DB53∕T 1059.2-2021 滇金絲猴檢疫技術(shù) 第2部分：毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 1059.22021滇金絲猴檢疫技術(shù) 第 2 部分：毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 2:Technical specifications for laboratory examination of Capillaria2021 - 09 - 30 發(fā)布2021 - 10 - 14 實(shí)施云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布1學(xué)兔兔 標(biāo)準(zhǔn)下載DB53/T 1059.22021目次前言III引言1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語(yǔ)和定義14 縮略語(yǔ)1

2、5 試驗(yàn)原理26 試驗(yàn)條件26.1 實(shí)驗(yàn)室通用要求26.2 人員要求26.3 生物安全要求27 儀器設(shè)備和試劑27.1 主要儀器設(shè)備27.2 主要試劑28 樣品采集與保存39 試驗(yàn)步驟39.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)39.2 PCR 檢測(cè)310 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理310.1 蟲(chóng)卵檢測(cè)410.2 蟲(chóng)體檢測(cè)4附錄 A（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法5附錄 B（規(guī)范性）毛首線蟲(chóng)的基本形態(tài)特征7IDB53/T 1059.22021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件是DB53/T 1059滇金絲猴檢疫技術(shù)的第2部分。DB53/T 1059已經(jīng)發(fā)布了

3、以下部分：第 1 部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；第 2 部分：毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；第 3 部分：隱孢子蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范；第 4 部分：志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。 本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局共同提出。本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC02）歸口。本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院、昆明動(dòng)物園、云南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所。本文件主要起草人：楊建發(fā)、黃艷梅、蒙英雯、朱勛程、衡昭君、楊俊、鄒豐才、陳培富、宋海洋、張譽(yù)方、李云喬、朱尤帥。IIIDB53/T 1059

4、.22021引言滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）是中國(guó)特有珍稀瀕危靈長(zhǎng)類動(dòng)物，屬于國(guó)家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）瀕危物種紅色名錄。編制并發(fā)布DB53/T 1059滇金絲猴檢疫技術(shù)地方標(biāo)準(zhǔn)，推進(jìn)滇金絲猴疫病診斷的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，指導(dǎo)從事野生動(dòng)物保護(hù)相關(guān)的專業(yè)人員按規(guī)范程序?qū)嵤?duì)滇金絲猴相關(guān)病原的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，為滇金絲猴的科學(xué)研究和保護(hù)工作提供病原或疫病調(diào)查的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為滇金絲猴檢疫、疫病監(jiān)測(cè)和防治提供重要的參考依據(jù)，促進(jìn)滇金絲猴繁育和擴(kuò)群， 維護(hù)地區(qū)物種與生態(tài)平衡，提升生物多樣性保護(hù)成效。本文件已發(fā)布4個(gè)部分：第 1 部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

5、。本部分從產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的總則、產(chǎn)氣莢膜梭菌分型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 2 部分：毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的試驗(yàn)原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品采集與保存、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 3 部分：隱孢子蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從隱孢子蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的試驗(yàn)原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 4 部分：志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本部分從志賀桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)涉及的總則、志賀桿菌分類、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制

6、定了規(guī)范。DB53/T 1059.22021滇金絲猴檢疫技術(shù)第 2 部分：毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范1 范圍本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）檢疫技術(shù)中毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的試驗(yàn)原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品采集與保存、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。本文件適用于滇金絲猴檢疫技術(shù)中毛首線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)

7、語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1線蟲(chóng) nematodes線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)為假體腔動(dòng)物，線蟲(chóng)屬通常呈圓柱形，線狀或毛發(fā)狀，某些種類呈鞭狀或球狀。不分節(jié)，兩側(cè)對(duì)稱并具有三胚層假體腔，一般為雌雄異體。蟲(chóng)體大小隨種類不同差別較大，雄蟲(chóng)一般較雌蟲(chóng)小。 寄生性線蟲(chóng)最常見(jiàn)寄生于消化道。3.2毛首線蟲(chóng) trichuris毛首線蟲(chóng)是滇金絲猴最為常見(jiàn)也是危害最大的消化道線蟲(chóng)。蟲(chóng)卵隨滇金絲猴糞便排到外界，在糞便 和土壤中發(fā)育為感染性蟲(chóng)卵；經(jīng)口感染后，幼蟲(chóng)在小腸內(nèi)孵出，鉆入腸絨毛間發(fā)育，然后移行到盲腸和 結(jié)腸內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)。4 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reactio

