12十二核酸的生物合成

1、一、一、DNA的生物合成的生物合成二、二、RNA的生物合成的生物合成40年代末，經(jīng)過一系列精彩實驗證明了DNA是多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。1953年，Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋模型，并設(shè)想了DNA是如何復(fù)制的，也就是說，在DNA分子上實現(xiàn)了生物的繁殖過程。這是具有劃時代的意義的。1958年，Crick又提出了生物分子遺傳的中心法則，為生命活動理清了思路。中心法則的建立，是生命科學(xué)發(fā)展的里程碑。雖然以后經(jīng)過一些修改和補充，但是它已經(jīng)成為生命科學(xué)最根本的法則。生物體的遺傳信息儲存在生物體的遺傳信息儲存在DNA中，并中，并通過通過DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在的復(fù)制由親代傳給子代。在子代

2、的生長發(fā)育中遺傳信息自子代的生長發(fā)育中遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄給錄給RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。相似的遺傳性狀。1958年，年，F(xiàn).Crick提出中心法則：提出中心法則：（1）以原）以原DNA分子為模板，合成出分子為模板，合成出相同相同DNA分子的過程。分子的過程。（2）以某一段）以某一段DNA分子為模板，合分子為模板，合成出與其序列對應(yīng)的成出與其序列對應(yīng)的RNA分子的過程分子的過程。（3）以）以mRNA為模板，根據(jù)三聯(lián)密碼為模板，根據(jù)三聯(lián)密碼規(guī)則，合成對應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。規(guī)則，合成對應(yīng)蛋白質(zhì)

3、的過程。中心法則揭示了生物體內(nèi)遺傳信息的中心法則揭示了生物體內(nèi)遺傳信息的傳遞方向。傳遞方向。中心法則： 本章的主要任務(wù)就是要回答中心法則的第一部分：DNA分子是如何復(fù)制的，其細(xì)節(jié)是什么？子代DNA為什么能夠真實地獲得親代DNA的遺傳信息？生物體是如何對DNA復(fù)制進(jìn)行調(diào)控的？ 中心法則中的DNA復(fù)制（replication)，實質(zhì)上就是要解決生物如何將遺傳信息傳遞的子代的問題，也就是以原來的DNA分子為模板合成相同的DNA分子的過程。轉(zhuǎn)錄(transcription)就是在DNA分子上的某一段生物“語言”即DNA序列轉(zhuǎn)錄為RNA的過程。所謂翻譯(translation)則是在信使RNA(mRNA

4、)的指導(dǎo)下將核苷酸的排列順序翻譯成氨基酸排列順序（蛋白質(zhì)）的過程。少數(shù)生物以RNA為遺傳物質(zhì)，它們可以以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，也可以直接以RNA為模板進(jìn)行復(fù)制，并翻譯蛋白質(zhì)。DNA生物合成有兩種方式：生物合成有兩種方式：DNA復(fù)制和反轉(zhuǎn)錄復(fù)制和反轉(zhuǎn)錄 DNA體內(nèi)復(fù)制涉及：原核、真核生物的染色體體內(nèi)復(fù)制涉及：原核、真核生物的染色體、細(xì)菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細(xì)胞器、細(xì)菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細(xì)胞器DNA（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀）（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀） DNA的體外復(fù)制：分子克隆。的體外復(fù)制：分子克隆。 原核生物每個細(xì)胞只有一個染色體，即細(xì)胞核基因組，也就是

5、一個DNA分子。雖然原核生物有的還含有核基因組以外的環(huán)形DNA(如質(zhì)粒，plasmids)，但是質(zhì)粒的DNA相對核基因組要小得多。真核生物每個細(xì)胞含有多條染色體，每條染色體中有一個DNA分子。在細(xì)胞增值的過程中，基因組要發(fā)生精確的復(fù)制，然后在細(xì)胞分裂時等分到每個子細(xì)胞中去。染色體復(fù)制的實質(zhì)是DNA分子的復(fù)制。 染色體以外的遺傳因子，包括細(xì)菌的質(zhì)粒、真核細(xì)胞的細(xì)胞器等，其遺傳物質(zhì)的復(fù)制有的受核基因組控制，有的則不受核基因組的控制。例如有的細(xì)菌的質(zhì)粒，每個細(xì)胞中只有一個或幾個拷貝，稱為單拷貝質(zhì)粒，該控制為嚴(yán)緊控制(stringent control)，有的質(zhì)粒則在每個細(xì)胞中有20個以上的拷貝，稱此

6、為松弛控制(relaxed control)質(zhì)粒，又稱為多拷貝質(zhì)粒。 核基因組DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞分裂的S期，但是核基因組以外的DNA是否進(jìn)入復(fù)制則是隨機的。因而有些DNA分子在一個細(xì)胞周期中并不是復(fù)制一次，有些則不發(fā)生復(fù)制。例如對于植物來講，其根尖生長點，由于細(xì)胞復(fù)制和分裂速度很快，而寄生于其中的病毒則仍然按照自己的速度進(jìn)行復(fù)制，所以通過取一小段根尖進(jìn)行快速組織培養(yǎng)繁殖，即可能獲得脫毒(不含病毒)的植株。返回DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制(semiconservative replication)Watson和和Crick在提出在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時即推測，模型時即推測，DN

7、A在復(fù)制時首先兩條在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代鏈，這樣新合成的子代DNA分子中分子中一條鏈來自親代一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞?，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。成的，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。科學(xué)家同時還設(shè)想了其它可能的復(fù)制模型 雖然Watson 和Crick推測了DNA的復(fù)制可能是半保留的，但是并沒有拿出任何實驗證據(jù)，而生命科學(xué)的每一個理論都必需經(jīng)過實驗證明才能得到公認(rèn)。 1958年Meselson 和Stahl利用同位素

