植物生理學實驗

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科學生綜合性實驗報告光合色素的提取、理化性質分離、吸收光譜及含量的測定學號： 134120171 姓名： 王曉蓮學院：生命科學學院專業(yè)、班級 13生物科學C班實驗課程名稱：植物生理學實驗教師及職稱：李忠光開課學期：2015至2016 學年 下 學期填報時間：2016 年 4 月2日云南師范大學教務處編印實驗序號實驗二實驗名稱光合色素的提取、理化性質分離、吸收光譜及含量的測定實驗時間2016.3.15-29實驗室睿智三4281.實驗目的(1)掌握光合色素的提取方法以及了解有關的理化性質。(2)掌握光合色素的分離方法以及了解有關的吸收光譜。(3)

2、掌握用分光光度計測定葉綠素含量的方法2 .實驗原理I光合色素的提取與理化性質光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。提取液中 無任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。離體葉綠素在有氧氣和光照條 件下，發(fā)生光氧化作用，結構遭到破壞，形成加氧葉綠素等產物。葉綠素 是一種雙竣酸酯，可以發(fā)生皂化反應。葉綠素分子中 Mg2+f仆咻環(huán)結合不穩(wěn)定，可以被H+、Cu2大Zn2痔離子所取代。n光合色素的分離與吸收光譜光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子結構、極性、溶解度、支持物對它們的吸附力等不同， 因而分配系數(shù)不同，故彼此可以分開。葉綠素的嚇咻環(huán)結構對光

3、有很強的 吸收，主要是紅光和藍紫光。m 光合色素含量的測定混合液中的兩個或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍 然可以根據(jù) Lambert-Beer定律（A = k L C ）求出各組分含量。Lambert 定律：A = k L; Beer定律A = k C。葉綠素a、b在80炳酮溶?中的Amax: 分別為663nm 645nm 由此得出：見推導過程Ca = 12.7 A 663 2.69 A 645 ；Cb = 22.9 A 645 4.68 A 663Ca+b = 8.02 A 663 + 20.20 A 645,A663 = C a.k al + C b.k blAs45 = C

4、b.k b2 + C a.k a2由于K是一個常數(shù)，而A可以通過分光光度計測出，故求二元一次方 程組可得到此公式。k比吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當物質的濃度 （C）為 1g/L（0.1%）,比色皿的直徑（光徑，L）為1cm時所測出的吸光度即為比吸收 系數(shù)。故其單位為：g.cm£ 摩爾吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當物質的濃度（C） 為 1mol/L,比色皿的直徑（光徑，L）為1cm 時所測出 的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為:mol.cm3 .實驗設備及材料(1)材料鮮植物葉片、丙酮、碳酸鈣、石英砂、 20%KOH甲醇溶液、苯、自來水、50%醋酸、醋酸銅、啟動劑、

5、80%丙酮(2)實驗設備試管、濾紙、研缽、玻璃棒、錐形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、燒杯、漏斗、離心機、便攜式葉綠素測定儀、分光光度計、天平、離心管、滴管4 .實驗步驟I光合色素的提取與理化性質(1)光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/2片葉片，放 入研缽中并加入少許 CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。(2)觀察熒光現(xiàn)象：與光線垂直的方向觀察色素顏色。(3)光破壞作用：1ml色素提取液于室內，1ml于太陽光下，30min后觀 察顏色變化。(4)皂化反應：取一支試管，加入色素提取液 2.5ml,再加入20%KO

6、H 甲醇溶液1ml,搖勻，再加入苯2.5ml,輕輕搖動，沿試管壁慢慢加入自來水1ml,輕輕搖動后觀察，注意觀察整個過程顏色的變化。(5)取代反應：取一支試管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶 液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一 半比較顏色的差異。II光合色素的分離與吸收光譜(1)光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/3片葉片，放 入研缽中并加入少許 CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。(2)光合色素分離：剪取適當長度和寬度的濾紙條- 用上行紙層析法分離色素一 啟動劑：石油

7、醍：丙酮：苯=10: 2: 1(3)吸收光譜的測定光合色素的吸收光譜：取色素溶液1 mL ,加入丙酮3 mL,搖勻后在 分光光度計上400到700 nm處每隔10 nm進行掃描。各色素的吸收光譜：上述層析出的34種色素，分別剪下后溶于3 mL 丙酮中，按上述方法掃描。川光合色素含量的測定方法一：快速測定法由于葉綠素a、b在652nm處有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直 接用便攜式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2方法二：分光光度計法色素提取：將上述植物葉片洗凈并用濾紙吸干，準確稱取已知 的葉圓片 0.05g左右，加入少許CaCO3和石英砂及

