肺炎鏈球菌觸發(fā)肺型上皮細胞微絲肌動蛋白重排的鈣信

1、肺炎鏈球菌觸發(fā)肺型上皮細胞微絲肌動蛋白重排的鈣信號轉(zhuǎn)導機制 作者：徐邦牢1；尹一兵2(1廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510180；2重慶醫(yī)科大學檢驗系， 重慶 400016)摘要：目的通過體外實驗研究肺炎鏈球菌(S.pn)是否可通過肺型上皮細胞(A549)鈣信號轉(zhuǎn)導途徑觸發(fā)微絲肌動蛋白(F-actin)細胞骨架重排，進而導致S.pn對A549細胞的侵襲。 方法 采用F-actin特異性FITC-phalloidin熒光染料，觀察S.pn作用A549細胞前后F-actin細胞骨架重排情況，以重排百分率表示；用F-actin細胞骨架重排抑制劑細胞松弛素D預處理A549細胞，觀察S.pn對

2、A549細胞的侵襲；使用Ca2+信號轉(zhuǎn)導抑制劑dantrolene預處理A549細胞，觀察其與F-actin細胞骨架重排百分率間是否存在劑量依賴關(guān)系；用Fura-2/AM熒光探針負載A549細胞后測定S.pn粘附A549細胞30、60、90 min的胞內(nèi)Ca2+i。 結(jié)果 S.pn作用A549細胞后，經(jīng)FITC-phalloidin熒光染色，F(xiàn)-actin細胞骨架呈黃綠色塊狀聚集；F-actin細胞骨架重排抑制劑細胞松弛素D可明顯降低S.pn對A549細胞的侵襲，在其濃度為0.25 g/ml時，未得到可測的細菌數(shù)；Ca2+信號轉(zhuǎn)導抑制劑可部分抑制A549細胞F-actin細胞骨架重排，且與F-

3、actin細胞骨架重排百分率間存在量效關(guān)系；S.pn粘附A549細胞30、60、90 min后的胞內(nèi)Ca2+i高于對照(187.417.3 nmol/L)，并達到飽和，分別為(487.538.1)、(548.235.6)和(557.247.5) nmol/L。 結(jié)論 S.pn可通過Ca2+細胞信號轉(zhuǎn)導途徑觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排，進而導致S.pn侵襲A549細胞。關(guān)鍵詞：鏈球菌，肺炎；肺/細胞學；上皮細胞；微絲肌動蛋白；鈣信號；細胞支架中圖分類號：R378.14文獻標識碼：A文章編號：1000-2588(2004)02-0168-04Calcium signaling eve

4、nts in Streptococcus pneumoniae invasion of human type pneumocytesXU Bang-lao1； YIN Yi-bing21Department of Clinical Laboratory, First Municipal Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510180, China; 2Department of Laboratory Medicine, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, ChinaAbstrac

5、t: Objective To study whether Streptococcus pneumoniae (S.pn) can provoke filamentous actin (F-actin) rearran- gements in vitro through calcium signaling pathways in type pneumocytes(A549 cells), resulting in S.pn invasion of the cells. Method After FITC-phalloidin labeling of F-actin, F-actin rearr

6、angements were observed by S.pn adhesion to typepneumocyte A549 cells. S.pn invasion of A549 cells was determined by pretreating A549 cells with cytochalasin D. To investigate whether F-actin rearrangements could be blocked by Ca2+ inhibitors, A549 cells were pretreated with Ca2+ inhibitors dantrole

7、ne, and loaded in Fura-2/AM probe to determine the concentration of cytosolic free calcium by S.pn adhesion to A549 cells after 30, 60, and 90 min respectively. Results Intact S.pn can promote F-actin rearrangements. Cytochalasin D was able to prevent S.pn invasion of A549 cells. No invasion of A549

8、 cell can be determined at 0.25 g/ml of cytochalasin D. One subset of the inhibitors of Ca2+ signal transduction molecules blocked F-actin rearrangements dose-dependently, and S.pn adhesion of A549 cells for 30, 60, and 90 min increased cytosolic free calcium, reaching(487.538.1),(548.235.6) and(557

