實驗一 蛋白質(zhì)的定量測定

1、實驗一 蛋白質(zhì)的定量測定Folin-酚法一、目的要求（1）學習Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；（2）制備標準曲線，測定未知樣品中蛋白質(zhì)含量。二、實驗原理（一）蛋白質(zhì)定量測定的方法目前蛋白質(zhì)含量測定有兩類方法，一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)，如折射率，比重，紫外吸收等測定得知；另一類是利用化學方法測定蛋白質(zhì)含量，如微量克氏定氮，雙縮脲反應(yīng)，F(xiàn)olin酚試劑法（Lowry法）。這兩類方法各有優(yōu)缺點，選用何種方法測定蛋白質(zhì)含量，可根據(jù)實驗要求和實驗條件進行選擇。（二）Folin酚法原理 1. 原理Folin酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)

2、中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可測定范圍是25250ug蛋白質(zhì) 2. 優(yōu)缺點 目前實驗室多用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點是：操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可以穩(wěn)定幾個小時。缺點是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測定時應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗消除。此法是在Folin酚法的基礎(chǔ)上引

3、入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin酚反應(yīng)。此外，所測的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對顯色無影響，這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉氫氧化鈉濃度12倍，這樣即

4、可糾正顯色后色淺的弊病。三、試劑和器材（一）試劑Folin酚試劑:試劑甲：1) 4%碳酸鈉溶液2) 0.2mol/L氫氧化鈉溶液3) 1%硫酸銅溶液4) 2%酒石酸鉀鈉溶液。臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。試劑乙：稱鎢酸鈉（Na2WO22H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）25g置2000ml磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700ml，85%磷酸50ml和濃硫酸100ml。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)

5、顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴。在通風櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000ml，過濾即成Folin酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復原色仍可繼續(xù)使用。試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標準氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當溶液顏色由紅紫紅紫灰墨綠時即為滴定終點。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當于1mol/L酸度應(yīng)用。（二）標準和待測蛋白質(zhì)溶液1. 標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清白蛋

6、白或酪蛋白，預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成150ug/ml蛋白溶液2. 待測蛋白質(zhì)溶液人血清，使用前稀釋100倍。（三）器材試管及試管架；0.5,1,及5ml移液管，恒溫水浴，722型分光光度計。四、操作方法（一）制作標準曲線取14支試管，分兩組按下表平行操作： 試管編號試劑處理1234567標準蛋白質(zhì)溶液/ml00.10.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.00.90.80.60.40.20Folin-酚甲試劑/ml5.05.05.05.05.05.05.0搖勻，于2025放置10minFolin-酚乙試劑/ml0.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，

7、30（或室溫2025）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在640nm處比色640       注：由于這種顯色化合物組成尚未確定，它在可見光紅光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同書籍選用不同的波長，有選用500或540nm的，有選用660,700或750nm的。選用較高波長，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收。本實驗選用640nm。繪制標準曲線：以A640值為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。（二）未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定取4支試管，分2組，按下表平行操作：試管編號試劑處理空白管×2樣品管×2血清稀釋液/ml

8、00.2蒸餾水/ml1.00.8Folin酚甲試劑/ml5.05.0搖勻，于2025放置10minFolin酚乙試劑/ml0.50.5迅速搖勻，30（或室溫2025）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在640nm處比色640 （三）計算五、注意事項(1) Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而Folin酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白 質(zhì)作用生成堿性的銅蛋白質(zhì)溶液。當Folin酚乙試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前。(2) 血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標準曲線范圍之內(nèi)，若超過此范圍則需將血清酌情稀釋。實驗二 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

9、(SDS-PAGE)一、實驗目的1. 學習和掌握SDSPAGE垂直板電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理和方法。2. 掌握SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的操作方法。二、實驗原理  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性和定量分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和分子量測定。SDS-PAGE 是在要進行電泳分析的樣品中加入含陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）和-巰基乙醇的樣品處理液，SDS可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二、三級結(jié)構(gòu)；-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。電泳樣品加入樣品處理液后，置沸水浴中煮沸35 min，使SDS與蛋

10、白質(zhì)充分結(jié)合，引起蛋白質(zhì)變性、解聚、帶上大量同種負電荷、形成棒狀結(jié)構(gòu)。樣品處理液中通常加入溴酚藍染料作為電泳指示劑，用于控制電泳過程（溴酚藍指示劑為一種小分子物質(zhì)，可以自由通過凝膠孔徑，用它可顯示電泳的前沿位置）。此外，樣品處理液中還可加入適量蔗糖或甘油以增大溶液密度，便于加樣時樣品溶液沉入樣品凹槽底部，防止加樣時產(chǎn)生對流擴散。制備凝膠時首先要根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當?shù)姆蛛x膠濃度，一般分離大分子量蛋白質(zhì)需要使用較低濃度的分離膠；分離小分子量蛋白質(zhì)需要使用較高濃度的分離膠。當分離膠聚合以后，通常要在凝膠上面加上一層約1 cm厚的濃縮膠，并在濃縮膠上插入樣品梳，形成上樣凹槽。濃縮膠的pH值較低

