基因工程知識要點

1、第一章1.基因工程:是在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物體（供體）的基因或基因組提取出來，或者人工合成的基因，按照人們的愿望進行嚴密的設計，經(jīng)過體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體（受體）的細胞內(nèi)，使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術。2.基因工程的基本過程為哪些？切接轉(zhuǎn)增檢 獲得目的基因：從供體細胞分離出基因組DNA，用內(nèi)切酶將外源DNA切開。切（同時選擇運載目的基因的載體） 目的基因與載體DNA拼接：用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子。 接 重組體分子導入受體細胞：借助于細胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導入受體細胞中。轉(zhuǎn) 短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細

2、胞，以擴增DNA重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中。 增 篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞。 檢3.哪些基因是真核生物特有的？ 假基因：核苷酸序列同其相應的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。 基因家族：由功能相關的基因成套組合形成 重復序列哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移動基因、重疊基因第二章1. 寄主細胞控制的限制與修飾宿主控制限制核酸限制性內(nèi)切酶宿主控制修飾修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶以(k)噬菌體侵染E.coli B菌株為例解釋寄主控制與修飾的現(xiàn)象。（簡述寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。v 大多數(shù)細菌的噬菌體侵染都存在著

3、一些功能性障礙。所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶修飾 另一種是核酸內(nèi)切限制酶限制R/M體系的作用：v 保護自身的DNA不受限制；v 破壞外源DNA使之迅速降解；2. 簡述型、型和型核酸內(nèi)切酶的基本特性。（1）型酶基本特性 有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性互斥 需要ATP、SAM（S腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+輔助因子； EcoB和EcoK是由三種不同亞基組成。多肽鏈：特異性亞基，識別DNA序列的活性。多肽鏈：修飾亞基，具有甲基化酶活性。多肽鏈：限制亞基：具有核酸內(nèi)切酶活性 有特定的識別位點 切割方式：結合在識別位點，以滾環(huán)

4、形式沿著DNA分子轉(zhuǎn)位，從距識別位點5 一側幾千bp處隨機切割分子，無特異性。（2） 型酶：有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性分開反應能識別專一的核苷酸序列，并在固定位置上切割識別序列的核苷酸對順序呈回文結構（那項具有回文結構：識別位點的DNA序列呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱 ）切割可形成兩種核苷酸切割末端粘性末端和平末端。粘性末端定義 ：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，能通過互補堿基間配對而重新環(huán)化起來。（3）型酶： 由兩個亞基組成的蛋白質(zhì)復合物，即同時具有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性 需Mg 2+、ATP、SAM輔助因子可識別特定堿基順序，并在這一順序的3端24 26bp處切開，所以

5、它的切割位點也是沒有特異性的4. 同尾酶：指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。同裂酶：指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。星號活性：同一限制酶當某些反應條件變化時酶的專一性發(fā)生改變，即酶切位點專一性改變的活性。包裝上標“”注明。5.DNA缺口平移、取代反應的概念DNA缺口平移：在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。（概念：當外切酶活性從缺口的5一側移去一個5核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3一側補上一個新的

6、核苷酸，但Pol不能在3-OH和5-P之間形成一個鍵，隨著5一側的核苷酸不斷移去， 3一側的核苷酸又按序列增補，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動。） 用途：通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。取代反應：如果在反應混合物中僅存在一種dNTP，則此酶的35 的外切酶活性將從ds DNA的3端降解，直到互補于該dNTP的堿基出現(xiàn)為止，然后在該位置發(fā)生合成和取代反應。6.各DNA聚合酶的基本特性及其區(qū)別；（1）大腸桿菌DNA聚合酶（Pol）的酶活性 5 3的聚合酶活性：需Mg2+ 5 3的外切酶活性：可以從游離的5-OH末端水解DNA分子(修復作用) 3 5的外切酶活

7、性（較低）：從DNA鏈的3-OH末端向5水解DNA(校對作用)用途：主要功能參與DNA的合成，起到修復作用；Pol同DNA分子克隆的關系最為密切。（2）Pol的Klenow片斷 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性 無53 外切酶活性。Klenow片斷的主要用途： 修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3隱蔽末端； 標記DNA片斷的末端； cDNA克隆中的第二條鏈cDNA的合成； DNA序列的測定。（3）Pol（參與DNA修復過程）酶活性： 53的聚合酶活性：要求模板是雙鏈DNA，中間有空隙的單鏈DNA部分，且空隙部分不長于100 bp； 具有35 的外切酶活性，無53 外切酶活性； 主要在DNA