9、.247.5) nmol/L, respectively. They were higher than of the control group. Conclusion S.pn can provoke F-actin rearrangements through Ca2+ signaling pathways, which further leads to S.pn invasion of A549 cells.Key words: Streptococcus pneumoniae; lung/cytology; epithelial cells; filamentous actin; ca

10、lcium signaling; cytoskeleton收稿日期：2003-10-12基金項目：國家自然科學基金(30170050)Supported by National Natural Science Foundation of China(30170050)作者簡介：徐邦牢(1969-)，男，2002年畢業(yè)于重慶醫(yī)科大學，碩士，主管技師，電話E-mail: xubanglao 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一種常見的革蘭氏陽性致病菌，所致臨床發(fā)病率和死亡率均較高1。目前，由于多糖莢膜疫苗免疫原性較弱及耐藥現(xiàn)象的出

11、現(xiàn)，使預防及治療具有一定的局限性。有文獻資料報道，腸致病性大腸埃希氏菌及沙門氏菌等革蘭氏陰性致病菌粘附宿主細胞可使胞內(nèi)Ca2+i增加，由此觸發(fā)微絲肌動蛋白(F-actin)細胞骨架重排，進而侵襲宿主細胞23。Ca2+除具有信號轉(zhuǎn)導功能外，還具有直接參與由細胞內(nèi)肌動蛋白引起的興奮-收縮耦聯(lián)效應這一重要的生理功能?；诖耍狙芯恐荚谔接慡.pn是否通過鈣信號轉(zhuǎn)導觸發(fā)F-actin細胞骨架重排，進而侵襲肺型上皮細胞(A549)。這將為最終闡明S.pn的致病機制提供科學的理論依據(jù)，為開發(fā)新一代治療S.pn感染性疾病的藥物提供新思路。1材料和方法432PO4 0.6 g，KCl 0.4 g，NaHCO3

12、 0.42 g，MgSO47H2O 0.197 g，Na2HPO412H22HPO4620=0.4，約108菌落形成單位/ml)。用于整個實驗時，先離心(2 500 r/min、10 min)，再用預冷的PBS洗3次，不含雙抗RPMI-1640懸浮至108252孵箱中溫育2 h后，用無菌PBS輕輕洗3次；加入含1%FCS、10 U/ml青霉素、200 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液；37 、5%CO2孵箱孵育1 h，以充分殺死胞外S.pn；用無菌PBS洗3次，加入100 l 0.25%胰酶使貼壁細胞懸浮，再加入400 l 0.025% TritonX-100裂解細胞3 min，10

13、倍稀釋后吸取100 l涂布瓊脂血平板6；37 、5% CO22+i測定 用0.25%胰酶消化貼壁單層A549，D-Hanks液洗3次；用2 ml負載液懸浮細胞，加入10 l Fura-2/AM溶液(終濃度為5 mol/L)，混勻，37 水浴避光振蕩40 min。將負載后細胞用含0.2% BSA的D-Hanks液洗3次，用細胞內(nèi)鈣測定液懸浮細胞。錐蟲藍染色檢查細胞活力90%7，并調(diào)整細胞數(shù)至2106/ml。測定前將儀器比色器恒定在37 ，分別掃描標準品及負載后細胞懸液的激發(fā)波長和發(fā)射波長以判斷負載是否成功，選擇負載后細胞懸液的激發(fā)波長和發(fā)射波長為測定波長。胞內(nèi)Ca2+i由下式計算：Ca2+i(n