8、15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，首先證明了其DNA復(fù)制的確是半保留的。 此后，大量的實驗都證明了原核生物和真核生物DNA都是半保留復(fù)制的。然而真正用電子顯微鏡觀察到DNA的復(fù)制過程還是在1963年由Cairns作出的。他用3H標(biāo)記大腸桿菌DNA經(jīng)過兩代之后，用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的染色體DNA釋放出來，鋪在一張透析膜上，用感光乳膠片感光，顯影后在電子顯微鏡下觀察，由于3H可以釋放出弱射線，所以在顯影后的乳膠片上顯示出的銀顆粒勾畫出了DNA分子的輪廓，黑點的數(shù)目代表了3H在DNA分子中的密度。從而在電子顯微鏡下，Cairns直接觀察到了DNA的半保留復(fù)制。 此后，大量的實驗都證明了原核生物和真

9、核生物DNA都是半保留復(fù)制的。然而真正用電子顯微鏡觀察到DNA的復(fù)制過程還是在1963年由Cairns作出的。他用3H標(biāo)記大腸桿菌DNA經(jīng)過兩代之后，用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的染色體DNA釋放出來，鋪在一張透析膜上，用感光乳膠片感光，顯影后在電子顯微鏡下觀察，由于3H可以釋放出弱射線，所以在顯影后的乳膠片上顯示出的銀顆粒勾畫出了DNA分子的輪廓，黑點的數(shù)目代表了3H在DNA分子中的密度。從而在電子顯微鏡下，Cairns直接觀察到了DNA的半保留復(fù)制。2居中居中重重輕輕01341958年，年，Meselson和和Stahl用用15N標(biāo)記標(biāo)記E.coli. DNA，證明了證明了DNA的復(fù)制是

10、半保留復(fù)制。的復(fù)制是半保留復(fù)制。復(fù)制起始點是以一條鏈為模板起始復(fù)制起始點是以一條鏈為模板起始DNA合成合成的一段序列。有時，兩條鏈的復(fù)制起點并不的一段序列。有時，兩條鏈的復(fù)制起點并不總是在同一點上（如總是在同一點上（如D環(huán)復(fù)制）。環(huán)復(fù)制）。在一個完整的細(xì)胞周期中，每一個復(fù)制起點在一個完整的細(xì)胞周期中，每一個復(fù)制起點只使用一次，完成一次復(fù)制過程。只使用一次，完成一次復(fù)制過程。多數(shù)生物的復(fù)制起點，都是多數(shù)生物的復(fù)制起點，都是DNA呼吸作用強呼吸作用強烈（甲醛變性實驗）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的烈（甲醛變性實驗）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含區(qū)段，富含A.T。 定點起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進(jìn)行或

11、異速進(jìn)行），定點起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進(jìn)行或異速進(jìn)行），形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個復(fù)制叉。形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個復(fù)制叉。用放射自顯影實驗判斷用放射自顯影實驗判斷DNA的復(fù)制方向及速度的復(fù)制方向及速度 低放射性低放射性3H-脫氧胸苷脫氧胸苷 高放射性高放射性3H-脫氧胸苷脫氧胸苷a. 單向單向b. 雙向等速雙向等速 三種結(jié)果圖形三種結(jié)果圖形c. 雙向異速雙向異速E.coli.的一個溫度敏感株，在的一個溫度敏感株，在42時，能使時，能使DNA在完成復(fù)制后，在完成復(fù)制后，不再開始新的復(fù)制過程，而在不再開始新的復(fù)制過程，而在25時復(fù)制功又能能恢復(fù)。時復(fù)制功又

12、能能恢復(fù)。直線雙向復(fù)制直線雙向復(fù)制 單點，雙向，單點，雙向，T7 多點，雙向，真核染色體多點，雙向，真核染色體DNA型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向或雙向（，單向或雙向（E .coli.）滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，x174D環(huán)復(fù)制：線粒體、葉綠體環(huán)復(fù)制：線粒體、葉綠體DNA多復(fù)制叉復(fù)制：多復(fù)制叉復(fù)制：第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。在在E.coli.富營養(yǎng)時，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。富營養(yǎng)時，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。E.coli. DNA的的復(fù)制最快可達(dá)復(fù)制最快可達(dá)50Kb/min，完全復(fù)制需，完全復(fù)

13、制需40min，富營養(yǎng)時，富營養(yǎng)時，20min分裂。而真核染色體要分裂。而真核染色體要6-8小時。小時。 復(fù)制子復(fù)制子(Replicon)基因組能獨立進(jìn)行復(fù)制的單位每個復(fù)制子都含有一基因組能獨立進(jìn)行復(fù)制的單位每個復(fù)制子都含有一個復(fù)制起點。個復(fù)制起點。 原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起點開始復(fù)制，復(fù)制方向大子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起點開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不

14、對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。 環(huán)狀環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象的復(fù)制眼象，稱，稱形復(fù)制。形復(fù)制。 真核生物的染色體真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點，因此是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點，因此是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細(xì)胞平均每個染色體。人體細(xì)胞平均每個染色體含有含有1000個復(fù)制子。個復(fù)制子。 病毒病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復(fù)制子。多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復(fù)制子。v DNA聚合酶聚合酶v DNA模板模板(反轉(zhuǎn)錄時用反轉(zhuǎn)錄時用RN