8、的損傷修復中有一定的作用（4）Pol 聚合作用：是細胞內(nèi)DNA復制所必需的； 35 的外切酶活性，底物是單鏈DNA； 53 外切酶活性，底物是單鏈DNA。（5）T4 DNA聚合酶 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性； 無53 外切酶活性； 取代反應:在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止；（6）T7 DNA聚合酶 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性（是klenow片段的1000倍）； 無53 外切酶活性；（7）耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）（選擇題） 具耐高溫的特性，最適活性溫度為72，連續(xù)保溫30min仍有活性，一次加酶即可滿足PCR反應全過程的需求； Mg 2+

9、依賴酶；具有聚合酶活性；具有53 外切酶活性，無35 外切酶活性 SDS完全抑制其酶活性。（8）反轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA的聚合酶。 多肽鏈具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNase H活性； 多肽鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性。 以mRNA為模板合成cDNA；在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條cDNA。7.連接酶所需的條件供能分子、磷酸基團和羥基。概念：能夠催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。即能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3-羥基（ OH ）和5-磷酸基團（-P），在供能分子的作用下，形成磷酸二酯鍵。需要三種成分參與：3-OH，5-P，提供能量的

10、分子供能分子：NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核酸）在E.coli等細菌中選用ATP（腺苷三磷酸）動物細胞、噬菌體中選用注： 只能連接缺口（nick）； 不能連接裂口（gap）； 而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。8.缺口：在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。裂口：在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的單鏈斷裂。9、堿性磷酸酶：將DNA末端的5端磷酸基除去，使其5端變成3羥基，能防止自身環(huán)化。作用：（1）去除DNA和RNA的5”-磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用32PATP進行末端標記，繼而進行序列分析。（2）去除載體DN

11、A5”-磷酸基，防止自身環(huán)化，降低本底，提高重組DNA檢出率。 發(fā)夾結構：10、末端轉(zhuǎn)移酶特性： 催花dNTP添加到3-OH端，且不需模板； 需Co 2+。用途： 給載體或cDNA加上互補的同聚尾； 標記3末端。第三章1、基因載體：離開染色體的外源DNA不能復制，而插入的外源DNA可作為復制子的一部分在受體細胞中進行復制，這種復制子就是外源基因的載體。 2、報告基因：有特殊意義的基因，重組子轉(zhuǎn)入宿主細胞中，可依據(jù)報告基因從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑選出來。2、載體應具備的特性： 能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的DNA自我復制，插入外源基因后，仍保持穩(wěn)定的復制狀態(tài)； 易于從宿主細胞中分離，并行純化；

12、 載體DNA序列中有單一的酶切位點，并位于DNA復制的非必需區(qū)內(nèi)； 具有能夠觀察的表型特征，如報告基因（遺傳標記），插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇標志。3、載體的致死效應：利用載體進行克隆時，有時可能對大量的克隆化基因和克隆化基因產(chǎn)物可能有害，宿主細胞呈現(xiàn)致死效應。如大量表達目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。3、R1質(zhì)粒和Col E1-K30質(zhì)粒 R1質(zhì)粒Col E1-K30E.Coli中嚴緊型松弛型奇異變形桿菌中松弛型嚴緊型4、質(zhì)粒構型：常見的構型: SC > L > OCA. 共價閉合環(huán)形DNA(cccDNA):呈現(xiàn)超螺旋的SC構型B. 開環(huán)DNA(

13、ocDNA):即OC型。C. 線性DNA(lDNA):即L型。根據(jù)寄主細胞所含的拷貝數(shù)多少質(zhì)粒分為嚴緊型和松弛型。5、質(zhì)粒的種類F質(zhì)粒：又叫F因子、性質(zhì)粒或致育質(zhì)粒。是最具代表性的單拷貝的接合型質(zhì)粒，共編碼著19個轉(zhuǎn)移基因。R質(zhì)粒：又稱抗藥性因子，它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因。Col質(zhì)粒：產(chǎn)生大腸桿菌素因子，編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。屬非結合質(zhì)粒。6、Col E1質(zhì)粒的遷移作用：由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移的過程。其中參與遷移的有兩種基因：bom 基因：位于Col E1DNA上的特異位點mob 基因：Col E1質(zhì)粒特有的，其編碼的核酸酶作用于bom位點7、細菌質(zhì)粒的

