PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的研究

1、 計劃編號： 國家質(zhì)檢總局科技計劃項目 建 議 書項 目 名 稱：PCR技術(shù)檢測食品中金黃色葡萄球菌的研究專 業(yè) 類 別： 食 品 安 全 建 議 單 位： 內(nèi)蒙古國際旅行衛(wèi)生保健中心（蓋章） 起 止 時 間： 2007 年 7月 2010 年 7 月 項目負(fù)責(zé)人： 孫 志 （簽名） 填 表 日 期： 2007 年 3 月 12 日 填 報 說 明一、國家質(zhì)檢總局科技計劃項目建議書各項內(nèi)容要實事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達明確、嚴(yán)謹(jǐn)。二、建議書原件一式三份，由項目建議單位填寫并經(jīng)各有關(guān)直屬掛靠單位、直屬檢驗檢疫局及省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技管理部門簽署意見后，報送國家質(zhì)檢總局科技司科技管理處。未蓋公章者

2、，不予受理。三、建議書中計劃編號和國家質(zhì)檢總局科技主管部門審批意見由國家質(zhì)檢總局科技主管部門填寫。四、“申請項目經(jīng)費預(yù)算表”填寫說明：1、 科研業(yè)務(wù)費：外單位的計算、測試分析費，國內(nèi)調(diào)研費，本項目的資料、報告、論文印刷費，科技成果查新、驗收（鑒定）費、申報專利費。2、 實驗材料費：試驗用動植物、原材料、試劑、藥品等消耗性物品購置費。3、 儀器設(shè)備費：小型專用儀器設(shè)備購置費，自制儀器設(shè)備的材料、配件和外協(xié)加工費。4、 協(xié)作費：指給付外單位協(xié)作者的驗證協(xié)作經(jīng)費。5、 其他費用：其他需要支付的合理費用。一、研究的目的、意義食品安全是一個全球性重大問題。其中，食物中毒是影響食品安全性的一個重要因素。據(jù)

3、國內(nèi)外統(tǒng)計，在各種食物中毒中，細(xì)菌性食物中毒最多。研究表明，金黃色葡萄球菌污染食品后可引起毒素型食物中毒。據(jù)美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性食物中毒居第一位，占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則高達45%，由此造成的經(jīng)濟損失也相當(dāng)慘重。我國是一個食品生產(chǎn)和消費大國，隨著市場經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的提高，特別是加入WTO后，市場經(jīng)濟的多元化和進出口貨物總量的擴張速度加快，消費者對食品安全更加關(guān)注，食品安全與食品貿(mào)易的關(guān)系更為密切，提高我國食品安全水平的要求越來越迫切，為確保食品安全與食品貿(mào)易，檢驗檢疫系統(tǒng)需要大力加強食品檢驗的力度，建立快速高效的檢驗運轉(zhuǎn)機制。而傳統(tǒng)的檢驗方

4、法已不適合時代發(fā)展的要求，市場迫切需要建立快速、靈敏的金黃色葡萄球菌的檢驗方法。因此，改進檢驗檢疫方法，提高檢測水平和工作效率，縮短檢驗檢疫流程，加快速度，是我國乃至國際檢驗檢疫工作中的一個重要問題。本研究主要針對金黃色葡萄球菌的致病特點，根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（Tnase）的基因nuc序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，建立起方便、快速、靈敏、實用的檢測食品中金黃色葡萄球菌的PCR方法，以縮短食品中金黃色葡萄球菌引起食物中毒的檢測時間，提高檢測方法的靈敏性，為金黃色葡萄球菌引起食源性疾病的快速診斷提供技術(shù)支持。二、 內(nèi)外同類研究現(xiàn)狀分析及存在的問題（含科技查新結(jié)果）金黃色葡萄球

5、菌Staphylococcus aureus，可以產(chǎn)生多種致病因子，包括溶血毒素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶、脫氧核糖核酸酶、腸毒素及溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。它們通過損傷血小板，破壞溶酶體，破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用及沉積或凝固血液或血漿中的纖維蛋白等方式，引起肌體局部缺血和壞死或急性胃腸炎等多種機體病變。引起金黃色葡萄球菌食物中毒的致病物質(zhì)主要是腸毒素（enterotoxin）腸毒素根據(jù)抗原性分為A、B、C1、C2、D、E和F等8個血清型。腸毒素是蛋白質(zhì)，溶于水，相對分子質(zhì)量約為30000，耐熱，食品中的毒素不因加工而滅活；對蛋白酶也有耐性，故在消化道中不