15、A模板模板v 引物引物 (DNA、RNA或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì))v 4種種dNTPv Mg2+ 在鏈的延長過程中，鏈的游離在鏈的延長過程中，鏈的游離3 3，- -羥基，對進(jìn)入的脫氧核糖羥基，對進(jìn)入的脫氧核糖核苷三磷酸核苷三磷酸磷原子發(fā)生親核攻擊，生成磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3 3，.5.5，- -磷酸二酯磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。鍵，并脫下焦磷酸。DNA聚合酶的反應(yīng)特點：聚合酶的反應(yīng)特點： 以以4種種dNTP為底物為底物 反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，不能催化游離的反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，不能催化游離的dNTP的聚合。的聚合。 反應(yīng)需有引物反應(yīng)需有引物3，-羥基存在羥基存在 鏈生長方向鏈生長方向5， 3，

16、 產(chǎn)物產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同的性質(zhì)與模板相同v 發(fā)莢環(huán)結(jié)構(gòu)：加入單鏈發(fā)莢環(huán)結(jié)構(gòu)：加入單鏈DNADNA作為模板和引物，作為模板和引物，33羥基端回折成引物鏈。羥基端回折成引物鏈。v 末端延伸聚合：加入雙鏈末端延伸聚合：加入雙鏈DNADNA作為模板和引物，作為模板和引物，33末端突出作為模板。末端突出作為模板。v 分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈DNADNA，聚合，聚合發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。v 環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形DNADNA作為模板。作為模板。 雙鏈雙鏈DNA復(fù)制的分子機制：復(fù)制的分子機制： 岡崎片斷和

17、半不連續(xù)復(fù)制岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制 岡崎片斷和岡崎片斷和RNA引物引物 DNA連接酶連接酶 母本母本DNA雙鏈的分離雙鏈的分離 聚合酶的校對作用聚合酶的校對作用DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶1、DNA聚合酶I 雖然我們已經(jīng)證明并觀察到DNA的半保留復(fù)制，但是負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的到底是什么？能否找到DNA復(fù)制的酶？仍然需要科學(xué)來解決。1956年，Kornberg等首先從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，后來在大量生物中都分離到了具有DNA復(fù)制能力的酶，稱為DNA聚合酶，也叫做依賴于DNA的DNA聚合酶。Kornberg在大腸桿菌中所發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶為DNA聚合酶I其催化反應(yīng)如下：KornbergsE.c

18、oli. DNA pol.I（Kornberg酶，酶，400 copy/cell）E.coli. DNA Pol.（100 copy/cell)E.coli.NA pol.（復(fù)制酶，（復(fù)制酶，10-20 copy/cell）v單體酶，分子量單體酶，分子量109Kd109Kd，含一個，含一個Zn2+Zn2+，每個細(xì)胞中含，每個細(xì)胞中含400400個個DNA pol.DNA pol.催化活性：催化活性： 5 5， 3 3， 聚合活性聚合活性 3 3， 5 5， 外切活性外切活性 5 5， 3 3， 外切活性外切活性v用蛋白水解酶將用蛋白水解酶將DNA pol.DNA pol.部分水解可得：部分水解

19、可得： 大片段（大片段（KlenowKlenow），），75Kd75Kd，活性：，活性：5 5， 3 3，聚合活性、，聚合活性、3 3， 5 5，外切活性。外切活性。 小片段，小片段，36Kd36Kd，活性：，活性：5 5， 3 3，外切活性（只作用于雙鏈，外切活性（只作用于雙鏈DNADNA的堿的堿基配對部分，切除修復(fù)）?；鋵Σ糠?，切除修復(fù)）。vKlenowKlenow片段的用途：片段的用途：a a 補齊補齊DNA 3DNA 3，隱縮未端，隱縮未端 b. b. 標(biāo)記標(biāo)記DNADNA片段未端片段未端 c ccDNAcDNA合成第二鏈合成第二鏈 d dd DNAd DNA測序測序 E.coli.

20、 DNA pol.I 經(jīng)過對DNA polymerase I進(jìn)行詳細(xì)研究表明，其反應(yīng)特征為：1、以四種脫氧核苷三磷酸為底物，通過水解焦磷酸提供能量。2、反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)。3、反應(yīng)需要引物3羥基的存在。4、DNA的生長方向為53。5、產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同。 DNA聚合酶I是一個多功能酶。它可以催化下列反應(yīng)：1、 53聚合活性，催化新合成的DNA鏈沿5到3方向延伸。2、3 5核酸外切酶活性。3、 53核酸外切酶活性。4、3 端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解，即聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)。5、無機磷酸鹽與脫氧核苷三磷酸之間的焦磷酸基交換。DNA polymerase I ： Klenow fragment

21、 DNA聚合酶的35核酸外切酶活性對于DNA復(fù)制的忠實性是極為重要的，如果沒有此活性，則DNA復(fù)制的出錯率將明顯增高。例如某些變異的T4噬菌體突變率很高，分離出的此種噬菌體的DNA聚合酶的35外切酶活性很弱。所分離到的抗突變能力很低的T4噬菌體的DNA聚合酶，其35活性則很高，所以科學(xué)家斷定DNA聚合酶的35外切酶活性是負(fù)責(zé)對復(fù)制的DNA起校對作用的。 2、DNA聚合酶II 1969年Delucia 和Cairns 分離到一個大腸桿菌變異株，其DNA聚合酶I的活力極低，僅為野生型的0.5%1%，但是它可以正常繁殖由此人們懷疑DNA聚合酶I可能不少生物復(fù)制所需的主要酶，它的主要作用是對損傷起修復(fù)