14、不相容性在同一個大腸桿菌細胞，一般不能同時含有兩種不同的質(zhì)粒。也稱為質(zhì)粒的不親和性。是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。8、質(zhì)粒的報告基因應用類型：插入失活效應；互補簡述如何應用插入失活和-互補（藍白篩選）來篩選重組子pBR322質(zhì)粒載體有:抗氨芐青霉素基因(ampr);抗四環(huán)素基因(tetr) 互補：LacZ（半乳糖苷酶基因）有兩個主要的亞基，亞基 和 亞基， 與 相結合就能表現(xiàn)出半乳糖苷酶活性，能將無色底物X-Gal 變成藍色。片段基因coli基因組 - 肽基因質(zhì)粒Ø 將含有- 肽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到coli上（ - 互補）

15、，形成藍色菌落；Ø 插入外源基因，使- 肽編碼區(qū)被破壞，LacZ失活則形成白色菌落。 利用- 互補（藍白斑篩選）進行重組子的篩選。9、如何對質(zhì)粒進行人工改造，使其成為載體。（1）減小分子量：可容納外源DNA更長；（2）改造內(nèi)切酶位點，具有若干限制酶切單一位點的多克隆位點（人工合成且密集排列）；（3）插入外源基因后，較易導入宿主菌內(nèi)復制和表達，且不會因接觸而轉(zhuǎn)移到另一個細菌；（4）具有一個或幾個報告基因?？寺≥d體：復始起始點、遺傳標記、多克隆位點10、pBR322和pUC質(zhì)粒的各組成部分的來源分別是什么？（1）pBR322主要組成部分的來源 親本：pMB1和pSF2124 ; ampr

16、基因來源于pSF2124； tetr基因來源于Psc101; 復制起點（ori）Col E111、穿梭質(zhì)粒：是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質(zhì)粒載體。專 題 核酸分子的提取及核酸凝膠電泳2、簡述提取質(zhì)粒DNA 的原理及步驟。堿變性法原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。步驟：材料的準備 破碎細胞或包膜，使內(nèi)容物釋放 核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，去除雜質(zhì) 核酸溶解在適量緩沖液或水中3、 如何防止RNase污染？ 塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上，高溫滅菌后，180烘干6h以上。 在超凈工作臺

17、上操作。 操作時帶一次性手套和口罩。 提取緩沖液中加入RNase抑制劑。1、溫和噬菌體：既可引起宿主細胞的裂解死亡，又可將其核算整合到細菌染色體上，使細菌細胞繼續(xù)生長繁殖，并被溶溶原化的噬菌體。 烈性噬菌體：將噬菌體感染的記住細胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，能產(chǎn)生出大量子代噬菌體。溶原化：用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細菌的過程。噬箘粒：由質(zhì)粒載體和單鏈噬菌體載體結合而成的新型的載體系列，稱為噬菌粒載體?？滤官|(zhì)粒：一類由人工構建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。載體，也稱粘粒、柯斯載體。4、 PAGE、瓊脂糖凝膠電泳和脈沖電泳的區(qū)別及其應用范圍。電泳技術用途區(qū)

18、別瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA或總RNA的完整性、對PCR產(chǎn)物進行檢測以及對核酸進行回收和純化分辨100bp50kb的核酸片段聚丙烯酰胺凝膠電泳生物多樣性檢測以及親子鑒定等分辨1bp1000bp的核酸片段脈沖電場凝膠電泳分離大分子量的DNA分子分辨 >50kb的核酸片段2、噬菌體的繁殖方式 溶菌性方式：噬菌體利用宿主的酶類和原料，DNA復制成子代DNA，并裝配呈子代噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的噬菌體。 溶源性方式：感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體DNA上，成為細菌DNA的一個組成部分。3、噬菌體的類型及體外包裝程序（二）體外包裝程序 包裝反應的底物

19、，按照滾環(huán)復制機理合成多連體形式的DNA，在具備噬菌體頭部前體的條件下，從cos位點處被切割成單體分子。 將線性單體分子裝填到頭部外殼里，由于具有粘性末端而發(fā)生環(huán)化。 把頭部和分別組裝的尾部結構連成一體，形成成熟的噬菌體顆粒。4、M13 載體的優(yōu)點和用途;優(yōu)點： 只含單鏈DNA，因此可用作對DNA測序的模板及其它基因克隆實驗，如異源雙鏈DNA分析，互補RNA的分離及DNA序列分析等； 可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補的RNA； RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識別和切割； RF型DNA經(jīng)包裝后分泌到細胞外而不溶菌； 不存在包裝限制問題。用途： 制備測序用單鏈DNA模板； 用于制備雜交

