發(fā)育鼠單次驚厥后腦內(nèi)N-Cadherin的表達(dá)在海馬苔蘚纖維發(fā)芽中作用的研究

1、發(fā)育鼠單次驚厥后腦內(nèi)N-Cadherin的表達(dá)在海馬苔蘚纖維發(fā)芽中作用的研究                    作者：袁寶強(qiáng)，魏海燕，張麗麗，樊秋萍，戴園園【摘要】  目的 探討單次驚厥發(fā)作后腦內(nèi)神經(jīng)性鈣黏附分子（N-Cadherin）表達(dá)與海馬結(jié)構(gòu)中苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象之間的關(guān)系及其作用。方法 利用腹腔注射戊四氮（PTZ）制作發(fā)育期SD大鼠（14天、28天）單次驚厥發(fā)作模型，各日齡組隨機(jī)分為生理鹽水（NS

2、）組、PTZ致驚組和吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）預(yù)處理組，采用免疫組化法檢測N-Cadherin的表達(dá)，利用Timm染色法觀察海馬苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象。結(jié)果 NS組在海馬CA3區(qū)可見極少Timm染色顆粒，致驚后1周偶見Timm染色顆粒，與NS組相比差異無顯著性（P0.05）；致驚后3周可見較多Timm染色顆粒沿海馬CA3區(qū)呈條帶樣分布，較NS組明顯增加（P0.01）；PDTC預(yù)處理組可見Timm染色顆粒較PTZ致驚組明顯減少（P0.05）。同時，NS組14天和28天大鼠海馬CA3區(qū)可見少量的N-Cadherin陽性細(xì)胞，著色不深；PTZ致驚組海馬CA3和齒狀回門區(qū)的N-Cadherin陽性細(xì)胞與

3、NS組相比明顯增多（P0.01）,PDTC預(yù)處理后相同區(qū)域內(nèi)N-Cadherin陽性細(xì)胞較PTZ致驚組明顯減少（P0.05）。N-Cadherin與Timm染色顆粒的表達(dá)結(jié)果與驚厥鼠的日齡并無關(guān)聯(lián)性。結(jié)論 單次驚厥發(fā)作在幼鼠可以引起海馬不同程度的苔蘚纖維發(fā)芽，而N-Cadherin的分布位置與變化時相與苔蘚纖維發(fā)芽相吻合，這表明N-Cadherin可能參與或促進(jìn)了苔蘚纖維的發(fā)芽。 【關(guān)鍵詞】  海馬苔蘚纖維發(fā)芽;發(fā)育鼠；驚厥；神經(jīng)性鈣黏附分子   Abstract： Objective  To investigate the relationship b

4、etween the expression of N-Cadherin in the brain and mossy fiber sprouting in the rat hippocampus following single seizure in immature rats so as to ascertain the possible effect of N-Cadherin. Methods  96 immature rats of 14 d and 28 d each were induced single seizure by intraperitoneal inject

5、ion of PTZ 60 mg/kg to establish animal model. The rats were randomly classified into three groups, including normal saline control (NS group), PTZ seizure group, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) pretreatment group. Immunohistochemistry method was used to determine the expression of N-Cadherin in

6、rat hippocampus after seizure, and Timm histochemical technique was adopted to observe mossy fiber sprouting. Results  In NS group, Timm-stained granules were rare in the CA3 area of hippocampus, and in PTZ seizure group only a few Timm-stained granules were visible 1 week later. The difference

7、 between the two groups was of no statistic significance (P0.05). Three weeks later, in PTZ seizure group, Timm-stained granules were abundant along the CA3 area in a stratal distribution, with an evident increase compared with NS group (P0.01). In PDTC group, Timm-stained granules were visible, but

8、 were markedly reduced in contrast with PTZ seizure group (P0.05). Meanwhile, in the CA3 area of hippocampus in NS group, a small amount of N-Cadherin positive cells were visible and were slightly stained. Compared with NS group, in PTZ seizure group, N-Cadherin positive cells had a marked increase

9、in area CA3 and dentate hilus (P0.01), but they were strongly inhibited in PDTC group (P0.05). There was no correlation between the expressions of N-cadherin, Timm-stained granules and between the age of rats with seizure. Conclusion  Single seizure induces mossy fiber sprouting in immature rat

10、 hippocampus, and the location and time phase of N-Cadherin are in accord with mossy fiber spouting after single seizure, which suggests N-Cadherin might be involved in or promote mossy fiber sprouting in hippocampus of immature rats after single seizure.   癲疒間是兒童神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病。它是一組以反復(fù)發(fā)作性大腦神經(jīng)元