8、n TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液 Tris Acetate-EDTA Buffer DNA：脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 National Center for Biotechnology Information BLAST：基于局部序列比對(duì)算法的搜索工具 Basic Local Alignment Search Tool1DB53/T 1059.220215 試驗(yàn)原理鏡檢滇金絲猴消化道內(nèi)的毛首線蟲(chóng)蟲(chóng)卵或蟲(chóng)體，依據(jù)其形態(tài)特征鑒定病原；采用PCR方法開(kāi)展分子鑒定。6 試驗(yàn)條件6.1 實(shí)驗(yàn)室通用要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足GB 19489的要求

9、。6.2 人員要求采樣與試驗(yàn)人員具有相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)。6.3 生物安全要求采樣及試驗(yàn)過(guò)程中做好自身防護(hù)，試驗(yàn)結(jié)束后的檢驗(yàn)器具要進(jìn)行消毒處理，廢棄樣品要及時(shí)進(jìn)行無(wú) 害化集中處理。7 儀器設(shè)備和試劑7.1 主要儀器設(shè)備7.1.1 正置光學(xué)顯微鏡。7.1.2 載玻片及蓋玻片若干，漏斗、玻璃棒、燒杯。7.1.3 金屬篩：60 目。7.1.4 PCR 擴(kuò)增儀。7.1.5 高速臺(tái)式離心機(jī)。7.1.6 單道可調(diào)移液器（量程 0.5 µL10 µL、2 µL20 µL、10 µL100 µL 和 100 µL1000 µL）。7.1

10、.7電子天平（量程 0.01 mg10 000 mg）。7.1.8恒溫水浴鍋：36 ±1 ，65 ±1 。7.1.9電泳槽、電泳儀，紫外凝膠成像儀，渦旋振蕩器。7.2 主要試劑7.2.1 飽和食鹽水。7.2.2 2.5%重鉻酸鉀液。7.2.3 基因組 DNA 提取試劑盒。7.2.4 2×Taq PCR Master Mix。7.2.5 DL 2000 DNA Marker。7.2.6 無(wú)菌水。7.2.7 50×TAE 緩沖液：Tris 堿 242 g 和 57.1 mL 冰醋酸，用雙蒸水定容到 1 L。7.2.8 核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。7.2.

11、9 1%瓊脂糖凝膠：1 g 瓊脂糖與 100 mL 1×TAE 緩沖液，加熱融化均勻，加入 10 µL 核酸染料，60 時(shí)，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。2DB53/T 1059.220218 樣品采集與保存糞樣的采集和保存方法見(jiàn)附錄A。9 試驗(yàn)步驟9.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)9.1.1 蟲(chóng)卵檢測(cè)采用飽和食鹽水漂浮法，毛首線蟲(chóng)卵富集在飽和液表面。取糞樣5 g，加飽和食鹽水50 mL，用玻璃棒攪勻，通過(guò) 60目金屬篩或雙層紗布過(guò)濾到干凈燒杯中，靜置0.5 h；蘸取表面液膜，點(diǎn)樣于載玻片上， 蓋上蓋玻片，進(jìn)行鏡檢。9.1.2 蟲(chóng)體檢測(cè)用生理鹽

12、水清洗干凈蟲(chóng)體，放于載玻片，滴加乳酸酚透明液23滴，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下 觀察透明蟲(chóng)體的內(nèi)部形態(tài)構(gòu)造。對(duì)于存疑蟲(chóng)體，結(jié)合下述PCR擴(kuò)增方法對(duì)其進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。9.2 PCR 檢測(cè)9.2.1 DNA 提取和保存取糞樣，用商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取步驟按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1周內(nèi)使 用到的DNA，放置于4 冰箱中；需要長(zhǎng)期保存的DNA，放置于-20 冰箱中。9.2.2 PCR 擴(kuò)增9.2.2.1 PCR 擴(kuò)增引物針對(duì)線蟲(chóng)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基（COXI）基因設(shè)計(jì)引物，此引物靈敏度和特異性較高。上下游引物序列如下：JB3：5-TTTTTTGGGCATCCTGAG