22、作用。1970年和1971年先后分離到另外兩種DNA聚合酶，定名為DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。E.coli. DNA Pol. DNA聚合酶聚合酶II 1969年年Delucia 和和Cairns 分離到一個大腸桿分離到一個大腸桿菌變異株，其菌變異株，其DNA聚合酶聚合酶I的的活力極低，僅為野生型的活力極低，僅為野生型的0.5%1%，但是它可以正常，但是它可以正常繁殖由此人們懷疑繁殖由此人們懷疑DNA聚合聚合酶酶I可能不少生物復(fù)制所需的可能不少生物復(fù)制所需的主要酶，它的主要作用是對主要酶，它的主要作用是對損傷起修復(fù)作用。損傷起修復(fù)作用。DNA聚合聚合酶酶II由一條分子量為由一條分子量

23、為120kd的的多肽鏈組成。其聚合酶活力多肽鏈組成。其聚合酶活力很低，只相當(dāng)于很低，只相當(dāng)于DNA聚合酶聚合酶I的的1-5，它具有，它具有35外切酶外切酶活性，但無活性，但無53外切酶活性。外切酶活性。該酶的缺陷型大腸桿菌，仍該酶的缺陷型大腸桿菌，仍然可以正常進(jìn)行然可以正常進(jìn)行DNA復(fù)制，復(fù)制，說明它不是復(fù)制所需主要說明它不是復(fù)制所需主要DNA聚合酶，其作用不祥，聚合酶，其作用不祥，可能在損傷修復(fù)中起某種作可能在損傷修復(fù)中起某種作用。用。1970年和年和1971年先后分離到另年先后分離到另外一種外一種DNA聚合酶，定名為聚合酶，定名為DNA聚合酶聚合酶III。v 單體酶，分子量單體酶，分子量1

24、20Kd120Kdv 催化活性：催化活性：v 5 5， 3 3，聚合，聚合( (活性很低活性很低) ) 3 3， 5 5，外切，外切v 可能在可能在DNADNA的修復(fù)中起某中作用的修復(fù)中起某中作用 寡聚酶，全酶由寡聚酶，全酶由1010種共種共2222個亞基組成，個亞基組成，、和和三種亞基組成核心酶。三種亞基組成核心酶。DNA pol.DNA pol.是合成新鏈?zhǔn)呛铣尚骆淒NADNA主要的酶，又稱復(fù)主要的酶，又稱復(fù)制酶制酶(Replicase)(Replicase) Pol.Pol.的的5 5，33，外切酶活性只作用于單鏈，外切酶活性只作用于單鏈DNADNA。 E.coli.DNA pol. E

25、.coli.DNA pol.的組成的組成DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶分子量分子量109KD120KD600KD每個細(xì)胞中的分子數(shù)每個細(xì)胞中的分子數(shù)40017-10010-2053聚合活性聚合活性+37轉(zhuǎn)化率核苷酸數(shù)轉(zhuǎn)化率核苷酸數(shù)酶分子酶分子分鐘分鐘6003030,00053外切活性外切活性+-35外切活性外切活性+切刻平移活性切刻平移活性+-對對dNTP親和力親和力低低低低高高功能功能修復(fù)修復(fù)復(fù)制復(fù)制修復(fù)修復(fù)去除引物去除引物填補空缺填補空缺細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)，DNADNA的復(fù)制需要引物（的復(fù)制需要引物（DNADNA或或RNARNA），引），引物酶或物酶或RNARNA聚

26、合酶可合成聚合酶可合成6-106-10個堿基的個堿基的RNARNA引物引物。DNADNA復(fù)制為什么要用復(fù)制為什么要用RNARNA引物？（為什么引物？（為什么DNADNA聚聚合酶要用引物，合酶要用引物，RNARNA聚合酶不需要引物？）聚合酶不需要引物？）從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配鍵都較弱，易發(fā)生錯配新復(fù)制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)新復(fù)制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，定雙鏈，DNADNA聚合酶的聚合酶的5 5，33，校對功能難發(fā)揮，校對功能難發(fā)揮作用。作用。 大腸桿菌的解螺旋酶大腸桿菌的解螺旋酶、與與re

27、prep蛋蛋白共同作用，將白共同作用，將DNADNA兩條鏈解開。兩條鏈解開。 解螺旋酶解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿著模板鏈的沿著模板鏈的5353方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動，方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動，而而reprep蛋白則在另一條模板鏈上沿蛋白則在另一條模板鏈上沿3535方向移動。方向移動。屬屬DNADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時帶來的扭曲張力。叉前進(jìn)時帶來的扭曲張力。拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類：拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類：I I和和IIII，廣泛存在于原核生物，廣泛存在于原核生物和真核生物。和真核生物。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶I I使使DNADNA

28、的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶使使DNADNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，的兩條鏈同時斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時需要由當(dāng)它引入超螺旋時需要由ATPATP供給能量。分布在染供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。 復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNADNA前進(jìn)，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈前進(jìn)，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNADNA結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和

29、保護(hù)單鏈復(fù)性和保護(hù)單鏈DNADNA不被核酸酶降不被核酸酶降解。解。三、DNA連接酶 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，所有的DNA聚合酶都只能催化核苷酸鏈的延長反應(yīng)，不能使鏈之間連接。所以，科學(xué)家推斷，細(xì)胞內(nèi)必定存在著一種連接酶，催化DNA末端之間的連接。1967年幾個實驗室同時發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶(DNA ligase)，催化雙鏈DNA切口處的5磷酸基和3羥基生成磷酸二酯鍵。DNA連接所需能量，細(xì)菌由NADHH+提供能量；動物細(xì)胞和噬菌體以ATP作為能量來源。反應(yīng)分三步進(jìn)行：首先NADHH+或ATP與酶反應(yīng)，形成復(fù)合物，例如和ATP形成酶AMP復(fù)合物，AMP的磷酸基與酶的賴氨酸的氨基以磷酰胺鍵結(jié)合，然后酶將AMP轉(zhuǎn)