11、異常猝發(fā)放電所致的暫時性大腦功能失常為特征的慢性疾病。對癲疒間發(fā)作后腦損傷的研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)發(fā)作可以引起神經(jīng)元的壞死、凋亡，以及苔蘚纖維發(fā)芽（mossy fiber spouting，MFS）引起的異常軸突形成，即突觸重建。這些研究目前主要集中在成年鼠的癲疒間持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）模型中，而對于單次發(fā)作的研究較少，尤其是對幼年鼠單次發(fā)作的研究更少。劉月影等1研究發(fā)現(xiàn)，單次驚厥發(fā)作同SE一樣亦可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死后，成年鼠腦內(nèi)存在神經(jīng)細(xì)胞增生或神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制，包括海馬內(nèi)MFS2、神經(jīng)干細(xì)胞不同程度的增殖等2-3。陳靜等3發(fā)現(xiàn)發(fā)

12、育鼠SE后也有顯著的神經(jīng)芽生現(xiàn)象，這種芽生機(jī)制比較復(fù)雜，有人認(rèn)為與NMDA受體的激活有關(guān)4，亦有人認(rèn)為與神經(jīng)性鈣黏附分子（N-Cadherin）有關(guān)5。本研究的目的是希望能進(jìn)一步觀察單次驚厥發(fā)作是否誘導(dǎo)神經(jīng)芽生以及了解N-Cadherin在神經(jīng)芽生過程中是否發(fā)揮作用。   1  材料和方法   1.1  動物及分組  健康SD大鼠14、28天2個日齡組，雌雄不限，共96只，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將各日齡組大鼠隨機(jī)分為生理鹽水（NS）組、戊四氮（PTZ）致驚組和吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）預(yù)處理組，1周末進(jìn)行Timm

13、染色，3周末進(jìn)行Timm染色及N-Cadherin檢測。所有大鼠均在同一實(shí)驗(yàn)室和動物中心操作和喂養(yǎng)，以保持喂養(yǎng)、光照、噪音等條件相同，減少外界造成的差異。   1.2  驚厥動物模型的建立和預(yù)處理  大鼠腹腔內(nèi)注射PTZ (60 mg/kg)，然后對驚厥發(fā)作程度按Racine6分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，選擇出現(xiàn)級單次發(fā)作者作為驚厥研究模型，對照組用等容NS腹腔注射。PDTC預(yù)處理組：于注射PTZ前1 h腹腔注射PDTC（100 mg/kg）。   1.3  Timm染色  根據(jù)陳靜等3介紹的方法對實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行灌注和取材，從視

14、交叉處開始連續(xù)冠狀切片，片厚5 m，每只大鼠取不連續(xù)部位腦片810張。采用Danscher等7介紹的Timm 染色方法，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。先配置Timm 混合液，染色前在暗室內(nèi)將1.5 ml的1.7%硝酸銀溶液加入上述Timm 混合液內(nèi)，放入切片，置26水浴箱孵育4560 min，取出切片后用蒸餾水充分沖洗以終止反應(yīng)，移出暗室后繼續(xù)予蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水（100%、95%、90%、80%）,二甲苯透明, 中性樹膠封片。   1.4  免疫組化  采用兩步法免疫組化方法，試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，一抗為1100兔抗大鼠N-Cadherin多克隆抗體

15、，陰性對照用PBS取代一抗，顯色劑用DAB和H2O2進(jìn)行著色，操作步驟按試劑盒操作說明書進(jìn)行，陽性細(xì)胞被染成棕黃色。   1.5  結(jié)果分析  Timm染色評分標(biāo)準(zhǔn)按苔蘚纖維出芽分級表進(jìn)行半定量評分8。0級：未見出芽；1級：偶見點(diǎn)狀出芽；2級：可見點(diǎn)狀或稀疏狀出芽；3級可見片狀出芽；4級：可見高度集中的片狀出芽；5級：可見濃密片狀出芽。N-Cadherin的表達(dá)結(jié)果以光密度（D）表示，運(yùn)用LEICA  Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)，隨機(jī)測定海馬CA3區(qū)部位，并同時測定同一張切片的胼胝體的D值作為背景，計(jì)算出校正D值。   1.

16、6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩均數(shù)間差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，苔蘚纖維出芽分級評分結(jié)果采用兩樣本比較秩和檢驗(yàn)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。   2  結(jié)  果   2.1  行為學(xué)觀察  實(shí)驗(yàn)組注射PTZ后12 min進(jìn)入潛伏期，大鼠由自由活動狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為安靜或伏臥，隨后出現(xiàn)眼神呆滯，頭面部肌肉輕微抽搐，出現(xiàn)濕狗樣抖動并伴有須動、耳抖和搔抓動作，繼而進(jìn)入大發(fā)作期，漸次出現(xiàn)前肢陣攣、奔跑跳躍、后肢站立伴頭偏向一側(cè)及全身陣發(fā)性抽動；達(dá)到V級發(fā)作的動物則表現(xiàn)

