人心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備及定量檢測試劑盒的研制.docxVIP

1、,論著人心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備及定量檢測試劑盒的研制彭林峰，袁皓加，席仲興，張正雷，羅廣，潘憲云，路東，金紅燕，陳國懷（蘭州生物制品研究所有限夷任公司，甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046）摘要：目的利用抗心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白單抗，研制定鼠檢測心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）的EL1SA試劑盒。方法使用基因重組H-FABP免疫小鼠,以雜交瘤技術(shù)制備特異性抗H-FABP單抗，用這些單抗研制定量檢測H-FABP的EUSA試劑盒。結(jié)果篩選獲得2株穩(wěn)定分泌抗H-FABP單抗的雜交痛細(xì)胞株,研制了定量檢測H-FABP的EL1SA試劑盒，靈敏度達(dá)到0.2ng/mL,線性范圍0.4

2、-25nmL,r2=0.9967,回收率在97.2%-104.5%,精密度的變異系數(shù)（CV）W6.72%;應(yīng)用此試劑食檢測健康人血漿H-FABP,含量為1.878.50ng/mL。結(jié)論所研制的EUSA試劑盒有較好的靈敏度及特異性，可用于人血漿中H-FABP含雖的檢測。關(guān)鍵詞：心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白；單克隆抗體（單抗）；酶聯(lián)免疫分析中圖分類號(hào)：Q81文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-5673（2013）05-0023.3PreparationofmonoclonalantibodyagainstH-FABPanddevelopmentofaquantitativeELISAkitindetecti

3、onofH-FABPPENGLin-feng,YUANHao-jia,XIZhong-xing,ZHANGZheng-lei,LUOGuang,PANXian-yun,LUDong,JINHong-yan,CHENCuo-huai(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Lid.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou750046,China)Abstract：ObjectiveTopreparemonoclonalantibodyagainsthumanheart-type

4、fattyacidbindingprotein(H-FABP)andtoestablishaquantitaliveELISAKitindetectionofH-FABP.MethodsItwasbyimmunizationofmicewithrecombinantH-FABP,andcellfusionwasprocessedtoestablishhybridomacelllines,thespecificmonoclonalantibodiesagainstH-FABPwereprepared.ResultsThequantitativeELISAindetectionofH-FABPwa

5、sdevelopedbyusingthesemonoclonalantibodies.Thesensitivityofthisassayreachesto0.2ng/mL,andthelinearrangeisin0.5-32ng/rnLwithr2valueof0.9967andrecoveryratesarein97.2%-104.5%,theCVofprecisionislessthan6.72%.ItcanmeasureH-FABPlevelinhealthyhumanplasmainconcentration1.87-8.50ng/mL.ConclusionThedevelopedE

6、LISAkithasbettersensitivityandspecificity,whichcouldbeusedindetectionofH-FABPinhealthyhumanplasma.Keywords；Humanheart-typefattyacidbindingprolein(H-FABP);Monoclonalantibody(MeAb)；ELISA脂肪酸結(jié)合蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量為15000的小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體多種組織細(xì)胞的胞漿中，主要擔(dān)負(fù)著結(jié)合脂肪酸并調(diào)節(jié)其細(xì)胞內(nèi)代謝的功能，按照組織特異性不同可分為心肌型（HFABP）、小腸型（I-FABP）、肝臟型（L-FABP）、

7、脂肪細(xì)胞型（A-FABP）、腦細(xì)胞型（B-FABP）、腎臟型（KFABP）、骨骼肌型（S-FABP）、牛皮癬相關(guān)型（PA-FABP）及表皮型（E-FABP）9種亞型。H-FABP較收稿日期：2O13-O7-Q5;修回日期：2013-08-19作者簡介:彭林峰（1975-）,男，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事診斷試劑生產(chǎn)和研發(fā)。通信作者：席仲興，E-mail：xiyuc8342181。特異的存在于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)中，目前的研究發(fā)現(xiàn)其能夠在心肌損傷的早期釋放入血液，可作為心肌損傷的一種新的標(biāo)志物用于急性心肌梗死（Acutemyocardialinfarction,AMI）的早期診斷近年來研究發(fā)現(xiàn),H.F