11、（通常pH6.8）、濃度較低（通常為35），形成的孔徑大，各種蛋白質(zhì)都可以自由通過，常用于樣品進入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后通電即可電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)即連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)中存在著三種不連續(xù)性即pH不連續(xù)、凝膠不連續(xù)、溶液離子組成不連續(xù)。樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)容易通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)各自分子量的大小而被分離。 三、試劑與器材1器材夾心

12、式垂直板電泳槽，凝膠模（135×100×1.5mm）（北京六一儀器廠）直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V，電流50100mA）吸量管（1,5,10 ml） 燒杯（25,50,100 ml）細長頭的滴管 1ml注射器及6號長針頭微量注射器（10l或50l） 水泵或油泵真空干燥器 培養(yǎng)皿（直徑120mm）2試劑（1）標準蛋白質(zhì)目前國內(nèi)外均有廠商生產(chǎn)低分子量及高分子量標準蛋白質(zhì)成套試劑盒，用于SD S-PAGE測定未知蛋白質(zhì)分子量。高分子量標準蛋白試劑盒（Pharmacia公司產(chǎn)品，表中2-1）。表2-1 5種標準蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱Mr來 源甲狀腺球蛋白鐵蛋白過氧化氫酶乳酸脫氫酶血清

13、清蛋白669 000440 000232 000140 00067 000豬甲狀腺馬 肺牛 肝牛 心牛 血 清注：按說明書要求處理低分子量標準蛋白試劑盒，中國科學院上海生物化學研究所東風生化試劑廠生產(chǎn)（表2-2）。表2-2 5種標準蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱Mr磷酸化酶B牛血清蛋白肌動蛋白磷酸酐酶煙草花葉病毒外殼蛋白94 00067 00043 00030 00017 500自己配制低分子量或高分子量標準蛋白質(zhì)混合試劑。如買不到標準蛋白試劑盒時，可參考常用的標準蛋白質(zhì)及其分子量表。從中選擇35種蛋白質(zhì)，如馬心細胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25 000）、豬胃胃蛋白酶（Mr35

14、000）、雞卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白質(zhì)，按照每種蛋白0.51mg·ml-1樣品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標準液，也可配成混合蛋白質(zhì)標準液。 （2）不連續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑 10%（W/V）SDS溶液：稱5gSDS，加重蒸水至50ml，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4貯存。SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。 1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4貯存。 10%AP（W/V）：稱AP1g，加重蒸水至10ml。最好臨用前配制。 樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，40%蔗

15、糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.01mol·l-1 pH8.0 Tris-HCl緩沖液。 先配制0.05mol·l-1 pH8.0 Tris-HCl緩沖液：稱Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入約3ml 1mol·l-1 HCl，調(diào)pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。 按表2-3配制樣品溶解液。 表2-3不連續(xù)體系樣品溶解液配制SDS巰基乙醇溴酚藍蔗糖0.05mol·L-1Tris-HCl加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml2mg4g2ml10ml*如樣品為液體，則應(yīng)用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。 凝膠貯液 30%分

16、離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。 10%濃縮膠貯液：稱Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。 凝膠緩沖液 分離膠緩沖液（3.0mol·l-1pH8.9 Tris-HCl緩沖液）：稱Tris 36.3g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol·l-1pHCl約48ml，調(diào)pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4貯存。 濃縮膠緩沖液（0.5mol·L-1 pH6.7 Tris-HCl緩沖液）：稱Tris

17、6.0g，加少許重蒸水使其溶解，再加1mol·l-1 HCl約48ml調(diào)pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4貯存。 電極緩沖液四、操作步驟：（一）安裝夾心式垂直板電泳槽關(guān)心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏，其裝置如圖16-4。這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由1個 形硅膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：1、將長、短玻璃板分別插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接觸

18、灌膠面的玻璃。 2、將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。 3、將下貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。 4、豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡。 （二）配膠及凝膠板的制備 1配膠 根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS-PAGE有連續(xù)系統(tǒng)及不連續(xù)系統(tǒng)兩種，兩者間有不同的緩沖系統(tǒng)，因而有不同的配制方法，見表16-5和表16-6。 表16-5 SDS-不連續(xù)體系凝膠配制電極緩沖液為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS

19、。電極緩沖液為0.1mol·l-1pH7.2磷酸緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS。 2凝膠板的制備 （1）SDS-不連續(xù)體系凝膠板的制備 分離膠的制備：按表16-5配制20ml10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約34mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。 濃縮膠的制備：按表16-5配制10ml3%濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣

20、品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約30min后凝膠聚合，再放置2030min，使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。 （三）樣品的處理與加樣1樣品的處理根據(jù)分子量標準蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，如上海東風生化試劑廠生產(chǎn)的低分子量標準蛋白試劑盒，每一安瓿則需加入200l樣品溶解液，自己配制標準及未知樣品，按.51mg/1ml樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子（不要塞緊以免加熱迸出），在100沸水浴中保溫3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時不用，可入在20冰箱保存較長時間，使用前在100沸水中加熱3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。2、加樣一般每個凹形樣品槽內(nèi)，只加一個種樣品或已知分子量的混合標準蛋白質(zhì)，加樣體積要根據(jù)凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為1015l（即210g蛋白）。如樣品較稀，加樣體積可達100l。如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加