jié)物活力，最終使細胞次生代謝水平發(fā)生改變的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度影響細胞生長與分化，影質(zhì)。生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度影響細胞生長與分化，影響次生代謝產(chǎn)物的合成水平。響次生代謝產(chǎn)物的合成水平。Chapter 5細胞工程細胞工程 物理因素物理因素 主要包括：光照、主要包括：光照、 pH值值、流體、氣體、流體、氣體等。等。（1）光照：光照時間長短、光質(zhì)、光強等都會對代謝產(chǎn)物）光照：光照時間長短、光質(zhì)、光強等都會對代謝產(chǎn)物合成和積聚產(chǎn)生作用。光對許多酶有誘導(dǎo)或抑制作用。例合成和積聚產(chǎn)生作用。光對許多酶有誘導(dǎo)或抑制作用。例如，黃酮類物質(zhì)的積累是需光照的，特別是紫外光。如，黃酮類物質(zhì)的積累是需光照的，特別是紫外光。（2）pHpH值：會影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度、酶的活性，值：會影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度、酶的活性，從而影響細胞代謝產(chǎn)物合成。植物細胞液體培養(yǎng)的從而影響細胞代謝產(chǎn)物合成。植物細胞液體培養(yǎng)的 pH pH 變變化最佳在之