結(jié)合藥效學(xué)優(yōu)選麻荊顆粒中麻黃提取方法

1、結(jié)合藥效學(xué)優(yōu)選麻荊顆粒中麻黃提取方法孟 碩，張 鵬，葛爭艷，金 龍，劉建勛*（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091）摘要： 目的優(yōu)選麻黃最佳提取溶劑和提取方法。方法以麻黃提取物中麻黃堿含量為指標(biāo)，考察水煎法、乙醇回流提取法麻黃堿的提取率，并結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取溶劑和提取方法的優(yōu)選。結(jié)果麻黃醇提提取率為68.39%，水提提取率為62.16，小鼠止咳、祛痰藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)2種工藝均有顯著效果，麻黃水提方法祛痰效果更佳。結(jié)論 水提方法生產(chǎn)更加經(jīng)濟(jì)簡便，最終采用水提方法。 關(guān)鍵詞：麻黃；麻黃堿；提取方法；藥效學(xué)中圖分類號(hào)：R284.2；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼

2、: A 文章編號(hào):1003-9783(2016)01-doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2016.01Combined with pharmacodynamics extraction method preferably Ma Jing granule in Ephedra MENG shuo，ZHANG peng，GE Zheng-yan，JIN Long，LIU Jian-xun*（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital ，China-Academy of Chinese Medical Scie

3、nces，BeiJing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology, Beijing100091,China）Abstract: Objective: to optimize the best extraction solvent and extraction method of ephedra. Methods: the content of ephedrine in ephedra extract as indexes, inspects the reflux water decoction, alcohol extraction rat

4、e of extraction method of ephedrine, combined with pharmacodynamics experiment optimization of extraction solvent and extraction method. Results: the alcohol extract of Ephedra method of Ephedrine Extraction rate is higher, the mice cough, expectorant pharmacodynamics experiment of two kinds of tech

5、nology has significant effect, proposed methods expectorant effect of Ephedra sinica water is better, Conclusion: the method of water extraction and production more convenient economy, finally adopts the method of water extraction. Keyword: ephedra; ephedrine; extraction technology; pharmacodynamics

6、麻荊顆粒組方來源于臨床驗(yàn)方，由麻黃、牡荊油等4味藥組成，本方經(jīng)臨床應(yīng)用多年, 療效顯著，具有止咳平喘祛痰之功效，臨床用來治療咳嗽、哮喘慢性支氣管炎。1 組方中君藥麻黃主要成分為麻黃堿，該成分有治療支氣管哮喘作用，在水和乙醇中均有較好的溶解度2。文獻(xiàn)報(bào)道3常用的提取方法有水煎法、乙醇回流提取法、溫浸法等。前期實(shí)驗(yàn)研究中麻黃采取水提工藝提取，對(duì)中試產(chǎn)品進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：本方具有止咳、平喘、祛痰、抗炎、解熱、抑菌等作用。君藥提取方法和提取效果對(duì)復(fù)方療效的影響較大，本實(shí)驗(yàn)以麻黃堿為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)合小鼠止咳、祛痰藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)考察麻黃水提、醇提對(duì)組方的影響，進(jìn)行麻黃提取方法的優(yōu)選。1 材料1.1 動(dòng)物

7、 ICR種小鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK(京)2012-0001。1.2 藥品及試劑 麻黃藥材，安國神農(nóng)藥材飲片有限公司；鹽酸麻黃堿對(duì)照品，批號(hào)：171241-200506，中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方鮮竹瀝液，批號(hào)：121103，江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司；沐舒坦，批號(hào)：084199，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司；消咳喘片，批號(hào)：120503，哈藥集團(tuán)制藥六廠；咳必清片，批號(hào)：1208016，天津力生制藥股份有限公司；甲醇（色譜純）三乙胺（色譜純），F(xiàn)isher公司。1.3 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀，安捷公司；AB135-S電子天平，Mettler T

8、oledo公司。2 麻黃藥材及麻黃堿提取工藝研究及含量測(cè)定2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以極性乙醚連接苯基鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.092磷酸溶液(含0.04三乙胺和0.02二正丁胺)(1.598.5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為210nm。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。2.2 對(duì)照品溶液制備 取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含297.20g·mL-1的溶液。2.3方法學(xué)驗(yàn)證2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，分別配成29.72，59.44，89.16，178.32，237.76，297.20g·mL-1 對(duì)照品溶液。吸