14、mol/L)=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)，式中Kd為Fura-2/Ca2+的解離常數(shù)，在37 時為224 nmol/L，F(xiàn)為在不同條件下測定的熒光強度值；Fmax為加入終濃度為0.1% TrtonX-100后的最大熒光強度值，F(xiàn)min為在Fmax基礎(chǔ)上再加入終濃度為5 mmol/L EGTA時的最小熒光強度值82+i測定 將A549接種于24孔培養(yǎng)板孔。單層貼壁(約5105/孔)后吸出孔內(nèi)液體，各孔加入無雙抗RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮的 S.pn菌液(約108菌落形成單位/ml)，37 、5% CO2分別溫育30、60、90 min，收集12孔細胞于一塑料試管中。收集細胞方法：在

15、溫育后用無菌PBS(pH 7.4)洗滌細胞6次；用含0.25%膠原酶的RPMI-1640溫育消化細胞10 min；再用含5%FCS的PBS洗2次，負載并測定計算A549細胞內(nèi)Ca2+2結(jié)果2.1完整的S.pn觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排S.pn作用A549細胞后，F(xiàn)-actin經(jīng)FITC-phalloidin染色呈圓形深黃色聚集(圖1)；對照細胞無上述變化，呈現(xiàn)均勻黃色熒光外觀(圖2)。 圖1完整的S.pn作用A549細胞2 h后F-actin在熒光顯微鏡下呈黃色并圓形聚集(原放大倍數(shù)：400)Fig.1Round aggregation of yellow F-actin in

16、 A549 cells observed under fluoroscopy after intact S.pn adhesion ofA549 for 2 h(Original magnification:400)圖2對照A549細胞內(nèi)F-actin在熒光顯微鏡下呈黃色并均勻分布(原放大倍數(shù)：400)Fig.2Even distribution of yellow F-actin in control A549 cells observed under fluoroscopy(Original magnification:400)2+2+抑制劑dantrolene預處理A549細胞后的F-a

17、ctin的重排百分率與對照組(dantrolene濃度為0 mol/L)比較有顯著差異(P0.001)。F-actin細胞骨架重排與信號轉(zhuǎn)導抑制劑dantrolene間存在劑量依賴關(guān)系。圖3顯示用Ca2+抑制劑dantrolene 預處理A549細胞后，在熒光顯微鏡下F-actin細胞骨架重排被部分抑制；圖4顯示DMSO對重排無影響。 圖3Dantrolene預處理后F-actin聚集被部分抑制(原放大倍數(shù)：200)Fig.3F-actin aggregation partly inhibited by 25 mol/L dantrolene(Original magnification:20

18、0)圖4DMSO作用A549細胞后F-actin不發(fā)生聚集(原放大倍數(shù)：200)Fig.4F-actin without aggregation after DMSO treatment of A549 cells(Original magnification:200)2+i細胞外Ca2+i為1.3 mmol/L時，對照A549細胞的胞內(nèi)Ca2+i為(194.117.4)nmol/L(n=4)；測定液中不含Ca2+并加入0.1 mmol/L EGTA時，A549細胞的胞內(nèi)Ca2+2+i測定 S.pn粘附A549細胞30、60、90 min后的胞內(nèi)Ca2+i高于對照(187.417.3 nmol

19、/L)，P0.001并達到飽和，分別為(487.538.1)、(548.235.6)和(557.247.5) nmol/L。3討論病原菌侵襲宿主細胞是傳染過程建立的重要環(huán)節(jié)之一，病原菌通常借助宿主細胞F-actin細胞骨架的高度可塑性及其運動功能而侵襲細胞9。研究S.pn是否通過F-actin細胞骨架侵襲宿主細胞及其信號轉(zhuǎn)導機制，對于闡明其致病機制有重要意義。3.1S.pn觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排及F-actin細胞骨架重排在S.pn侵襲A549細胞中的作用本研究證實完整的S.pn可觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排，這與文獻所報道的關(guān)于革蘭氏陰性病原菌作用于宿主細胞