8、ABP在AMI發(fā)生1.5h后就可出現(xiàn)在血漿中,6h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，到24h后恢復(fù)到正常水平。而且,H-FABP對(duì)早期AMI的診斷敏感性顯著高于cTnI（肌鈣蛋白I）和CK-MB（肌酸激酶同工酶），其診斷發(fā)病3h內(nèi)的AMI亦明顯優(yōu)于cTnI、CK-MB和MY0（肌紅蛋白），表明H-FABP可作為早期急性心肌梗死的檢測指標(biāo)因此，定量檢測血液中H-FABP的含量對(duì)AMI的診斷和治療有重要意義。研究應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，研制了定量檢測H-FABP的ELISA試劑盒。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠，812周齡，雌性，清潔級(jí)；F1代小鼠，10-12周齡，雌性，清潔級(jí)；均由蘭

9、州生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡稱蘭州公司）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。1.1.2細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0細(xì)胞由蘭州公司診斷用品室保存。1.1.3主要試劑和材料次黃嗦吟、胸腺嗜喧核昔、組基蝶吟、聚乙二醇、二甲基亞根、兔抗鼠IgG酶標(biāo)記物、兔抗鼠IgG亞類檢測試劑、辣根過氧化物酶、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑和KPMI1640均購自Sigma公司；酶標(biāo)板購自Nunc公司；小牛血清購自蘭州民海生物制品公司；H-FABP參比品、洗液、顯色液和終止液均由蘭州公司診斷用品室提供;基質(zhì)稀釋液為含50mg/mL人血白蛋白的PBS緩沖液，由蘭州公司診斷用品室提供。1.2方法1.2.1雜交痛細(xì)胞株的建立參照文獻(xiàn)：6方

10、法。用純化的基因重組H-FABP抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)4次免疫后，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,克隆化3次后得到6株分泌抗H-FABP單抗的雜交瘤細(xì)胞株。將上述細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng),凍存并制備腹水。1.2.2單抗特性鑒定單抗的腹水效價(jià)測定:采用間接ELISA方法;單抗Ig類及亞類檢測:用鼠單抗分型試劑盒鑒定6株單抗的lg類與亞類，采用間接ELISA方法;單抗親和力檢測:采用硫景酸鉀洗脫法；單抗識(shí)別抗原表位的檢測:采用間接ELISA測相加指數(shù)，分析抗原識(shí)別位點(diǎn)，根據(jù)公式.4/=24w/（%+&）Tx100%判定結(jié)果,0值大于50%時(shí)，表示兩種單抗所識(shí)別的抗原位點(diǎn)不同;4/值在10%-50%之

11、間時(shí)，表示兩株抗體識(shí)別的抗原表位有差異值小于10%時(shí)，表示兩種單抗識(shí)別的抗原表位相同或相近。1.2.3雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的研制包被抗體濃度與酶標(biāo)記抗體最佳濃度的選擇:選擇效價(jià)高、親和力強(qiáng)、識(shí)別不同抗原表位的兩株單抗分別作為包被抗體和HRP標(biāo)記的信號(hào)抗體。采用方陣滴定法確定最佳抗體包被濃度與酶標(biāo)記抗體濃度;線性范圍分析：配制H-FABP的梯度稀釋液（050ng/mL），用試劑盒檢測，以H-FABP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行線性分析，確定線性范圍;準(zhǔn)確性分析:用基質(zhì)稀釋液將H-FABP參比品稀釋成0.5ng/mLx2ng/mL.8ng/mL、14ng/mL、20n

12、g/mL的樣品，通過測定回收率，分析檢測方法的準(zhǔn)確性;靈敏度分析：配制質(zhì)量濃度分別為0ng/mL.0.05ng/mL、0.1ng/mL,0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL的H-FABP溶液,每個(gè)濃度檢測5次，計(jì)算0ng/mL的均值及標(biāo)準(zhǔn)差（SO），吸光度均值+3SO為陽性;特異性分析:分別檢測0.1mg/mL膽紅素、20mg/mL膽固醇、500mg/mL血紅蛋白、0.5ng/inL肌鈣蛋白，其濃度為人血清正常值的5倍，重復(fù)3次，計(jì)算陰性對(duì)照均值及標(biāo)準(zhǔn)差，吸光度均值+3S/）為陽性;檢測方法的穩(wěn)定性分析：將制備的試劑于36-38T放置6d后,對(duì)定最曲線中的部分

