不同鏈長(zhǎng)RGD多肽對(duì)交聯(lián)PEI體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響

1、第5卷第6期2010年6月415不同鏈長(zhǎng)RGD多肽對(duì)交聯(lián)PEI體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響孫云霞,曾 旋,張先正,卓仁禧(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)用高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072摘 要:用固相合成法合成了兩種不同鏈長(zhǎng)的含RGD序列的小分子多肽,分別為RGD和GGGGRGDS。用物理共混法制備了含RGD的SS-PEI/DNA復(fù)合物。測(cè)定了該復(fù)合物的電位,研究了RGD的鏈長(zhǎng)和加入量對(duì)SS-PEI/DNA復(fù)合物在COS-7和CHO中的轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明,由于RGD上的天冬氨酸帶負(fù)電荷,因此含RGD的復(fù)合物電位略有降低。RGD鏈長(zhǎng)對(duì)復(fù)合物在兩種細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染影響不大,在COS-7中

2、RGD的轉(zhuǎn)染效率略高于GGGGRGDS,而在CHO 中則相反,且隨著多肽用量的增加轉(zhuǎn)染效率略有降低。關(guān)鍵詞:基因載體;交聯(lián)聚乙烯亞胺;多肽;RGD中圖分類號(hào):R943.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-7180(201006-0415-4Effect of RGD peptide chain length on gene transfection efficiency ofcross-linked PEISun Yunxia,Zeng Xuan,Zhang Xianzheng,Zhuo Renxi(Key Laboratory of Biomedical Polymers of Minis

3、try of Education & Department of Chemistry, Wuhan University,Wuhan 430072, ChinaAbstract: Two RGD peptides with different chain lengths, RGD and GGGGRGDS, were synthesized via solid-phase synthesis. In order to enhance biological activities, the RGD peptides were noncovalently introduced into SS

4、-PEI/DNA complex. The effects of RGD chain length and addition on zeta potential and transfection efficiency were investigated. The results showed that aspartic acid in RGD carried negative charges could reduce the zeta potential of complex. RGD chain length had slight influence on transfection effi

5、ciency. Complex with RGD presented higher transfection efficiency than complex with GGGGRGDS in COS-7 cells, which was different from that in CHO cells. Moreover, transfection efficiency was slightly decreased with the increasing of peptide addition.Key words: gene vector;cross-linked PEI;peptide;RG

6、D對(duì)于靶向基因傳遞體系,受體介導(dǎo)的內(nèi)吞是載體/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的受體包括鐵傳遞蛋白受體、脫唾液酸糖蛋白受體以及整合素受體1-5。而和整合素受體特異性結(jié)合的靶向配體是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD序列的多肽,這種配體可以特異性識(shí)別細(xì)胞表面的v3和v5整合素受體(如內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等6-9。靶向配體和細(xì)胞表面受體的相互作用會(huì)引起受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞,因此,整合素受體常被用來(lái)研究細(xì)胞的黏附及基因傳遞系統(tǒng)通過(guò)受體介導(dǎo)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程10。將RGD配體與轉(zhuǎn)染效率較高的聚乙烯亞胺(PEI結(jié)合起來(lái),可進(jìn)一步提高細(xì)胞對(duì)PEI的內(nèi)吞作用,大幅降低材料對(duì)細(xì)胞的毒性。然而,采

7、用化學(xué)鍵合會(huì)降低RGD多肽的生物活性,甚至使其完全失活。為了保收稿日期:2010-03-02基金項(xiàng)目:高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(2006048600中國(guó)科技論文在線SCIENCEPAPER ONLINE第5卷第6期2010年6月416 中國(guó)科技論文在線SCIENCEPAPER ONLINE持其生物活性,本實(shí)驗(yàn)采取直接物理混合的方式在二硫鍵交聯(lián)聚乙烯亞胺(SS-PEI/DNA基因傳遞系統(tǒng)中引入RGD,并研究了多肽的鏈長(zhǎng)和加入量對(duì)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑氨基被9-芴甲氧羰基保護(hù)的甘氨酸(FMOC-Gly-OH、氨基以及側(cè)基的羧基分別被9-芴甲氧羰基和叔丁基保護(hù)的天