8、80%丙酮2ml,充分研磨，轉入 離心管中(離心機使用)，再用5ml 80%丙酮洗研缽，轉入離心管中，平衡, 5000rpm離心10min,記錄上清液體積，取1ml稀釋到4ml。測定：以1cm比色皿分別測定 A663、A645。使A控制在0.1 0.8之間。5.實驗結果及分析I光合色素的提取與理化性質一層：淺黃綠色(1)皂化反應：溶液分為三層 二層：淺綠色i三層：深綠色輕輕搖晃過程中：第一層由淺綠色逐漸變?yōu)辄S綠色第二三層逐漸變?yōu)橐粚?，深綠色在第一層下面出現(xiàn)一層油滴層原因：葉綠素是一種由葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起 皂化反應而生成甲醇和葉綠醇及葉綠酸鹽，產生的鹽能溶于水中，可用此

9、 法將葉綠素與類胡蘿卜素分開(2)熒光現(xiàn)象的觀察用肉眼可以觀察到葉綠素提取液在直射光照射下，反射光為藍綠色，透射 光為深紅色原因：葉綠素吸收光量子而轉變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定, 當它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產生熒光；反射光呈藍綠色是 因為葉綠素對藍綠色光的吸收很少，而對于其他顏色光的吸收很多，所以 會呈現(xiàn)出藍綠色的反射光II光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離如圖所示將涂有葉綠體色素的濾紙放入層析液后，葉綠體色素隨層析液沿濾紙向上推進，在濾 紙上分為四個條帶，其顏色由下至上分別為黃綠色、藍綠色、黃色、橙黃色，由資料 可知由下至上依次為葉綠素b、葉綠素a、葉黃素、胡蘿卜

10、素；其中藍綠色條帶最寬， 黃綠色條帶次之，黃色、橙黃色條帶較細，說明葉綠體中含量較多的是葉綠素a和葉綠素bo吸收光譜（附圖）川光合色素含量的測定方法一：快速測定法序號1234平均值含"JU (mg/dm2)31.630.531.627.630.3方法二：分光光度計法波長(nm)663645含量(A)0.2070.077Ca = 12.7 A 663 2.69 A 645 I> G=2.42mg/LCb = 22.9 A 645 4.68 A 663=>Cb=0.79mg/LC a+b=8.02A663+20.20A645: C -a+b=3.12mg/L各葉綠素含量：V=

11、10ml W=0.05g由公式：Chl content= C V (mg.g-1FW)WChla=484mg.g-1FWChlb=158mg.g1 FW6、思考題1、為什么在皂化反應中只能用 20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH 水溶液？因為色素不能溶于水，甲醇其實在這里只是當做溶劑使用，化學中有“相 似相容”，色素是有機物所以只能溶于有機溶劑2、光合色素的吸收光譜對我們理解光合作用有何意義？葉綠體色素的吸收光譜的來年改革峰值分別在430nm左右和660nm左右?；静晃站G光，因而綠光被反射而是葉子（大部分）顯綠色。也就 是說主要吸收這些波長的光的能量在葉綠體內合成植物所需要的物質。3

12、、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能植物含有幾種類型的葉綠素，它們之間的差別在于炫側鏈的不同。 大多 數(shù)能進行光合作用的細胞還有第二種類型的葉綠素，即葉綠素b或葉綠素c。在高等植物的細胞中含有葉綠素 b,而在其它一些類型的細胞中含有葉綠 素c。不同類型的葉綠素對光的吸收也是不同的，如葉綠素 a最大的吸收 光的波長在420663nm,葉綠素b的最大吸收波長范圍在460645nm。當 葉綠素分子位于葉綠體膜上時，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會使光 吸收的特性稍有改變。4、一般正常的植物葉片，Chla / Chlb = 3 / 1,你所測定的結果符合此比例 嗎？Chla=484mg.g1FWC

13、hlb=158mg.g1FW符合5、兩種測定方法含量有何不同？為什么？快速測定法用便攜式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，局部含量測定。比較準確，但不便于整體測定，取樣多次平均值也不能代表整體 葉綠素含量；分光光度計法采用低雜散光，高分辨率的單光束單色器，保證了 波長準確度.波長重復性和更高的分辨率，自動調0%T和100%T,自動調波 長用多種方法的數(shù)據(jù)處理功能，高分辨，寬大的樣品糟，可容納100mm，光徑 吸收池和相應的反射附件，儀器配有標準的RS-232雙向通訊接口，可外接 打印機，打印相應的實驗數(shù)據(jù).個性代的外形設計，輕觸式按鍵使操作更為方 便.可見分光光度計廣泛應用于醫(yī)藥，衛(wèi)生，化工，學校，生物化學，石油化工，質 量控制，環(huán)境保護及科研實驗室等