13、測定點(diǎn)進(jìn)行檢測，分析靈敏度、線性范圍、變異系數(shù)等，與28幻保存的試劑進(jìn)行對(duì)照;精密度分析：用基質(zhì)稀釋液配制25ng/mLJ5ng/mL、5ng/mL3個(gè)質(zhì)量濃度的H-FABP溶液，每個(gè)濃度重復(fù)檢測10次,計(jì)算批內(nèi)精密度，使用不同批次制備的試劑，分別進(jìn)行5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)算批間精密度。1.2.4臨床樣本檢測應(yīng)用H-FABP定量檢測試劑盒對(duì)357份健康人血漿中H-FABP含量進(jìn)行測定，樣本入選標(biāo)準(zhǔn)為：血脂、血壓、血糖、肝腎功能以及心電圖均正常，排除外傷、肌肉病變、心血管疾病、糖尿病和其他內(nèi)分泌疾病，測定結(jié)果通過矩形正態(tài)檢驗(yàn)，其95%正常參考值上限按X2SD計(jì)算，計(jì)算正常參考值。檢測解放軍總醫(yī)院和解放

14、軍第305醫(yī)院住院及門診就診的AMI患者血清60份，入選標(biāo)準(zhǔn)為所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、心電圖動(dòng)態(tài)演變和心肌生化標(biāo)志物檢查確診。2結(jié)果21雜交瘤細(xì)胞株的建立用純化的的H-FABP抗原免疫BALB/c小鼠,血清效價(jià)達(dá)到1：10000時(shí)進(jìn)行融合，融合率在95%以上。用間接ELISA法篩選出18個(gè)陽性克隆,陽性率為5%,對(duì)其進(jìn)行3次克隆化培養(yǎng)后，獲得6株可分泌高效價(jià)單抗的雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇及3個(gè)月連續(xù)傳代培養(yǎng)后，仍然可穩(wěn)定分泌單抗。2.2單抗特性鑒定2.2.1單抗的腹水效價(jià)采用間接ELISA檢測純化后腹水抗體效價(jià)，各株單抗腹水效價(jià)均在lx105-1X106之間。2.2.2單抗Ig類及亞類4B

15、12、2G4、1A6分泌的單抗為IgG2a.7C8.8Dll分泌的單抗為IgG2b,5E10分泌的單抗為IgG3；輕鏈均為k鏈。2.2.3單抗的親和力采用硫氤酸鉀洗脫法，4B12、2G4、1A6、7C8、8D11、5E10等6種單抗的親和力指數(shù)分別為2.2mol/L、3.0mol/L、3.2mol/L、2.8mol/L、2.6mol/L、2.0mol/L,抗體相對(duì)親和力大小排列為IA62G47C88D114B125E10o2.2.4單抗識(shí)別的表位以位點(diǎn)加成試毀(間接ELISA)測定各株單抗4值，計(jì)算41值。單抗2G4與7C8A值為67.8%,識(shí)別不同抗原表位。2.3雙抗體夾心ELISA檢測試劑

16、盒的研制2.3.1包被抗體濃度與酶標(biāo)記抗體最佳濃度的選擇選擇7C8、2G4經(jīng)凝膠過濾(S-300)純化后，分別作為包被抗體和HRP標(biāo)記抗體,方陣滴定法確定7C8最佳包被濃度為4000倍稀釋，HRP標(biāo)記2G4工作濃度為5000倍稀釋。2.3.2線性范圍分析具有良好線性關(guān)系的檢測區(qū)間為0.425ng/mL,H-FABP的濃度曲線方程為、=0.0898x+0.1338,尸=0.9967。見圖1。圖1H-FABP的ELISA系統(tǒng)的線性范圍分析Fig.1ThelinearrangeofELISAsystemindetectionofH-FABP2.3.3準(zhǔn)確性分析檢測5份已知H-FABP質(zhì)量濃度的樣品，

17、其回收率在97.2%104.5%之間，表明該試劑盒有較高的準(zhǔn)確性。見表1。表1準(zhǔn)確性分析結(jié)果Tab.1Resultsforaccuracyanalysis已知濃度(ng/mL)測定濃度(ng/mL)準(zhǔn)確度(%)0.50.4797.202.02.03101.508.08.14101.7514.013.7298.0020.020.90104.502.3.4靈敏度分析在系列稀釋的參比品梯度中,0ng/mL的參比品均值+3SD為0.117,0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL參比品吸光值分別為0.091、0.102.0.158,0.2ng/mL參比品已成陽性反應(yīng)，故該試劑盒的檢測靈敏