6、被破壞。此毒素還可引起猴、貓嘔吐，可能是毒素作用于腸道神經(jīng)受體后，刺激嘔吐中樞所致。A型腸毒素是最常見的與疾病有關(guān)的毒素，B型次之，C型較少，D型主要存在于污染的乳制品中。B型毒素能引起金黃色葡萄球菌偽膜性腸炎。目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生法定檢驗項目。我國對金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789-10-94及檢驗檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0172-92作為依據(jù)。金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測主要有動物試驗、血清學(xué)試驗、免疫熒光試驗及酶聯(lián)免疫吸附等方法，其主要依賴于免疫學(xué)技術(shù)，由于食品衛(wèi)生學(xué)和臨床診斷的原始樣品，一般不是純菌株的培養(yǎng)物，且混有大量的雜菌，常規(guī)鑒定方法通常要從樣

7、品中進行純培養(yǎng)，步驟繁多，致使實驗周期延長，整個檢測過程獲得最終結(jié)果需時5d左右，既費時又費力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時出運，并使貨主的倉儲成本提高，造成較大經(jīng)濟損失，使其在食品衛(wèi)生學(xué)鑒定時受到限制。近年來PCR技術(shù)的發(fā)展為食品中病原微生物的鑒定提供了新的途徑。目前國外利用PCR法檢測金黃色葡萄球菌已在醫(yī)學(xué)上取得了很大成功。而在食品中對金黃色葡萄球菌檢測起步較晚。我國已將PCR檢測應(yīng)用到了醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域中，但PCR檢測食品病原菌的研究工作起步較晚，還不成熟，至今國內(nèi)極少有利用PCR技術(shù)檢測食品（乳品）中金黃色葡萄球菌的研究。由于金黃色葡萄球菌外毒素基因位于金黃色葡萄球菌基因組上，以制備的

8、基因組DNA為模板，根據(jù)金黃色葡萄球菌外毒素基因序列設(shè)計引物，建立起金黃色葡萄球菌外毒素基因的PCR鑒定技術(shù)，在短時間內(nèi)可以鑒定出食品中是否存在金黃色葡萄球菌。然而利用PCR法檢測食品中的金黃色葡萄球菌所選取的靶基因主要為各型腸毒素的基因，而腸毒素分型較多，給實際檢測工作帶來不便。而利用其耐熱核酸酶（Tnase）的基因nuc作為靶基因，則更有利于實際檢測。注：科技查新結(jié)果見附件（查新報告）三、研究內(nèi)容及預(yù)期達到的最終目標(biāo)（主要技術(shù)、經(jīng)濟指標(biāo)與研究結(jié)果）本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容：1、探尋從乳樣品中直接提取金黃色葡萄球菌DNA的有效方法，省略前增菌純化步驟，并消除PCR反應(yīng)抑制因子，以縮短檢測

9、時間和提高檢測的準(zhǔn)確性。檢測樣品DNA模板的精確獲取技術(shù)是食品中致病微生物快速檢測研究的瓶頸，此項研究將為食品中致病微生物快速檢測技術(shù)的發(fā)展提供有力支撐。2、采用編碼產(chǎn)毒金黃色葡萄球菌共有的耐熱核酸酶（Tnase）的基因nuc作為靶基因，設(shè)計引物，以提高此檢測方法的通用性。耐熱核酸酶（Tnase）為產(chǎn)毒金黃色葡萄球菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100加熱30min，不易喪失活性。而編碼耐熱核酸酶的基因nuc為致病金黃色葡萄球菌所特有的并且是高度保守的基因，因而以耐熱核酸酶的基因nuc為靶序列，進行PCR擴增是檢測金黃色葡萄球菌的有效手段。3、摸索并優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，以建立一種適用于乳品等行業(yè)

10、鑒定金黃色葡萄球菌的方便、可靠、快速的檢測方法，制作出專適于乳品行業(yè)鑒定金黃色葡萄球菌的快速檢測試劑盒。本研究預(yù)計取得以下研究結(jié)果：1、從乳樣品中直接提取金黃色葡萄球菌DNA的有效方法。2、建立一種適用于乳品行業(yè)鑒定金黃色葡萄球菌的方便、可靠、快速的檢測方法，制作出專適于乳品行業(yè)鑒定金黃色葡萄球菌的快速檢測試劑盒。3、初步建立以乳源為主的金黃色葡萄球菌菌種數(shù)據(jù)庫；4、在國內(nèi)期刊發(fā)表文章3-4篇。項目完成后擬提交的樣品(樣機)、技術(shù)文件及相關(guān)資料清單1、從乳樣品中直接提取金黃色葡萄球菌DNA模板的試劑配方及操作方法；2、專適于乳品行業(yè)鑒定金黃色葡萄球菌的快速檢測試劑盒的試劑配方及操作方法；3、以

11、乳源為主的金黃色葡萄球菌菌種數(shù)據(jù)庫的菌株清單；4、3-4篇國內(nèi)期刊發(fā)表的文章清單。四、采用的研究、試驗方法和技術(shù)路線（包括工藝流程）提取各個標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA采用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株對設(shè)定引物的PCR反應(yīng)條件進行選擇和優(yōu)化用表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌作對照進行PCR擴增檢測引物對金黃色葡萄球菌特異性 采用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株 采用生理生化的方法探尋從乳樣品中直接獲取 乳中金黃色葡萄球菌分離鑒定金黃色葡萄球菌DNA模板 的有效方法 建立以乳源為主的 金黃色葡萄球菌菌種數(shù)據(jù)庫 提取金黃色葡萄球菌各個菌株DNA(做模板) 用設(shè)計引物進行PCR