17、為摔倒、翻滾等全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，同時伴有喉鳴、口角流涎、肢端青紫等。發(fā)作持續(xù)約24 min后逐漸緩解，發(fā)作停止后，動物自行活動，若再次出現(xiàn)驚厥發(fā)作則被剔除。NS組：注射NS后無任何發(fā)作跡象和抽搐表現(xiàn)，行為正常。   2.2  Timm染色結(jié)果  NS組可見極少Timm染色顆粒，致驚后1周偶見Timm染色顆粒，與NS組相比無明顯差異（P0.05）；致驚后3周可見較多Timm染色顆粒沿海馬CA3區(qū)呈條帶樣分布，半定量評分在2分左右，較NS組明顯增加（P0.01)，見圖1A、表1 ；PDTC預(yù)處理組Timm染色顆粒較PTZ組減少(P0.05)，見圖1B。根

18、據(jù)苔蘚纖維發(fā)芽評分標(biāo)準(zhǔn)，致驚后3周CA3區(qū)Timm評分明顯高于相應(yīng)日齡NS組(P0.01)，但兩日齡組間無明顯差異（P0.05）。表1   致驚后13周海馬CA3區(qū)Timm染色評分   2.3  N-Cadherin免疫組化結(jié)果  NS組大鼠海馬可見少量N-Cadherin陽性細(xì)胞，著色不深；致驚后3周可見CA3和齒狀回門區(qū)有較多的N-Cadherin陽性細(xì)胞，主要表現(xiàn)為胞質(zhì)和核膜棕黃色，均勻彌漫染色（圖2A），利用顯微圖像分析系統(tǒng)測得D值明顯高于正常對照組(P0.01)，但兩日齡組間無明顯差異（P0.05），見表2。PDTC預(yù)處理組

19、兩日齡大鼠海馬CA3和齒狀回門區(qū)有較多的N-Cadherin陽性細(xì)胞，但明顯較PTZ組減少（P0.05），見圖2B。   3  討  論   MFS是指齒狀回顆粒細(xì)胞軸突發(fā)出側(cè)枝，改變了原來的走行方向，穿越顆粒細(xì)胞層，投射于內(nèi)分子層，形成纖維叢，并與此層密集的顆粒細(xì)胞及中間神經(jīng)元樹突形成新的突觸聯(lián)系，并能投射到CA3區(qū)的錐體細(xì)胞。SE實(shí)驗(yàn)鼠和癲疒間反復(fù)發(fā)作人類的海馬研究均表明在SE和癲疒間反復(fù)發(fā)作后的海馬結(jié)構(gòu)中存在著明顯的MFS現(xiàn)象。因此，目前認(rèn)為MFS是癲疒間發(fā)作后非常重要的病理改變，并與癲疒間的反復(fù)發(fā)作、認(rèn)知功能改變有著直接關(guān)系。

20、            本實(shí)驗(yàn)中我們采用PTZ腹腔注射誘發(fā)發(fā)育鼠急性化學(xué)點(diǎn)燃模型，利用特異的Timm染色方法對海馬苔蘚纖維發(fā)芽進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)14和28天日齡組在生理狀態(tài)下存在少量的Timm染色顆粒，而在單次驚厥后1周偶見苔蘚纖維發(fā)芽，但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管如此,這也表明正常生理狀態(tài)下存在著正常的MFS，因而發(fā)揮著正常的大腦生理功能。單次驚厥發(fā)生后1周異常的MFS即開始出現(xiàn)，3周后MFS改變最為明顯。這一現(xiàn)象既說明單次驚厥后的確存在著異常的MFS現(xiàn)象，同時也說明了驚厥后異常的MFS改變需要一定的

21、時間。Okazaki等8在海人酸（KA）致大鼠SE模型中發(fā)現(xiàn)苔蘚纖維發(fā)芽一般出現(xiàn)在致驚后的2周，并于2個月后達(dá)到高峰。黃亞玲等9研究發(fā)現(xiàn)，出生后10天幼鼠反復(fù)驚厥后23周也可見明顯苔蘚纖維發(fā)芽。因此，我們認(rèn)為不管是單次驚厥還是SE及反復(fù)發(fā)作都存在MFS異常改變，而且MFS與驚厥發(fā)作后的時間長短有一定的相關(guān)性。   從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出在單次驚厥發(fā)作后3周存在的MFS程度與實(shí)驗(yàn)鼠的日齡似乎沒有明顯的相關(guān)性，也就是說不管是14天日齡大鼠還是28天日齡大鼠在相同的刺激下在一定的時間內(nèi)均可以產(chǎn)生異常的MFS。但是，Cilio等10在毛果蕓香堿所致的SE模型中發(fā)現(xiàn)12天致驚大鼠