30、移給DNA切口處的5磷酸，以焦磷酸的形式活化，形成A-P-P-DNA，然后通過相鄰鏈的3OH對活化的磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3，5磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。連接雙鏈連接雙鏈DNADNA上的切口。上的切口。大腸桿菌連接酶只能在模板上連接大腸桿菌連接酶只能在模板上連接DNADNA缺口缺口。T4DNA ligaseT4DNA ligase即可連接粘性末端的即可連接粘性末端的DNADNA，又可連接平齊末端的雙鏈又可連接平齊末端的雙鏈DNADNA。E.coli.E.coli.和其它細(xì)菌的和其它細(xì)菌的DNA ligaseDNA ligase以以NADNAD為為能源，動物細(xì)胞和噬菌體能源，動物細(xì)胞和噬菌

31、體DNA ligaseDNA ligase以以ATPATP為能源。為能源。 模板模板DNADNA結(jié)合位點結(jié)合位點 引物結(jié)合位點引物結(jié)合位點 引物引物3 3，-OH-OH位點、反應(yīng)位點位點、反應(yīng)位點 底物底物dNTPdNTP結(jié)合位點結(jié)合位點 5 5， 3 3， 外切位點外切位點(pol.(pol.沒有沒有) ) 3 3， 5 5， 外切位點外切位點( (校正校正) )（二）真核生物DNA聚合酶 在發(fā)現(xiàn)上述大腸桿菌DNA聚合酶之后不久，科學(xué)家又從小牛胸腺中分離到了真核生物的DNA聚合酶。大量的研究表明，真核生物細(xì)胞中存在四種DNA聚合酶，分別以、和來命名。如下表：DNA聚聚合合酶酶 DNA聚聚合合

32、酶酶 DNA聚聚合合酶酶 DNA聚聚合合酶酶 分分子子量量110-220kd45kd60kd122kd亞亞基基數(shù)數(shù)多個1個1個1個細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)分分布布細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核和線粒體細(xì)胞質(zhì)酶酶活活力力/總總活活力力8010152151025核核酸酸外外切切酶酶活活力力無無無35外切酶真核生物DNA聚合酶 真核生物的DNA聚合酶可能是真核生物的復(fù)制酶，它需要3引物。聚合酶可能在DNA修復(fù)中起重要作用。聚合酶可能與線粒體DNA復(fù)制有關(guān)。真核真核DNADNA聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的酶在酶在DNADNA復(fù)制中起校正功能。復(fù)制中起校正功能。 DNA DNA聚

33、合酶聚合酶，多亞基，功能與，多亞基，功能與E.coli. pol.E.coli. pol.類似，是真核類似，是真核DNADNA復(fù)制酶。復(fù)制酶。 DNA DNA聚合酶聚合酶，主要在，主要在DNADNA損傷的修復(fù)中起作用損傷的修復(fù)中起作用。 DNA DNA聚合酶聚合酶，從線粒體得到，可能與線粒體，從線粒體得到，可能與線粒體DNADNA的復(fù)制有關(guān)。的復(fù)制有關(guān)。 DNA DNA聚合酶聚合酶，特點：有，特點：有3 3， 5 5，外切活力。，外切活力。 亞基數(shù)亞基數(shù)44425分子量（分子量（KD)25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位細(xì)胞內(nèi)定位核核核核線粒體線粒體核核核核53聚合活性聚合活性

34、35外切活性外切活性 功能功能復(fù)制、引發(fā)復(fù)制、引發(fā)修復(fù)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制修復(fù)修復(fù)岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制 按照按照Watson-Crick假說假說DNA 兩條鏈的方向相反如果兩條鏈的方向相反如果DNA的一的一條鏈從條鏈從53合成，則另一條鏈必須從合成，則另一條鏈必須從3-5延伸。延伸。 1968年岡崎等人用年岡崎等人用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌發(fā)脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)先合成的是較短的現(xiàn)短期內(nèi)先合成的是較短的DNA片斷接著出現(xiàn)大分子片斷接著出現(xiàn)大分子 新新DNA的一條鏈?zhǔn)前吹囊粭l鏈?zhǔn)前?3方向合成的，稱為方向合成的，稱為“前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈”該片該片

35、段的合成是連續(xù)的。另一條鏈的合成是不連續(xù)的先合成若干片段的合成是連續(xù)的。另一條鏈的合成是不連續(xù)的先合成若干片斷再通過酶的作用形成第二條新鏈，稱為斷再通過酶的作用形成第二條新鏈，稱為“后隨鏈后隨鏈”岡崎片段長度：岡崎片段長度：細(xì)菌：細(xì)菌：1Kb-2Kb，相當(dāng)于一個順反子的大小。，相當(dāng)于一個順反子的大小。真核：真核：100-200bp，約等于一個核小體，約等于一個核小體DNA的長度。的長度。 岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制引發(fā)：當(dāng)引發(fā)：當(dāng)DNADNA的雙螺旋解開后，合成的雙螺旋解開后，合成RNARNA引物的過程。引物的過程。引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子（引發(fā)體：引物合成酶與各種

36、蛋白質(zhì)因子（dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、n nn nI I）構(gòu)成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)）構(gòu)成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)RNARNA引物的合成。引物的合成。引發(fā)體沿著模板鏈引發(fā)體沿著模板鏈5353方向移動（與岡崎片段合成方向移動（與岡崎片段合成的方向正好相反，而與復(fù)制叉移動的方向相同），移到的方向正好相反，而與復(fù)制叉移動的方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)一定位置上即可引發(fā)RNARNA引物的合成。引物的合成。E.coli.DNAE.coli.DNA復(fù)制原點復(fù)制原點ori Cori C，由，由245bp245bp組成，三組組成，三組13bp13bp重重復(fù)序列（近復(fù)序列（近5 5，端處），四組，端處），