20、探針； 用于定點突變。6、質(zhì)粒、 噬菌體和柯斯質(zhì)粒的包裝限制。（1）噬菌體的包裝能力控制在為野生噬菌體DNA長度（約48.5 kb）的75%-105%。 蛋白質(zhì)外殼容納DNA的能力 噬菌體載體克隆外源DNA的能力（2）柯斯質(zhì)粒：可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。克隆的外源基因可達45kb，比噬菌體大許多。由于包裝限制的緣故，存在最低限值（>30kb）。:噬箘粒特點：Ø 噬菌粒載體的分子量較小，約3000bp；Ø 既有質(zhì)粒的復制起點又有噬菌體的復制起點。在寄主

21、內(nèi)，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒DNA形式復制，形成的雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)的質(zhì)粒特性（選擇性標記、多克隆位點等Ø 在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體，包裝成噬菌體顆粒后被擠出寄主細胞。Ø 用噬箘?？寺NA進行測序，免去從質(zhì)粒到噬菌體這一亞克隆步驟。（分子量小、克隆能力大；能穩(wěn)定遺傳；可用來制備單、雙鏈DNA。）（一）聚合酶鏈式反應（PCR）1、 原理：雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈的DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，引物與互補DNA結合后，經(jīng)單鏈雜交復性，并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNT

22、Ps）按53方向?qū)⒁镅由?，合成新生的DNA互補鏈。2、 反應過程：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。 變性：通過熱處理將待擴增模板的雙鏈DNA變性裂解成單鏈DNA; 退火：降低溫度，使單鏈靶序

23、列與寡核苷酸引物雜交結合； 延伸：在適當條件下，DNA聚合酶使引物延伸，產(chǎn)生新的雙鏈。723、反應體系和反應條件PCR反應體系：模板：DNA；引物：P1 P2；DNA聚合酶：Taq；原料：dNTP；反應緩沖液；輔助因子：Mg2+Mg2+ 的作用：Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反應體系。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應特異性。 Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。4、 引物二聚體：一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段

24、。（引物之間或引物自身存在互補序列）7、Southern 雜交的原理毛細管作用：用限制性內(nèi)切酶將DNA消化成一定大小的片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，再用毛細管轉(zhuǎn)移等方法將變性的DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后用標記的ssDNA（單鏈DNA）或RNA探針對固定在濾膜上的DNA進行雜交。操作程序：用凝膠電泳分離DNA片段 用堿變性也預處理凝膠，并將其放在兩端浸在緩沖液中的濾紙上 在凝膠上覆蓋一張濾膜 濾膜上加一疊干濾紙，并放上重物 穩(wěn)定DNA片段，并用X光膠片曝光后得放射自顯影照片，并與凝膠譜帶比較為何在轉(zhuǎn)移之前需要進行堿變性處理凝膠？使DNA片段保持單鏈狀態(tài)而易于同探針分子發(fā)生雜交作用。8、S

25、outhern用途：（1）掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置；（2）構建DNA分子的遺傳圖（3）分析基因組DNA消化片段、相互關系及長度的多樣性（4）轉(zhuǎn)基因生物基因組中外源基因整合及整合位點的鑒定（5）基因操作過程中復雜基因構件的分析鑒定Nornthern blotting（RNA印跡雜交）用途;Ø 檢測真核基因的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄子的分子大小及相對豐度；是研究真核細胞基因表達的強有力手段。注意：防止RNA的降解8、原位雜交（菌落或噬菌斑雜交）的概念及原理：生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。 第六章 基因文庫

26、的構建一、 基因文庫的概念基因文庫：將某種生物的全部基因組的遺傳信息貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料稱為基因文庫。注：基因文庫與基因庫的區(qū)別2. cDNA文庫:指某生物某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的mRNA全部經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆集合。與基因組文庫的區(qū)別：cDNA文庫不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列一、 cDNA文庫的特征 不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū)，不是真正意義上的基因； 僅包含某種組織或細胞正在表達的基因； 基因總量比基因組文庫小得多，易于篩選克隆； 具有時效性，在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)