12、擴增 檢測引物對乳中分離出的金黃色葡萄球菌 不同菌株的普遍適用性 - 根據(jù)已總結(jié)出的從乳樣品中直接獲取金黃色葡萄球菌DNA模板的方法，對從乳中分離出的金黃色葡萄球菌各個菌株分別處理獲取模板，進行PCR擴增,檢測引物對金黃色葡萄球菌不同菌株的靈敏度五、項目年度計劃內(nèi)容及考核目標(biāo)內(nèi)容（每欄限125字）2008年度1、試驗的準(zhǔn)備：包括訂購試劑、購買菌種和資料查新等。2、采用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株對設(shè)定引物的PCR反應(yīng)條件的進行選擇和優(yōu)化。3、對表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌分別提取DNA進行PCR擴增，檢測引物對金黃色葡萄球菌特異性。20

13、09年度1、采用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株探尋從乳樣品中直接獲取金黃色葡萄球菌DNA模板的有效方法。2、對乳中的金黃色葡萄球菌進行分離，采用生理生化的方法進行鑒定。3、發(fā)表論文2篇。2010年度1、對從乳中分離出的金黃色葡萄球菌各個菌株提取DNA進行PCR擴增，以檢測引物對金黃色葡萄球菌不同菌株的普遍適用性2、根據(jù)已得出的從乳樣品中直接獲取金黃色葡萄球菌DNA模板的方法，對從乳中分離出的金黃色葡萄球菌各個菌株分別處理獲取模板，進行PCR擴增，檢測引物對金黃色葡萄球菌不同菌株的靈敏度。3、發(fā)表論文1-2篇，申請國家專利1-2項。4、總結(jié)實驗資料，撰寫結(jié)題報告。六、準(zhǔn)備工作情況（已有的工作基礎(chǔ)、儀器設(shè)

14、備及安全措施）1、 主持牛乳中芽孢桿菌的動態(tài)變化及部分生物學(xué)特性的研究；（自選項目，已完成）2、 主持馬奶酒乳酸菌胞外多糖生物合成條件的研究；（自選項目，已完成）3、 主持內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)螺旋藻多糖生物活性作用的研究；（內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目，在研）4、 主持馬奶酒生物活性的研究；（內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目，已完成）5、 主持PCR技術(shù)檢測編碼綠膿桿菌外毒素A基因；（自選項目，已完成）6、 主持鹿蹄草素對金黃色葡萄球菌抑制作用及其抑菌機理的研究；（自選項目，已完成）7、 參加生物活性乳及其制品的研究（國家自然科學(xué)基金項目，已完成）8、 牛乳中金黃色葡萄球菌生物學(xué)特性的研究”(自選在研項目)。如

15、果項目活的資助，主要研究內(nèi)容可在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物工程國家教育部重點實驗室完成，并且具備具有雄厚實力的技術(shù)力量。七、經(jīng)費預(yù)算申請資助總金額（萬元）2008 年2009 年2010 年30101010其他經(jīng)費來源及金額（萬元）內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院已資助1萬元用于自選項目“牛乳中金黃色葡萄球菌生物學(xué)特性的研究”(在研課題)。經(jīng)費支出明細(xì)金額（萬元）計算根據(jù)及理由1、科研業(yè)務(wù)費；6.0國內(nèi)調(diào)研費:1.5外單位的計算、測試分析費等:2.0驗收（鑒定）費、申報專利費等:2.0資料、報告、論文印刷費及科技成果查新費等:0.52、實驗材料費；17.5試驗用動植物、原材料等:2.0試劑、藥品等消耗性物品:15.53、儀器設(shè)備費；1.5小型專用儀器設(shè)備購置費:1.0自制儀器設(shè)備的材料、配件和外協(xié)加工費等:0.54、協(xié)作費；1.5驗證協(xié)作經(jīng)費等5、其他費用3.5勞務(wù)費、津貼費等八、參加單位、人員及任務(wù)分工單位人員名稱出生年月職稱/職務(wù)專業(yè)特長任務(wù)分工內(nèi)蒙古國際旅行衛(wèi)生保健中心孫 志1962.03.01主管醫(yī)師食品檢驗檢疫項目主持內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)殷文政1959.03.23教 授食品安全及食品微生物的研究與應(yīng)用項目負(fù)責(zé)內(nèi)蒙古國際旅行衛(wèi)生保健中心郭文繡1975.09碩士、工程師分子生物學(xué)主要參加內(nèi)蒙古國際旅行衛(wèi)生保健中心云華1962.09.24主管檢驗師醫(yī)