石蠟切片和HE染色詳細(xì)步驟

1、石蠟切片和HE染色詳細(xì)步驟石蠟切片和HE染色方法與步驟1(取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織 ( 或其他組織 ) 。切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mrK 5m佛2mm£ 10 mnrK 10 mnrK 2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2,3mm厚。注意事項(xiàng) :(1) 取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。(2) 切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。2( 固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定，固定 30,50min 。注意事項(xiàng) :(1) 一般固定液，都

2、以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。(2) 有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時(shí)就沒有作用了。(3) 固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的 2030倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2 次新液。(4) 材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。3. 脫水50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。每級(jí)0.5h

3、。注意事項(xiàng) :(1) 脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。(2) 在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。(3) 在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng)，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體。(4) 在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。 (5) 如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。(6) 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象4. 透明1/2 二甲苯 +1/2 無水乙醇 (2h) ? 純二甲苯 (1.5h) ? 純二甲苯 (1.5h) 。由于乙

4、醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。注意事項(xiàng)(1) 使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。(2) 更換每級(jí)透明劑，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。 3) 在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫(水，然后再透明。5. 浸蠟將處理的材料置于1/2石蠟+1/2二甲苯中，40?烘箱40min。再放入石 蠟？30min、石蠟？40min。透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等)，使石蠟滲透到組

5、織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在55-60?左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h 。注意事項(xiàng)(1) 盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度;(2) 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低;(3) 操作要迅速，力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。 6.包埋先提升恒溫箱的溫度至60?，換純蠟3 次，每次 1-2h ，用硬的電光紙、牛皮紙疊紙盒，置于45-60?的燙板上，倒入材料，擺放好材料，把標(biāo)簽 (正面向外置于底部) ，補(bǔ)足石蠟，倒好后輕輕的置于冷水盆中，注意底面要接觸盆中涼水，待石蠟全

6、部凝固后可取出晾干，也可在涼水盆中放置過夜。 7. 切片?將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。?將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。?搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。?調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15 度左右。?調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10 微米。?一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min 。?切成的蠟帶到20-30cm 長(zhǎng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。?用單

7、面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。 ? 切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石 蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。 8. 粘片將粘貼劑置簿玻片上，再取切片浮置粘片劑上，然后置烘片臺(tái)上，使切片展開燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時(shí)以記號(hào)筆在玻片上編號(hào)，放入溫箱中烘干，溫度30,40? 中過夜。10. 脫蠟和染色純二甲苯 (10-20min)? 純二甲苯 (5-10min) ， 1/2 二甲苯十 1/2 純酒精?100%酒精？95,酒精？85,酒精？70,酒精？50,酒精？自來水沖洗10s?切片放入蘇木精中染

8、色約 10-30min ? 用自來水流水沖洗約 15min 使切片顏色變藍(lán)。11. 分化和漂洗將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2 秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。12. 脫水 ?和復(fù)染切片入50%乙醇 ?70%乙醇 ?80%乙醇中各3-5min 。用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色1-3min 。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。13. 脫水 ?和透明將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min 。最后用吸水紙吸干多余的乙醇，將切片放入二甲苯?、 ?中各3-5min 。二