27、育時期，某一特定組織在某種環(huán)境條件下的基因表達情況，不能包括該生物體的全部基因。2 三種分離mRNA的方法（1） 傳統(tǒng)的分離方法是用oligo (dT)-纖維素柱分離總RNA；（2）把oligo(dT) -磁珠同總RNA混合，在強磁場下分離mRNA（3）用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復合體（溶解細胞）來分離mRNA2、 cDNA 的合成:第一鏈的合成: mRNA, 反轉(zhuǎn)錄酶 oligo(dT) 核酸末端轉(zhuǎn)移酶，dNTPs： 1. oligo(dT) 引導的cDNA合成法 2. 隨機引物引導的cDNA合成法第二鏈的合成: 用RNaseH酶降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA，加入聚合酶，以第一

28、條cDNA鏈為模板，降解的mRNA的段片段為引物合成第二鏈。3 cDNA文庫構建的程序： （1）分離細胞總RNA，從中純化出主要含mRNA的分部；（2）合成第一鏈cDNA； （3）將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA分子；（4）將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導入大腸桿菌寄主細胞增殖。（三） cDNA克隆的優(yōu)越性 以mRNA為材料；（一些RNA病毒，不經(jīng)過DNA中間體，對其研究，cDNA是唯一可行的方法） cDNA文庫的篩選比較簡單易行； 由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低； 克隆在細菌中表達的基因，用作基因序列的測定和發(fā)育過

29、程中或組織中基因特異表達 一、應用mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）原理： 用3 -端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3 -端錨定引物和5-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進行PCR擴增（DDRT-PCR），在標準的序列膠中電泳23小時，可顯示出50100條長度在1005000bp之間的DNA條帶。2. 建立文庫的目的，應用范圍目的： 便于目的基因的保存、擴增和純化； 分離克隆目的基因的主要途徑； 是復雜基因組作圖的重要依據(jù)。應用范圍： 研究基因的結構、功能和篩選基因工程目的基因； 基因定位、基因調(diào)控等方面研究。第七章 目的基因的制取2. 保護基團的作用保

30、證合成反應能夠定向地進行，將不需要參加反應的基團，用保護基選擇性地保護起來，以獲得特定序列。（二） 磷酸三酯法原理 對于參加縮合反應的帶5端保護基團的單核苷酸，其磷酸分子中的一個-OH基團已帶上適當?shù)谋Ｗo基團。余下的另一個具有活性的-OH與另一個帶有3端保護基團的單核苷酸的5 -OH縮合形成具磷酸三酯鍵的二核苷酸分子。（四）用寡核苷酸片段組裝基因的方式1. 小片段粘接法： 將待合成的目的基因分成若干小片段，每段長1215bp，兩條互補鏈分別設計成交錯覆蓋的兩套小片段，然后通過化學方法合成，并退火形成雙鏈DNA大片段。小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段

31、優(yōu)點： 化學合成的DNA片段小，收率高；缺點： 各段的互補序列較短，易在退火時發(fā)生錯配。2. 補丁延長法 將目的基因的一條鏈分成若干4050bp大小的片段，另一條鏈設計成與上述大片段交錯互補的小片段（約20bp的補?。?。兩組不同大小的DNA單鏈片段退火后，用klenow酶將空缺部分補齊，最后用T4 DNA連接酶修復缺口補丁延長法： 根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成20堿基長的單鏈DNA小片段以及40-50堿基長的單鏈DNA中片段優(yōu)點：化學合成與酶促合成相結合的方法 減少寡聚核苷酸的合成工作量； 能保證互補序列的足夠長度。3. 大片段酶促法 將目的基因兩條鏈均分成40-50bp的單鏈DNA

32、片段，分別進行化學合成，然后用klenow和T4 DNA連接酶補平。優(yōu)點：減少拼接模塊數(shù)，適用于較大的目的基因合成。大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7% 。四基因的組裝：按設計要求用許多寡核苷酸片段裝配成完整基因的過程。（三）固相亞磷酸三酯法操作步驟：第8章 DNA體外重

33、組與基因轉(zhuǎn)移體外重組：靠DNA連接酶將適當切割的DNA即目的基因與 其載體共價連接。1 體外連接DNA片段的方法： 用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段。 用T4 DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具有平末端的DNA加上poly (dA) - poly (dT)尾巴后，再用DNA連接酶將它們連接起來。 先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。3. 亞克隆 ：把DNA片段從某一類型的載體無性繁殖到另一類型載體的過程稱為亞克隆。用細菌堿性磷酸酶或小牛腸堿性磷酸酶酶切后的質(zhì)粒，堿性磷酸酶能水

