流式細(xì)胞術(shù)_百替生物

1、 第二十三章流式細(xì)胞術(shù)Chapter 23 Flow Cytometry第一部分 教學(xué)內(nèi)容和要求一、目的要求·掌握:流式細(xì)胞儀分析和分選原理、數(shù)據(jù)的顯示與分析,流式細(xì)胞儀免疫分析;熟悉:流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用;了解:流式細(xì)胞儀的組成及在免疫分析的質(zhì)量控制。二、教學(xué)內(nèi)容1。流式細(xì)胞儀的原理:流式細(xì)胞儀工作原理,細(xì)胞散射光信號(hào)測定,細(xì)胞熒光信號(hào)測定,細(xì)胞分選的原理2。數(shù)據(jù)的顯示與分析:參數(shù),數(shù)據(jù)顯示方式。3。流式細(xì)胞儀免疫分析:免疫檢測樣本的制備,常用的熒光染料與標(biāo)記染色,流式細(xì)胞儀免疫分析的質(zhì)量控制。4.流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用:淋巴細(xì)胞及其亞群的測定,淋巴細(xì)胞功能測定,白血病細(xì)

2、胞免疫分型,腫瘤耐藥基因分析,AIDS病程分析,自身免疫性疾病相關(guān)HLA分析。第二部分 測試題一、選擇題(一單項(xiàng)選擇題(A型題1.流式細(xì)胞儀的單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示方式是A.二維的散點(diǎn)圖B.等高線輪廓圖C.分布直方圖D.密度圖E.三維立體顯示2.關(guān)于前向散射光信號(hào),正確的是A.反映細(xì)胞質(zhì)中的顆粒成分B.可排除各種碎片對(duì)被檢細(xì)胞的干擾C.用于區(qū)分淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等D.細(xì)胞凋亡時(shí),前向散射光信號(hào)變強(qiáng)E.反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變3.關(guān)于流式細(xì)胞儀,錯(cuò)誤的敘述是A.可同時(shí)測量同一細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)B.采用List Mode數(shù)據(jù)貯存方式C.標(biāo)準(zhǔn)熒光微球和戊二醛固定的雞紅細(xì)胞是常用的質(zhì)控參考標(biāo)準(zhǔn)D.

3、只有一種數(shù)據(jù)顯示方式E.12min內(nèi)就能完成細(xì)胞大群體的定量分析4.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的常用方法是A.ELISAB.E花環(huán)試驗(yàn)C.尼龍毛法E.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(二多項(xiàng)選擇題(X型題1.流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)包括A.快速B.單細(xì)胞流C.單細(xì)胞檢測D.定量E.單細(xì)胞照明2.流式細(xì)胞儀常用的熒光染料有A.異硫氰酸熒光素B.藻紅蛋白C.PeCy5D.PeCy7E.ECD3.關(guān)于流式細(xì)胞儀的熒光標(biāo)記染色,正確的是A.避免使用固定劑B.減少離心C.減少洗滌次數(shù)D.必須在細(xì)胞懸液中進(jìn)行E.一般采用間接熒光免疫標(biāo)記方法4.流式細(xì)胞儀的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示方式有A.二維散點(diǎn)圖B.三維立體圖C.線性分布直方圖

4、D.對(duì)數(shù)分布直方圖E.等高線輪廓圖5.流式細(xì)胞術(shù)可用于A.檢測血清細(xì)胞因子水平B.檢測凋亡細(xì)胞C.白血病的免疫學(xué)分型D.檢測HLAE.T細(xì)胞檢測及其亞群分類6.檢測細(xì)胞可采用A.51Cr放法B.流式細(xì)胞術(shù)C.TUNEL法D.3H-TdR摻入法E.MTT法7.用于檢測T細(xì)胞免疫功能的試驗(yàn)是A.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)B.細(xì)胞毒試驗(yàn)C.流式細(xì)胞術(shù)D.溶血空斑試驗(yàn)E.結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)8.從T細(xì)胞中分離CD4+T細(xì)胞可用A.磁珠分離法B.流式細(xì)胞術(shù)C.ELISPOTD.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法E.TUNEL法9.檢測T細(xì)胞亞群可采用的方法是A.間接凝集試驗(yàn)B.MTT法C.間接熒光免疫法E.沉淀試驗(yàn)10.