37、四組9 bp9 bp重復(fù)序列（另一端處）重復(fù)序列（另一端處）。 大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì) DNaA 在原點處打開雙螺旋在原點處打開雙螺旋 DNaB 使使DNA解旋解旋 DNaC DNaB結(jié)合在原點所需結(jié)合在原點所需 Hu 刺激起始刺激起始 引物酶（引物酶（DNaG） 合成合成RNA引物引物 SSB 結(jié)合單鏈結(jié)合單鏈DNA RNA聚合酶聚合酶 促進(jìn)促進(jìn)DNaA活性旋轉(zhuǎn)酶活性旋轉(zhuǎn)酶 松馳松馳DNA扭曲應(yīng)力扭曲應(yīng)力20個個DnaA結(jié)合在四組結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，DNA環(huán)繞此復(fù)合物。環(huán)繞此復(fù)合物。 三組三組13bp重

38、復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開放型復(fù)合物。重復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開放型復(fù)合物。 DnaB（在（在DnaC協(xié)助下）與開放復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步解鏈。協(xié)助下）與開放復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步解鏈。 大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)前導(dǎo)鏈只需要一個前導(dǎo)鏈只需要一個RNARNA引物，后隨鏈的每一個岡崎片引物，后隨鏈的每一個岡崎片段都需要一個段都需要一個RNARNA引物，鏈的延長反應(yīng)由引物，鏈的延長反應(yīng)由DNA DNA pol.pol.催化。催化。 復(fù)制體：在復(fù)制體：在DNADNA合成的生長點（既復(fù)制叉上）分布著合成的生長點（既復(fù)制叉上）分布著許多與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們在許多與復(fù)制有

39、關(guān)的酶和輔助因子，它們在DNADNA的模板的模板鏈形成離散的復(fù)合物，彼此配合進(jìn)行高度精確的復(fù)鏈形成離散的復(fù)合物，彼此配合進(jìn)行高度精確的復(fù)制，稱為復(fù)制體。制，稱為復(fù)制體。 復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進(jìn)就合成復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進(jìn)就合成DNADNA。 DNA pol的的5，3，外切活力，切除，外切活力，切除RNA引物。引物。DNApol的的5，3，合成活性補齊缺口。，合成活性補齊缺口。 DNA ligase，動物、真核由，動物、真核由ATP供能，原核由供能，原核由NAD供能。供能。 催化一條催化一條DNA鏈的鏈的3末端與相鄰的另一條末端與相鄰的另一條DNA鏈的鏈的5末端之間的磷酸二酯鍵的合成。其它末

40、端之間的磷酸二酯鍵的合成。其它功能：功能：（1）修補雙螺旋）修補雙螺旋DNA中單股的缺口；中單股的缺口；（2）連接線狀雙螺旋）連接線狀雙螺旋DNA以產(chǎn)生環(huán)狀以產(chǎn)生環(huán)狀DNA；（3）重組過程中將幾段）重組過程中將幾段DNA鏈連接起來。鏈連接起來。母本母本DNA雙鏈的分離雙鏈的分離聚合酶的校對作用聚合酶的校對作用參見課本參見課本P252 圖圖12-9復(fù)制的準(zhǔn)確性高于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程。復(fù)制的準(zhǔn)確性高于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程。環(huán)狀環(huán)狀DNADNA、線性、線性DNADNA，復(fù)制叉相遇，復(fù)制叉相遇即終止。即終止。 DNA解螺旋酶解開雙鏈解螺旋酶解開雙鏈DNA。 SSB結(jié)合于結(jié)合于DNA單鏈。單鏈。 DNA旋轉(zhuǎn)酶引入

41、負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時帶來的旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時帶來的扭曲張力。扭曲張力。 DNA引物酶引物酶(在引發(fā)體中在引發(fā)體中)合成合成RNA引物。引物。 DNA pol.在兩條新生鏈上合成在兩條新生鏈上合成DNA。 DNA pol切除切除RNA引物，并補上引物，并補上DNA。 DNA ligase連接一個岡崎片段。連接一個岡崎片段。 DNA復(fù)制過程中，聚合酶對復(fù)制過程中，聚合酶對dTTP和和dUTP的分辨能力高的分辨能力高,有少量有少量dUTP摻入摻入DNA鏈中，此時，鏈中，此時，U-糖苷酶、糖苷酶、AP內(nèi)切內(nèi)切酶、酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接共

42、同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。上正確的堿基。真核生物染色體真核生物染色體DNADNA是多復(fù)制子，有多個復(fù)制起點，可以多點是多復(fù)制子，有多個復(fù)制起點，可以多點起始，分段進(jìn)行復(fù)制。每個復(fù)制子大多在起始，分段進(jìn)行復(fù)制。每個復(fù)制子大多在100-200bp100-200bp之間，比之間，比細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNADNA（單復(fù)制子）小得多。（單復(fù)制子）小得多。試驗證據(jù)：試驗證據(jù)：5-5-氟脫氧胞苷標(biāo)記氟脫氧胞苷標(biāo)記真核生物真核生物DNADNA復(fù)制叉移動的速度此原核的慢，如哺乳動物復(fù)制復(fù)制叉移動的速度此原核的慢，如哺乳動物復(fù)制叉移動的速度每分鐘叉移動的速度每分鐘1-3Kb1-3Kb，細(xì)菌每分鐘，細(xì)菌