8、冬氨酸(FMOC-Asp(OtBu-OH、氨基以及側(cè)基的胍基分別被9-芴甲氧羰基和2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺?；Ｗo(hù)的精氨酸(FMOC-Arg(Pbf-OH、氨基以及側(cè)基的羧基分別被9-芴甲氧羰基和叔丁基保護(hù)的絲氨酸(FMOC-Ser(OtBu-OH、苯并三氮唑-N,N,NN-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU、1-羥基苯并三氮唑(HOBt、二氯甲基樹(shù)脂(2-chlorotrityl chloride resin購(gòu)于上海吉爾生化公司。三異丙基硅烷(TIS、苯甲硫醚(MPS購(gòu)于Acros公司。乙二硫醇(EDT、無(wú)水乙醚、三氟乙酸(TFA、哌啶、茚三酮、苯酚為分析純。二異丙基乙胺

9、(DIEA重新蒸餾后使用。N,N-二甲基甲酰胺(DMF和二氯甲烷(DCM用無(wú)水MgSO4干燥蒸餾后使用。SS-PEI為實(shí)驗(yàn)室自制10,由無(wú)細(xì)胞毒性的枝化PEI(800 Da通過(guò)SS鍵交聯(lián)得到,產(chǎn)物分子量為9.65 kDa。1.2兩種不同鏈長(zhǎng)的RGD多肽(RGD、GGGGRGDS的制備稱取1.5 g三苯甲基氯樹(shù)脂(2-chlorotrityl chloride resin至多肽合成裝置(aldrich fritted filter funnel中, DMF浸泡樹(shù)脂使之充分溶脹,排出DMF。稱取1.63 g (3.96 mmolFMOC-Asp(OtBu-OH,用10 mL DMF將其溶解后轉(zhuǎn)入多

10、肽合成裝置中,加入3.3 mL二異丙基乙胺(DIEA,室溫?cái)嚢?.5 h。用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂。加入13 mL 體積分?jǐn)?shù)20 %的哌啶/DMF溶液到樹(shù)脂中,反應(yīng)2 h,脫去Asp上的FMOC保護(hù)基。4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂,用茚三酮檢驗(yàn)脫保護(hù)是否完全。分別稱取1.18 g(3.96 mmolFMOC-Gly-OH, 1.8 g (4.752 mmolHBTU,0.64 g (4.752 mmolHOBt,用10 mL DMF溶解后轉(zhuǎn)入多肽合成裝置中, 加入2 mL DIEA,縮合反應(yīng)1.5 h。4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂。加入13 mL體積分

11、數(shù)20%的哌啶/DMF溶液到樹(shù)脂中,反應(yīng)2 h,脫去Gly上的FMOC保護(hù)基。4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂,用茚三酮檢驗(yàn)脫保護(hù)是否完全。分別稱取2.57 g (3.96 mmolFMO C-Arg(Pbf-O H,1.8 g(4.752 mmol HBTU,0.64 g (4.752 mmol HOBt,用10 mL DMF溶解后轉(zhuǎn)入多肽合成裝置中,加入2 mL DIEA,縮合反應(yīng)1.5 h。用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂。加入13 mL體積分?jǐn)?shù) 20%的哌啶/DMF溶液到樹(shù)脂中,反應(yīng)2 h,脫去Arg上的FMOC保護(hù)基。4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂,用茚三

12、酮檢驗(yàn)脫保護(hù)是否完全。4×10 mL DMF 洗滌樹(shù)脂。再用4×10 mL CH2Cl2洗滌樹(shù)脂,充分洗干,于真空干燥箱中干燥24 h。將30 mL TFA、0.8 mL H2O、0.3 mL TIS、0.8 mL MPS、0.8 mL EDT、0.8 mL 苯酚的混合液加到干燥后的樹(shù)脂中,反應(yīng)8 h。收集濾液TFA,用少量TFA洗樹(shù)脂,收集洗液,合并濾液和洗液,用適量的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀,靜置。沉淀充分后,抽濾,洗滌,干燥,得粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品溶于水,凍干,制得RGD。GGGGRGDS的合成方法同RGD。1.3細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒DNA的純化中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO和非洲綠猴腎細(xì)胞(

13、COS-7 用含10%胎牛血清(FBS、2 mg/mL NaHCO3和1% 10 000 U/mL的雙抗(青霉素鏈霉素的DMEM(Gibco 培養(yǎng)基在37 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)使用了螢光素酶(pGL-3報(bào)告基因質(zhì)粒。pGL-3在JM109大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。采用Omega公司的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒,從菌液中提取和純化質(zhì)粒DNA,用超純水洗脫,無(wú)菌過(guò)濾,所得質(zhì)粒DNA的水溶液凍存于-80 。1.4含多肽的SS-PEI/DNA復(fù)合物的制備將兩種多肽、SS-PEI和質(zhì)粒DNA(pGL-3分別溶于去離子水中,配成質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL、1 mg/mL 和500 ng/L的水溶液。將質(zhì)