18、度為0.2ng/mL。2.3.5特異性分析陰性對(duì)照A均值為0.095,SD為0.012,0.1mg/mL膽紅素、20mg/mL膽固醇、500mg/mL血紅蛋白、0.5ng/mL肌鈣蛋白的檢測A均值分別為0.098.0.092.0.102.0.097,均0.05),男女各組測定結(jié)果合并，均呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布。檢測AM1患者血清60份，H-FABP質(zhì)量濃度為(25.8土6.7)ng/mL。表3精密度分析結(jié)果Tab.3Resultsofprecisionanalysis已知濃度(ng/mL)XSI)sCVH-FABP濃度(ng/mL)5ng/mL15ng/mL15ng/mLXSDcv%XSDC

19、V%XSf)CV%批內(nèi)4.870.174.2315.080.234.7225.240.584.85批間4.920.236.1614.810.335.9425.120.676.723討論在早期急性心肌梗死的診斷中血清生化標(biāo)志物檢測有重要價(jià)值，目前臨床常用的有MYO、CK-MB、cTn【、H-FABP等，早期AMI患者經(jīng)常表現(xiàn)出非典型的癥狀，也不出現(xiàn)有診斷意義的心電圖表現(xiàn),胸痛發(fā)作6h內(nèi)血清酶學(xué)常在正常范圍。H-FABP在AMI發(fā)作后3h內(nèi)濃度上升，因此，H-FABP較cTnI、CK-MB、MB對(duì)早期AMI具有更好的診斷價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)檢測血漿H-FABP濃度水平變化，可監(jiān)測進(jìn)行性心肌梗死、心臟手術(shù)

20、后心肌梗死，評(píng)估心肌梗死面積大小網(wǎng)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雜交瘤技術(shù)成功制備2種識(shí)別不同抗原位點(diǎn)的抗H-FABP特異單抗，以其中一種單抗(7C8)作為包被抗體，另一單抗(2G4)標(biāo)記HRP作為信號(hào)抗體，制備了檢測H-FABP雙抗體夾心EUSA試劑盒。為提高檢測方法的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，在包被及檢測抗體的濃度選擇等方面進(jìn)行了大量的試驗(yàn)。為降低非特異性反應(yīng)的干擾，對(duì)封閉液的組成、標(biāo)記抗體、底物的使用濃度等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，從而獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，在保證檢測靈敏度的基礎(chǔ)上,將非特異性反應(yīng)降到最低。對(duì)試劑盒的的性能進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，該試劑盒具有較高的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及良好的穩(wěn)定性。通過對(duì)357份健康人

21、血漿中H-FABP含量的檢測，健康人血漿中H-FABP的質(zhì)量濃度正常參考值為1.87-8.50ng/mL,與文獻(xiàn)報(bào)道的正常參考值略有差別,這可能與參比品定值、試劑盒及人種的差異有關(guān)。檢測AMI患者血清60份,H-FABP的質(zhì)量濃度為(25.86.7)ng/mL,明顯高于健康人血漿中H-FABP含量。實(shí)驗(yàn)是定量檢測血中H-FABP濃度，此法具有較高的靈敏度、特異性及準(zhǔn)確性，可為臨床提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。但是，要應(yīng)用于臨床AMI的診斷,還需擴(kuò)大檢測樣本量，確定準(zhǔn)確的診斷臨界值。參考文獻(xiàn)IOkamotoF,SohmiyaK,OhkaniY,etal.Humanheart-typecytoplasm

22、icfattyacid-bindingprotein(H-FABP)forthediagnosisofacutemyocardialinfarction.ClinicalevaluationofH-FABPincomparisonwithmyoglobinandcreatinekinaseisoenzynieMBJ.ClinChemLabMed.2000,38(3):231-238.2AihadiiA,FoxKA.Doweneedadditionalmarkersofmyocytenecrosis:thepotentialvalueofheartfatty-acid-bindingprotei

23、nJ.QJM,2004,97(4):187-198.NakataT,HashimotoA,HaseM.elal.Humanheart-typefatlyacid-bindingproteinasanearlydiagnosticatniprognosticmurkerinacutecoronarysyndrome*J.Cardiology,2003.99(2)：96-104.4ScinoY.TomitaY,TakanoT,cta).Officecardiologistscooperativestudyonwholebloodrapidpaneltestsinpatientswithstispi*cious