9、取上述各對(duì)照品溶液10 L 注入液相色譜儀，依法測(cè)定，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y = 19.487X+ 2.1791，相關(guān)系數(shù)r = 0.9999。 結(jié)果表明：鹽酸麻黃堿在0.29722.9720g與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為297.20g·mL-1 的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10 L，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果6次測(cè)定的峰面積平均積分值（±s）=5819.496±1.78073，RSD 為0.031%，結(jié)果表明精密度良好。2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品1號(hào)供試品溶液分別在0，2，4，6，

10、8，10 h，依法測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿峰面積積分值，測(cè)定的峰面積平均積分值（±s）=1166.154±14.39201，RSD 為1.23%，結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.5 回收率試驗(yàn) 取樣品1號(hào)6份，各約10mg，精密稱定，精密加入0.4812 mg 鹽酸麻黃堿對(duì)照品，依法制備各回收率樣品溶液，測(cè)定并計(jì)算各樣品中鹽酸麻黃堿的含量，結(jié)果鹽酸麻黃堿的平均回收率為100.69%，RSD 為1.42%。見表1。表1 鹽酸麻黃堿回收率測(cè)定Table 1 The recovery rate of the determination of ephedrine hydro

11、chloride取樣量/mg樣品中含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%均值/%RSD/%10.6811.0211.2410.3211.6710.380.49130.50690.51700.47470.53680.47750.48120.48120.48120.48120.48120.48120.97110.99120.99930.95381.03470.961299.71100.64100.2399.56103.47100.52100.691.422.6 麻黃藥材含量測(cè)定 取麻黃細(xì)粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44磷酸溶液50mL，稱定重量，超聲處理(功率600W

12、，頻率50kHz)20min，放冷，再稱定質(zhì)量，用1.44磷酸溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得4。2.7 麻黃水煎和醇提取的工藝比較研究2.7.1 水煎樣品的制備5 稱取麻黃藥材500 g，加10倍量水煎煮3次，每次1.5 h，煎液濾過，合并濾液，濃縮至近干，置60 減壓干燥，得水煎干膏，編號(hào)樣品1。2.7.2 醇提樣品的制備 稱取麻黃藥材500 g，加10倍量65%乙醇回流提取3 次，每次1.5h，濾過，合并醇提液，濃縮至近干，置60減壓干燥，得醇提干膏，編號(hào)樣品2。樣品1、2按2.1條件下進(jìn)行含量測(cè)定。見表2。表2 麻黃水提、醇提工藝出膏率及麻黃堿提取率比較Table 2 E

13、phedra water extraction, alcohol extraction process comparison of extraction ratio and Ephedrine Extraction Rate工藝出膏率/%麻黃堿提取率/%水提方法30.1062.16醇提方法23.3268.393 麻荊顆粒藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)3.1 麻荊顆粒樣品制備 按2.7.1、2.7.2項(xiàng)下工藝分別提取一定量的麻黃藥材，提取液濃縮，60減壓干燥，提取物按處方量分別與其他3味藥提取物混合，粉碎過4號(hào)篩，即得。3.2 小鼠氨水引咳試驗(yàn) 通過氨水引咳法，記錄小鼠咳嗽潛伏期和2min內(nèi)咳嗽次數(shù)，觀察麻荊顆粒（

14、麻黃水提、醇提）的鎮(zhèn)咳作用。3.2.1 試驗(yàn)方法6 本實(shí)驗(yàn)分別選取中藥陽性藥消咳喘片，功能主治：止咳、祛痰、平喘，用于慢性支氣管炎及感冒咳嗽，西藥陽性藥咳必清片，功能主治：用于各種原因引起的干咳，根據(jù)陽性對(duì)照藥成人每日臨床用藥劑量換算成小鼠等效劑量給藥。試驗(yàn)分2批進(jìn)行，水提和醇提各96只。2批ICR種小鼠均隨機(jī)分為8組：（1）空白對(duì)照組，蒸餾水（20mL·kg-1）；（2）咳必清組（26mg·kg-1）；（3）消咳喘組（1.2g·kg-1）；（4）麻荊1組（8g生藥·kg-1）；（5）麻荊2組（4g生藥·kg-1）；（6）麻荊3組（2g生藥&#

15、183;kg-1）；（7）麻荊4組（1g生藥·kg-1）；（8）麻荊5組（0.5g生藥·kg-1）。每組12只，雌雄各半，各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)4d。末次藥后1h，取一個(gè)玻璃平皿，內(nèi)放直徑15cm圓形濾紙的1/4，用加樣器吸0.2mL濃氨水加在濾紙上，迅速倒置1000mL平底玻璃罩，將小鼠扣于平皿中。以小鼠腹肌收縮、張口為咳嗽指標(biāo)， 記錄小鼠的咳嗽潛伏期（從熏氨開始到出現(xiàn)咳嗽）和2min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。組間進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)。3.2.2 試驗(yàn)結(jié)果 見表3。表3 小鼠止咳試驗(yàn)結(jié)果（±s， n=12）Table 3 The mouse cough test r