14、量比為10的SS-PEI/DNA 復(fù)合物37 下靜置30 min,然后將不同用量的多肽溶液加入SS-PEI/DNA復(fù)合物中繼續(xù)靜置30 min,得到含多肽的SS-PEI/DNA復(fù)合物。1.5電位的測(cè)定加入含RGD或GGGGRGDS的SS-PEI/DNA復(fù)合物,用Nano-ZS ZEN3600(Malvern Instruments測(cè)定復(fù)合物的電位。1.6體外轉(zhuǎn)染將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO和非洲綠猴腎細(xì)胞(COS-7以每孔細(xì)胞數(shù)6×105接種于24孔板,培養(yǎng)24 h,分別加入含RGD或GGGGRGDS的SS-PEI/DNA復(fù)合物(SS-PEI與DNA的質(zhì)量比為10,每孔1g質(zhì)粒,孵育4

15、 h后,吸棄舊液,加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)在37 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用化學(xué)發(fā)光儀定量檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)。第5卷 第6期 2010年6月 4172 結(jié)果與討論2.1 多肽的合成為了考察不同肽鏈長(zhǎng)度的多肽對(duì)SS-PEI/DNA 復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的影響,利用固相合成法制備了含RGD 序列的兩種小分子多肽RGD 和GGGGRGDS ,結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1 RGD 多肽結(jié)構(gòu) Fig. 1 Structure of RGD peptides2.2 復(fù)合物的電位復(fù)合物的電位測(cè)試結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看到隨著兩種多肽加入質(zhì)量的逐漸增加,復(fù)合物的電位逐漸降低,尤其是當(dāng)RGD 的加入量為120

16、 µg 時(shí),復(fù)合物電位降至13.6 mV 。這是由于RGD 中的天冬氨酸帶一定的負(fù)電荷,隨著RGD 質(zhì)量的增加,天冬氨酸的含量也隨之增多,因而屏蔽了復(fù)合物上的部分正電荷。總的來(lái)說(shuō),雖然多肽的加入使復(fù)合物表面電荷降低,但是仍帶較強(qiáng)的正電性,能與帶負(fù)電的DNA 以及細(xì)胞膜結(jié)合,有助于細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的內(nèi)吞,對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響較小。圖2 多肽鏈長(zhǎng)和加入量對(duì)復(fù)合物電位的影響 (以SS-PEI/DNA (質(zhì)量比為10復(fù)合物的電位為參照 Fig. 2 Effect of chain length and amount of peptide on the complex zeta potential (S

17、S-PEI/DNA complex (mass ratio 10as control2.3 體外轉(zhuǎn)染以復(fù)合物SS-PEI/DNA (質(zhì)量比10的轉(zhuǎn)染效率為參照,考察了兩種鏈長(zhǎng)的RGD 對(duì)SS-PEI/DNA 復(fù)合物在COS-7和CHO 兩種細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率的影響,如圖3所示。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,當(dāng)多肽加入量為60 g 時(shí),RGD/pGL-3復(fù)合物在COS-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為2.47×1010RLU/mg 蛋白,與之對(duì)應(yīng)的GGGGRGDS/pGL-3復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率為1.63×1010 RLU/mg 蛋白。兩者未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性,比未加多肽的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率(1.08&#

18、215;1010 RLU/mg 蛋白略高。此外,復(fù)合物在COS-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率均高于在CHO 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于CHO 細(xì)胞,隨著多肽用量的增加,轉(zhuǎn)染效率略有降低。因此,由轉(zhuǎn)染結(jié)果可知,對(duì)于SS-PEI/DNA 基因傳遞體系,RGD 多肽的鏈長(zhǎng)和加入量對(duì)轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著影響。(a COS-7細(xì)胞不同鏈長(zhǎng)RGD 多肽對(duì)交聯(lián)PEI 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響第5卷第6期2010年6月418 中國(guó)科技論文在線SCIENCEPAPER ONLINE (b CHO細(xì)胞圖3復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率Fig. 3In vitro gene transfection3結(jié) 論合成了兩種不同鏈長(zhǎng)的RGD多肽(RGD和GG

19、GGRGDS,將不同用量的多肽與SS-PEI/DNA復(fù)合物復(fù)合后進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染,評(píng)價(jià)了RGD多肽的鏈長(zhǎng)和用量對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明,含RGD的復(fù)合物電位略有降低,RGD鏈長(zhǎng)和加入量對(duì)SS-PEI/DNA 復(fù)合物在兩種細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染影響不顯著。參考文獻(xiàn)(References1Decuzzi P, Ferrari M. The role of specific and non-specificinteractions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles J.Biomaterials, 2007, 28(18: 2915-2922

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