43、每分鐘5Kb5Kb。真核生物染色體全部復(fù)制完成前，起點不再從新開始復(fù)制。真核生物染色體全部復(fù)制完成前，起點不再從新開始復(fù)制。而在快速生長的原核生物中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核而在快速生長的原核生物中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物在快速生長時，可采用更多的復(fù)制起點同時復(fù)制。如黑生物在快速生長時，可采用更多的復(fù)制起點同時復(fù)制。如黑腹果蠅，早期胚胎細(xì)胞中相鄰復(fù)制起點的平均距離為腹果蠅，早期胚胎細(xì)胞中相鄰復(fù)制起點的平均距離為7.9kb7.9kb，而在培養(yǎng)的成體細(xì)胞中，平均距離為而在培養(yǎng)的成體細(xì)胞中，平均距離為40kb40kb，成體細(xì)胞只利用，成體細(xì)胞只利用一部分復(fù)制起點。一部分復(fù)制起點。 核小體的

44、結(jié)構(gòu)（核小體的結(jié)構(gòu)（200bp200bp左右）左右）在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNADNA的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，小體。因此，DNADNA的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。全保留的。試驗證據(jù)：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微試驗證據(jù)：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀察鏡下觀察反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，

45、以為底物，以RNA為模板，為模板，tRNA(主要是色氨酸主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在為引物，在tRNA3OH末末端上，按端上，按53方向，合成一條與方向，合成一條與RNA模板互補的模板互補的DNA單鏈，這條單鏈，這條DNA單鏈叫做互補單鏈叫做互補DNA(complementary DNA, cDNA)，它與，它與RNA模板模板形成形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉，水解掉RNA鏈，再以鏈，再以cDNA為模板合成第二條為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA合成過程合成過程大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶

46、活性，主要包括以下幾種活性大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性: DNA聚合酶活性；以聚合酶活性；以RNA為模板，催化為模板，催化dNTP聚合成聚合成DNA的過程。此酶需的過程。此酶需要要RNA為引物，多為色氨酸的為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物，在引物tRNA3末端以末端以53方向合方向合成成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。出錯率比較高。 RNase H活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板與模板RNA形

47、成的雜交分子形成的雜交分子，將由，將由RNase H從從RNA5端水解掉端水解掉RNA分子。分子。 DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，單鏈為模板，以以dNTP為底物，再合成第二條為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。中有關(guān)。 反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種重

48、要的工具酶。用組織細(xì)胞提取重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補的，合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出，由此可構(gòu)建出cDNA文庫文庫(cDNA library)，從，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法。法。錯配修復(fù)（錯配修復(fù)（mismatch Repair） 錯配修復(fù)對錯配修復(fù)對DNA復(fù)制忠實性的貢獻(xiàn)力達(dá)復(fù)制忠實性的貢獻(xiàn)力達(dá)102-103，DNA子鏈中的子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性錯配幾

49、乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性堿基切除修復(fù)（堿基切除修復(fù)（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特異性識別常見的能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為被稱為AP位點（位點（apurinic or apyrimidinic）。細(xì)胞中最常見的）。細(xì)胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。核苷酸切除修復(fù)（核苷酸切除修復(fù)（nucleoti

50、de-excision repair） 當(dāng)當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)DNA的直接修復(fù)（的直接修復(fù)（Direct repair）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對稱性。限制性核酸內(nèi)切酶識別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對稱性。限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平頭末端平頭末端Hpa 5GAATT

51、C33CTTAAG55G A ATTC33CTTAA G5粘性末端粘性末端EcoR1985年年A.K.Saiki等首先報道了等首先報道了PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）551 熱變性熱變性2 退火退火55553 DNA聚合酶聚合酶5555重復(fù)重復(fù)1，2，3PCR反應(yīng)全過程反應(yīng)全過程RNA的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制。的復(fù)制。轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（transcription）：以一段）：以一段DNA的遺傳信息為的遺傳信息為模板，在模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對應(yīng)的聚合酶作用下，合成出對應(yīng)的RNA的過程，或在的過程，或在DNA指導(dǎo)下合成指導(dǎo)下合成RNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：轉(zhuǎn)錄

52、產(chǎn)物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小、小RNA除某些病毒基因組除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)外，絕大多數(shù)RNA分子都分子都來自來自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。 在DNA指導(dǎo)下的RNA合成 DNA指導(dǎo)下的RNA合成稱為轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄起始于DNA的一個特定位置（固定的序列），稱之為轉(zhuǎn)錄起始位點；轉(zhuǎn)錄中止于固定的位點，稱之為中止子。對于原核生物，一個轉(zhuǎn)錄單元往往包含幾個基因稱為多順反子，而且轉(zhuǎn)錄和翻譯同時進(jìn)行。而對于真核生物則每個轉(zhuǎn)錄單元只有一個基因，甚至只有一個基因的一部分，故真核生物為單順反子；而且真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是分開進(jìn)行的，即在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞質(zhì)中翻譯。 轉(zhuǎn)錄的起始是由DNA的啟

53、動子（Promoter)控制的，而中止則是終止子(Terminator)控制的。要了解轉(zhuǎn)錄的機制，必須找到轉(zhuǎn)錄酶，目前已經(jīng)找到了原核和真核生物的轉(zhuǎn)錄酶，轉(zhuǎn)錄的機制也已經(jīng)基本搞清楚。RNA聚合酶聚合酶 轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄過程 轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 是基本內(nèi)容，是目前研究的焦點，是基本內(nèi)容，是目前研究的焦點，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。 原核生物的轉(zhuǎn)錄真核生物轉(zhuǎn)錄相同：要有模板，新鏈延伸方向相同：要有模板，新鏈延伸方向5353，堿基，堿基的加入嚴(yán)格遵循堿基配對原則。的加入嚴(yán)格遵循堿基配對原則。 相異：復(fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。相異：復(fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引