13、GTTTAT-3；JB4.5：5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3。9.2.2.2 PCR 擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增體系為25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，無(wú)菌水10.5 µL，引物JB3和JB4.5 各0.5 µL，DNA模板1.0 µL。9.2.2.3 PCR 擴(kuò)增程序用PCR擴(kuò)增儀設(shè)置反應(yīng)程序，94 預(yù)變性5min；94 變性30s，55 退火45s，72 延伸1min，設(shè)置36個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72 延伸5min，16 結(jié)束反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。9.2.2.4 PC

14、R 產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5 µL，加入1%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL 2000 DNA Marker作為參照， 110 V電壓電泳30 min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像儀中觀察并拍照。若出現(xiàn)預(yù)期的420 bp左右的條帶，擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序后驗(yàn)證。10 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理3DB53/T 1059.2202110.1 蟲(chóng)卵檢測(cè)經(jīng)飽和食鹽水漂浮法鏡檢發(fā)現(xiàn)如附錄B中圖B.1所示的蟲(chóng)卵，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲(chóng)感染陽(yáng)性。若發(fā)現(xiàn)存疑蟲(chóng)卵，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線比對(duì)，判定是否為滇金絲猴毛首線蟲(chóng)感染陽(yáng)性。10.2

15、蟲(chóng)體檢測(cè)對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行鏡檢觀察到如附錄B中B.2描述的蟲(chóng)體，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲(chóng)感染陽(yáng)性。若發(fā)現(xiàn) 存疑蟲(chóng)體，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線比對(duì)，判定是否為滇金絲猴毛首線蟲(chóng)感染陽(yáng)性。4DB53/T 1059.22021附錄A（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法A.1 采樣工具一次性PE手套、自封袋、樣品管、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙等。A.2 糞樣新鮮程度判定將糞便樣品放于自封袋，根據(jù)糞便表面的濕潤(rùn)程度、完整程度以及氣味等條件，判斷糞便樣品的新 鮮程度并記錄。A.3 糞樣的選取原則A.3.1 應(yīng)采集滇金絲猴新鮮糞樣，同一堆糞樣只采集一份樣品，兩堆樣

16、品的距離應(yīng)大于3 m。A.3.2 如遇到滇金絲猴母幼糞樣應(yīng)分開(kāi)采集；依據(jù)母猴和幼猴的糞樣大小有明顯差異作出判斷，并在備注欄記錄。A.4 樣品采集方法A.4.1 采集糞樣外部和內(nèi)部的樣品，每次采樣時(shí)應(yīng)更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。A.4.2 采集時(shí)，直接剝?nèi)》蛛x新鮮糞樣的表層部分和內(nèi)部部分，分別放入自封袋，貼上樣品標(biāo)簽紙， 寫(xiě)上樣品編號(hào)，將樣品管放入自封袋，并再次寫(xiě)上樣品編號(hào)。A.4.3 同一堆糞樣應(yīng)盡量多取樣品。A.5 樣品記錄與編號(hào)在采集糞樣時(shí)，應(yīng)填寫(xiě)滇金絲猴糞樣采集記錄表（見(jiàn)表A.1）。記錄采樣信息包括樣品編號(hào)， 采集管數(shù)，內(nèi)部管數(shù)，外部管數(shù)，種群，采集地名，經(jīng)緯度、海拔，新鮮程度、采集日期，采集人等信 息。表 A.1滇金絲猴糞樣采集記錄表樣品編號(hào)采集管數(shù)內(nèi)部管數(shù)外部管數(shù)種群采集地名經(jīng)緯度、海拔新鮮程度采集日期采集人注：新鮮程度等級(jí)：新鮮、一般、較差。A.6 樣品的臨時(shí)保存野外樣品采回后，有條件在4 下低溫保存，直到樣品送到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室。A.7 樣品的運(yùn)輸和實(shí)驗(yàn)室保存5DB53/T 1059.22021野外樣品采集完成后，應(yīng)于48 h內(nèi)送到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，并盡快進(jìn)行DN