16、esults組別劑量/g·kg-1麻黃水提物麻黃醇提物咳嗽潛伏期/s2min咳嗽次數(shù) 咳嗽潛伏期/s2min咳嗽次數(shù)對(duì)照組31.18±6.2753.45±14.7126.92±7.7555.75±11.48咳必清組0.026 50.73±12.03* 28.73±9.87* 39.85±9.04* 35.85±8.30*消咳喘組1.236.90±10.57 39.50±10.71* 35.08±9.61* 41.25±12.16*麻荊1組8 47.75±1

17、5.53* 33.67±11.55* 42.31±9.55* 35.23±9.30*麻荊2組4 41.75±12.14* 38.75±7.96* 38.25±7.45* 39.50±8.65*麻荊3組2 33.08±11.45 46.58±11.92 28.33±7.8247.08±11.65麻荊4組1 34.58±10.42 48.50±10.56 28.50±7.6648.83±9.48麻荊5組0.532.45±7.2945.55&

18、#177;9.60 24.33±7.9451.00±9.33注：與對(duì)照組比較， *P<0.05，* P<0.01，* P<0.001。麻荊顆粒中麻黃水提或醇提工藝，其8 g·kg-1和4 g·kg-1劑量組，均可明顯延長咳嗽潛伏期并減少咳嗽次數(shù)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.050.01）；而2、1、0.5 g·kg-1組與對(duì)照組比較，則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.3 小鼠酚紅排痰試驗(yàn)3.3.1 試驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)分別選取中藥陽性對(duì)照藥復(fù)方鮮竹瀝液，功能主治：清熱化痰止咳，用于痰熱咳嗽，痰黃黏稠，西藥陽性藥沐舒坦，功能主

19、治：適用于痰液黏稠而不易咳出。根據(jù)陽性對(duì)照藥成人每日臨床用藥劑量換算成小鼠等效劑量給藥。試驗(yàn)分2批進(jìn)行，水提和醇提各96只。2批ICR種小鼠均隨機(jī)分為8組：（1）空白對(duì)照組，蒸餾水（20mL·kg-1）；（2）沐舒坦組（50mg·kg-1）；（3）復(fù)方鮮竹瀝液組（20mL·kg-1）；（4）麻荊1組（8g生藥·kg-1）；（5）麻荊2組（4g生藥·kg-1）；（6）麻荊3組（2g生藥·kg-1）；（7）麻荊4組（1g生藥·kg-1）；（8）麻荊5組（0.5g生藥·kg-1）。每組12只，雌雄各半，各組每日灌胃給藥1

20、次，連續(xù)4d。末次藥后45min（試驗(yàn)前禁食不禁水），各組小鼠腹腔注射2.5%苯酚紅NS溶液（10ml·kg-1），30 min后處死小鼠，背位固定，剪開頸部正中皮膚，分離整段氣管，氣管上切一小口，將磨平的12號(hào)針頭插入氣管內(nèi)約0.5cm，用絲線結(jié)扎固定后，用1mL注射器吸取0.5mL NS反復(fù)沖洗氣管3次，將沖洗液抽出注入試管中，按上述方法操作3次，沖洗液約1. 21. 5 mL。以0.1mL的NaOH（1mol·L-1）加入沖洗液試管內(nèi)，用BioTek微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定光密度（OD）值，用酚紅作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚紅含量(mg·mL)，進(jìn)行組間比較，

21、t檢驗(yàn)。3.3.2 結(jié)果 見表4。表4 麻黃水提和醇提物對(duì)小鼠的祛痰試驗(yàn)結(jié)果（±s， n=12）Table 4 Ephedra water and ethanol extracts on mice expectorant test results組別劑量/g·kg-1酚紅排出量/g·mL-1(水提)酚紅排出量/g·mL-1(醇提)對(duì)照組0.434±0.0541.373±0.255 沐舒坦組0.026 0.679±0.087* 2.135±0.422*復(fù)方鮮竹瀝液組1.20.719±0.235*1.606±0.237*麻荊1組8 0.686±0.157* 1.878±0.394*麻荊2組4 0.710±0.200* 2.230±0.876*麻荊3組2 0.762±0.141* 1.983±0.530*麻荊4組1 0.634