22、海馬內(nèi)無苔蘚纖維發(fā)芽現(xiàn)象，而在16天和20天致驚大鼠海馬卻出現(xiàn)明顯的苔蘚纖維發(fā)芽。Haas等11在KA模型中也發(fā)現(xiàn)16天致驚鼠于致驚后無苔蘚纖維發(fā)芽。因而表現(xiàn)出發(fā)育鼠驚厥后苔蘚纖維發(fā)芽可能具有一種年齡及動物模型的特異性。如何對此現(xiàn)象進(jìn)行解釋，目前尚無一致的看法，我們的觀點(diǎn)認(rèn)為可能與發(fā)作類型、發(fā)作持續(xù)時間及模型誘導(dǎo)劑等有關(guān)。   盡管本實(shí)驗(yàn)顯示致驚后13周海馬結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)異常的苔蘚纖維發(fā)芽，但是評分等級多為12分，少有更高的評分結(jié)果，且14、28天日齡大鼠的苔蘚纖維發(fā)芽無明顯差異，這可能與發(fā)作類型為單次驚厥、持續(xù)時間較短以及實(shí)驗(yàn)對象為幼鼠等諸多因素有關(guān)。Lemos等12的研究發(fā)

23、現(xiàn)，疒間性發(fā)作頻率高的大鼠比發(fā)作頻率低的大鼠苔蘚纖維發(fā)芽密度更高。   對于癲疒間發(fā)作如何誘導(dǎo)海馬異常苔蘚纖維發(fā)芽過程，目前眾說紛紜。有人認(rèn)為興奮性氨基酸受體上調(diào)是主要原因之一4，也有人認(rèn)為與神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)，也有人認(rèn)為與細(xì)胞黏附分子有關(guān)，認(rèn)為N-Cadherin在其中可能發(fā)揮著重要的作用13。   N-Cadherin是鈣黏附蛋白家族中第1個在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的成員，研究表明它在神經(jīng)發(fā)育中起著非常重要的作用。但是N-Cadherin在癲疒間發(fā)作誘導(dǎo)MFS過程中的作用與地位目前缺少深入研究。Fujita 等14在KA誘導(dǎo)的驚厥模型中

24、發(fā)現(xiàn)注射KA后1224 h，N-Cadherin mRNA的表達(dá)隨著神經(jīng)元的減少而減少，而在48 h至7 天，mRNA的表達(dá)部分恢復(fù)；而免疫組化染色顯示KA注射后48 h，N-Cadherin蛋白在存活神經(jīng)元中的表達(dá)明顯增高。這些結(jié)果表明N-Cadherin可能參與了海馬神經(jīng)元的重建。Shan等15發(fā)現(xiàn)在匹魯卡品誘導(dǎo)SE大鼠后14周N-Cadherin mRNA和N-Cadherin蛋白表達(dá)逐漸增高，并在發(fā)作后4周達(dá)到最高水平，更為重要的是N-Cadherin上調(diào)的部位和MFS的部位重合，因而認(rèn)為N-Cadherin與神經(jīng)再生和突觸重建密切相關(guān)。   在本研究中我們選擇單次

25、驚厥后3周作為觀察點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在明顯出現(xiàn)Timm染色顆粒的同時，N-Cadherin表達(dá)亦明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)的Timm染色顆粒和N-Cadherin陽性細(xì)胞均位于海馬CA3區(qū)，因此，我們認(rèn)為兩者在時間上及上調(diào)的部位有一致性，與SE模型結(jié)論一致13。   另外，我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PDTC預(yù)處理后MFS發(fā)生和N-Cadherin的表達(dá)較PTZ驚厥組明顯降低。PDTC作為NF-B的非特異性抑制劑，可以部分抑制驚厥后神經(jīng)元的凋亡，從而減弱了MFS發(fā)生的刺激因素，而作為纖維發(fā)芽、延伸和投射過程中的一個關(guān)鍵因子，N-Cadherin的表達(dá)也降低。   從本實(shí)驗(yàn)結(jié)

26、果可以看出, 同癲疒間持續(xù)狀態(tài)和反復(fù)癲疒間發(fā)作一樣，單次驚厥發(fā)作同樣存在不同程度的苔蘚纖維發(fā)芽，且N-Cadherin可能參與或促進(jìn)了苔蘚纖維的發(fā)芽。【參考文獻(xiàn)】  1 劉月影,袁寶強(qiáng).嚴(yán)重驚厥發(fā)作過程中核因子-B活化與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系J.中國當(dāng)代兒科雜志, 2005, 7(3):253-256.2 Yagita Y, Kitagawa K, Ohtsuki T, et al .Neurogenesis by progenitor cells in the ischemic adult rat hippocampus J. Stroke, 2001 ,32(8):1890-1896.

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