54、物。 轉(zhuǎn)錄時，模板轉(zhuǎn)錄時，模板DNADNA的信息全保留的信息全保留，復(fù)，復(fù) 制時模板信息是半保留。制時模板信息是半保留。 轉(zhuǎn)錄時，轉(zhuǎn)錄時，RNARNA聚合酶只有聚合酶只有5353聚合作用，無聚合作用，無5353及及3535外切外切活性。活性。 轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步?；虮磉_(dá)的終產(chǎn)物：基因表達(dá)的終產(chǎn)物：RNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) RNA合成的酶學(xué)過程合成的酶學(xué)過程RNA合成的起始信號和終止信號，即合成的起始信號和終止信號，即DNA分分子上的特定序列。子上的特定序列。DNA正鏈：與正鏈：與mRNA序列相同的序列相同的DNA鏈。鏈。負(fù)鏈

55、：與正鏈互補的負(fù)鏈：與正鏈互補的DNA鏈。鏈。轉(zhuǎn)錄單位的起點核苷酸為轉(zhuǎn)錄單位的起點核苷酸為+1，起點右邊為下游，起點右邊為下游（轉(zhuǎn)錄區(qū)），轉(zhuǎn)錄起點左側(cè)為上游，用負(fù)數(shù)表（轉(zhuǎn)錄區(qū)），轉(zhuǎn)錄起點左側(cè)為上游，用負(fù)數(shù)表示：示：-1，-2，-3 RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個特定位點模板的一個特定位點，并在另一位點終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個轉(zhuǎn)錄單，并在另一位點終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個轉(zhuǎn)錄單位。一個轉(zhuǎn)錄單位可以是一個基因（真核），也可位。一個轉(zhuǎn)錄單位可以是一個基因（真核），也可以是多個基因（原核）。以是多個基因（原核）?；虻霓D(zhuǎn)錄是有選擇性的，細(xì)胞不同生長發(fā)育階段基因的轉(zhuǎn)錄是有選擇性的，

56、細(xì)胞不同生長發(fā)育階段和細(xì)胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。和細(xì)胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。轉(zhuǎn)錄的起始由轉(zhuǎn)錄的起始由DNA上的啟動子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止上的啟動子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止由由DNA上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄是通過上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄是通過DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的RNA聚合酶來實現(xiàn)的。聚合酶來實現(xiàn)的。DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶 1960年至1961年，科學(xué)家分別從微生物和動物細(xì)胞中分離到了DNA指導(dǎo)下的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase）。大腸桿菌的RNA聚合酶全酶的分子量為460kd由5個亞基組成：2，如果沒有亞基則稱為核心酶(core enzyme)。核心

57、酶只能延長RNA，不能起始，可見亞基對起始和起始序列的識別具有重要作用。此外，在全酶制劑中還帶有一個小分子蛋白，稱為亞基，其生物學(xué)功能不詳。每一個大腸桿菌細(xì)胞大約含有7000個酶分子。亞亞基基分分子子量量(kd)比比例例功功能能1601507037911121和模板 DNA結(jié)合起始和催化部位起始作用未知未知大腸桿菌RNA聚合酶各亞基的大小與功能底物：底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP） RNA鏈生長方向：鏈生長方向：53 不需引物不需引物 需需DNA模板模板 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子 為了研究的方便，我們將轉(zhuǎn)錄的起始核苷酸定為1，其5端的序列稱為上游序列（upstream sequence)

58、，用1，2表示，其3端序列稱為下游序列(down stream sequence)，用+2,+3表示。為了搞清楚起始序列，Pribnow等人用足跡法(foodprint)：即把用限制性內(nèi)切酶片斷和RNA聚合酶共培養(yǎng)，再用DNA酶水解，再把RNA聚合酶保護(hù)的DNA進(jìn)行序列分析，即可以測定出RNA結(jié)合DNA的序列(footprint),測定了數(shù)十個啟動子序列，發(fā)現(xiàn)它們在10的位置有共同的序列：TATAATG,于是他稱之為Pribnow box。后來發(fā)現(xiàn)在-35的位置上還有一個TTGACA的序列(Sextama-box)，是RNA聚合酶的識別序列,又稱為RNA聚合酶識別位點。現(xiàn)在 認(rèn)為：RNA聚合酶

59、在DNA上滑動到-35的位置認(rèn)出起始序列開始松弛結(jié)合，當(dāng)行走到-10位置便和DNA緊密結(jié)合。在起始位點起始轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄過程有幾個重要事件發(fā)生在啟動子上，這些事件主要是由亞基所制導(dǎo)的：1、RNA聚合酶結(jié)合到識別位點上，即-35附近的Sextama-box上。2、移動到起始位點，開始和DNA緊密結(jié)合，這一點就是Pribnow-box。3、建立一個開放的啟動子復(fù)合物（open-promoter complex）終止子和終止因子 提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子(terminator)。協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子稱為終止因子(termination factors)。有些終止 子可以

60、被特異性蛋白因子所阻止，稱為抗終止因子(antitermination factors)。由于抗終止因子的作用轉(zhuǎn)錄酶可以跨過終止位點產(chǎn)生通讀(read through)。 大腸桿菌存在兩種終止子，一類不依賴因子的終止子和一類依賴因子的終止子。兩種類型的終止子請見講義366頁圖206。 正如RNA聚合酶識別起始位點需要因子的幫助一樣，RNA聚合酶識別終止因子也需要一些特殊的輔助因子，已知nus位點即與終止有關(guān)，至少有3個基因位點：nusA、nusB、nusE，其中nusA基因產(chǎn)物的作用研究最多。當(dāng)RNA聚合酶在亞基的作用下識別出轉(zhuǎn)錄起始位點并開始轉(zhuǎn)錄之后，因子即脫落，核心酶開始繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，當(dāng)轉(zhuǎn)錄到