20、后的結(jié)果有類似之處，也是到目前為止，首次描述S.pn觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排的形態(tài)學特征。為進一步研究F-actin細胞骨架重排在S.pn侵襲A549細胞中的作用，我們用不同濃度的細胞松弛素D預處理A549細胞，觀察侵襲數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)隨抑制劑濃度增大，侵襲數(shù)明顯降低，并在濃度為0.25 g/ml時，未得到可測的侵襲數(shù)，提示F-actin細胞骨架重排在S.pn侵襲A549細胞中起著非常重要的作用，它可直接影響S.pn侵襲A549細胞。3.2S.pn觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排的鈣信號轉(zhuǎn)導機制目前為止，文獻中尚無關(guān)于S.pn可觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重

21、排機制的報道。我們通過研究發(fā)現(xiàn)S.pn可通過鈣信號轉(zhuǎn)導途徑觸發(fā)A549細胞F-actin細胞骨架重排，F(xiàn)-actin細胞骨架重排百分率與該抑制劑間存在劑量依賴關(guān)系，二者變化呈高度負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.86。S.pn作用于A549細胞可引起胞內(nèi)Ca2+i的變化，S.pn粘附A549細胞30、60、90 min后胞內(nèi)Ca2+i均比對照組約高3倍，由此提示S.pn粘附A549細胞可使胞內(nèi)Ca2+i增加，F(xiàn)-actin細胞骨架發(fā)生重排是由S.pn粘附A549細胞后觸發(fā)鈣信號轉(zhuǎn)導途徑引起的。其最可能的機制為：S.pn粘附A549細胞，使胞內(nèi)Ca2+i增加，而Ca2+可影響多種F-actin結(jié)合蛋白

22、活性1011。S.pn很可能通過鈣信號轉(zhuǎn)導使多種F-actin結(jié)合蛋白活性發(fā)生變化，活性變化大小與F-actin細胞骨架重排百分率成比例，但有關(guān)S.pn通過Ca2+信號轉(zhuǎn)導途徑引起與F-actin細胞骨架重排相關(guān)的A549細胞是何種蛋白的變化，以及其與A549細胞內(nèi)Ca2+振蕩的調(diào)節(jié)或相關(guān)關(guān)系還有待進一步研究。參考文獻：1Gillespie SH. Aspects of pneumococcal infection including bacterial virulence, host response and vaccinationJ. J Med Microbiol, 1989, 28(9

23、): 237-48.2Dytoc M, Fedorko L, Sherman PM. Signal transduction in human epithelial cells infected with attaching and effacing Escherichia coli in vitroJ. Gastroenterology, 1999, 106(21): 1150-61.3Philpott DJ, Ismaili A, Dytoc MT. Increased adherence of Escheri- chia coli RDEC-1 to human tissue cultu

24、re cells results in the activation of host signaling pathwaysJ. J Infect Dis, 1995, 172(13): 136-43.4Lacks SA. Study of genetic material determining an enzyme activity in pneumococcusJ. Biochem Biophys Acta, 1960, 39(7): 508-17.5Peiffer I, Servin AL, Bernet-Camard MF. Piracy of decay-accelera- ting

25、factor (CD55) by the diffusely adhering strain Escherichia coli C1845 promotes cytoskeletal F-actin rearrangements in cultured human intestinal INT407 cellsJ. Infect Immun, 1998, 66(9): 4036-42.6Paton JC. Molecular analysis of the pathogenicity of streptococcus pneumoniae: the role of pneumococcal p

26、roteinsJ. Annu Rev Micro- biol, 1993, 47(22): 89-115.7劉振偉. 用Fura-2測定缺氧時海馬細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化J. 細胞生物學雜志 (J Cytobiol), 1994, 16(3): 141-3.8Dana JP, Ismaili A, Dytoc MT, et al. Increased adherence of Escheri- chia coli RDEC-1 to human tissue culture cells results in the activa- tion of host signaling pathway

27、sJ. J Infect Dis, 1998, 172(1): 136-43.9Mitchell TJ. Celluar microbiology: an integrated approach to under- standing pathogenesis of infectionJ. J Cell Sci, 2000, 113(pt19): 3355-6.10楊建一. 醫(yī)學細胞生物學M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2000. 127-48.11Finlay BB, Cossart P. Exploitation of mammalian host cell function by bact

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