34、解5-磷酸基團產(chǎn)生 5-OH。4.銜接物是指用化學方法合成的一段由10 12 bp組成，具有一個或數(shù)個特定限制酶識別和切割序列的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。2. 銜接物進行平末端鏈接程序：用連接酶將銜接物連接到外源片段兩端-用限制酶酶切成粘性末端-連接酶連接（2）DNA接頭： 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。1. 定向克?。菏雇庠碊NA片段定向插入到載體分子的克隆方案。3.定向克隆的連接方式： 經(jīng)酶切后得到黏端連接（粘-粘連接） 外源DNA與載體DNA的一側為黏端，另一側為平末端（粘-平連接）（三）平-粘端連接法 添補法：對5突出黏端的補齊

35、： 用klenow酶補齊后，用堿性磷酸酶處理防止自身環(huán)化。 消除法：對3突出末端的削平: 用T4 DNA聚合酶的35外切酶活性削平（4） 平-平端連接法用核酸連接酶給平末端加入一小段DNA序列后，成為粘端 ，再用DNA連接酶進行連接。方法：（3）同聚物加尾法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶： 能催化5脫氧核苷三磷酸進行53方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段為引物，在3-OH端加入核苷酸達幾百個。 它作用的底物可以是具有3-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有 3-OH突出末端的雙鏈DNA4 細胞轉(zhuǎn)化：指一種細菌菌株由于捕獲了

36、來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。五大腸桿菌是基因工程重要的實驗菌株，用CaCl2溶液處理大腸桿菌，誘導其呈現(xiàn)感受態(tài)。 六.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)的E.coli細胞捕獲和表達質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。 轉(zhuǎn)染：感受態(tài)的E.coli細胞捕獲和表達噬菌體載體DNA分子的生命過程。1. 宿主菌的要求： 感受態(tài)細胞； 需經(jīng)一定方法處理后，具有接受外源DNA能力的E.coli。 限制性內(nèi)切酶缺陷型，外源DNA進入受體菌不至于被降解； DNA重組缺陷型，可以并保持外源DNA在受體內(nèi)的完整性； 符合安全標準，不適于非培養(yǎng)條件下生存。7 體外包裝轉(zhuǎn)染法:使用體外包裝體系的特殊的轉(zhuǎn)導技

37、術將外源重組DNA分子導入寄主細胞的方法。2. 受體細菌的感受態(tài)感受態(tài)：是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。方法：CaCl2處理，增加細胞膜通透性，便于基因進入細胞。2、 外源目的基因向真核細胞轉(zhuǎn)入（一）借助載體的基因轉(zhuǎn)移 常用重組的動植物病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。(二）脂質(zhì)體導入法 主要用于動物細胞或植物的原生質(zhì)體。（三）血影細胞介導法 哺乳動物的紅細胞（四）電穿孔轉(zhuǎn)移法 主要用于葉綠體或線粒體的基因工程操作（五）基因槍法 主要用于植物細胞的轉(zhuǎn)染（六）微注射法 主要用于動物細胞或植物的原生質(zhì)體，第九章重組體的鑒定與文庫篩選一插入失活效應:將外源基因片段插入到載體后，會使某些選擇記號基因（報告基因）失活的現(xiàn)

38、象。1.抗藥性記號插入失活選擇法 外源DNA片段插入到載體的Tetr 基因，使其失活； 將該重組子轉(zhuǎn)化給大腸桿菌的Amps Tets 菌株，并涂布在Amp瓊脂平板上，可獲得該質(zhì)粒和重組子的寄主細胞均可長成菌落； 將Amp瓊脂平板上的菌落原位影印在Tet瓊脂上生長，對比這兩個平板的菌落生長情況，凡在Amp平板上生長而在Tet平板上不能生長的菌落，即帶有重組體質(zhì)粒的陽性克?。?挑出陽性克隆，擴增分離帶有外源DNA插入片段的重組體質(zhì)粒。第10章 外源基因的表達一外源基因在大腸桿菌中的表達正確表達的基本條件 外源基因不能帶有間隔序列，因而必須用cDNA或全化學合成基因，而不能用基因組DNA； 必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達； 外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架； 通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指導宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白； 利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的毒害。（1） 原核表達系統(tǒng)常用的強啟動子：lac(乳糖啟動子)、trp(色氨酸啟動子)、PR (噬菌體右向啟動子) 、 PL (噬菌體左向啟動子) 、 tac (乳糖和色氨酸啟動子)二影響翻譯效率的因素：SD序列與rRNA 的16