5、流式細(xì)胞儀免疫分析的質(zhì)量控制A.儀器的質(zhì)控B. 免疫熒光對(duì)照C.雙熒光或多熒光分析中熒光色的標(biāo)定D.試劑標(biāo)準(zhǔn)化E.操作標(biāo)準(zhǔn)化二、填空題1.流式細(xì)胞儀的組成包括_、_和_三部分。2.流式細(xì)胞儀的散射光參數(shù)包括 _和_。其中_信號(hào)反映細(xì)胞的大小,常用于排除樣品中各種碎片對(duì)被測細(xì)胞的干擾;_信號(hào)反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)信息,常用于區(qū)分外周血樣品中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。3. _和_組成細(xì)胞雙信號(hào)參數(shù)散點(diǎn)圖,是流式細(xì)胞分析中最常用的測量和顯示細(xì)胞的方式。4.能對(duì)免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定和分類的技術(shù)是_,使用的儀器是_,主要試劑是_。三、名詞解釋1.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytome

6、try,FCM2.細(xì)胞分選(cell sorting3.List Mode4.熒光補(bǔ)償技術(shù)(fluorescent compensation四、問答題1.簡述流式細(xì)胞儀的工作原理。2.論述流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用。3.簡述細(xì)胞分選的原理。第三部分參考答案與題解一、選擇題(一單項(xiàng)選擇題(A型題1.C2.B3.D4.E(二多項(xiàng)選擇題(X型題1.ABCDE2.ABCDE3.ABCD4.ABE5.BCDE6.BC7.ABCDE8.AB 9.CD 10.ABCDE二、填空題1.流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)激發(fā)光與光束成形系統(tǒng)細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng)2.FS SS FS SS3.FS SS4.流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)

7、胞儀熒光標(biāo)記的單克隆抗體三、名詞解釋1.流式細(xì)胞術(shù):是指借助流式細(xì)胞儀,精確、快速地對(duì)生物細(xì)胞的理化特性和生物學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析,并對(duì)特定細(xì)胞群體分選的新技術(shù)。2. 細(xì)胞分選:是指從細(xì)胞群體中將選定的細(xì)胞分離出來。3. List Mode方式:是指用表格將每一個(gè)被測細(xì)胞的眾多原始數(shù)據(jù)全部記錄下來,形成數(shù)據(jù)文件。4. 熒光補(bǔ)償技術(shù):是指利用已知標(biāo)準(zhǔn)樣品或根據(jù)細(xì)胞樣品的生物學(xué)意義,合理設(shè)置各熒光信號(hào)之間的相互補(bǔ)償值。四、問答題1.流式細(xì)胞儀是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下高度自動(dòng)化的顯微熒光脈沖分光光度儀,可分為三個(gè)部分:(1細(xì)胞流動(dòng)室及其液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng):細(xì)胞樣品和包裹在外的鞘液在氣體正壓的驅(qū)動(dòng)下一起

8、流經(jīng)流動(dòng)室,其中的細(xì)胞一個(gè)一個(gè)排列成單行,逐個(gè)以相同的速度、相同的軌跡通過檢測區(qū),此為流式細(xì)胞儀的單細(xì)胞流技術(shù);(2激發(fā)光及其光束成形系統(tǒng):流式細(xì)胞儀的激發(fā)光大多采用氬離子氣體激光器,也可采用半導(dǎo)體激光器。儀器中一般都采用兩塊相互垂直放置的柱面透鏡組成光束成形系統(tǒng),對(duì)激光束進(jìn)行適當(dāng)?shù)木劢?形成截面為橢圓形的照射光斑即檢測區(qū)。橢圓形光斑的檢測區(qū)能保證樣品中細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到光照,并且每一受檢細(xì)胞都受到一致的光照激發(fā),此為流式細(xì)胞儀中的單細(xì)胞照明技術(shù);(3細(xì)胞信號(hào)檢測與分析處理系統(tǒng):細(xì)胞受到激發(fā)光照射時(shí),產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。光電倍增管及其電子線路將每一細(xì)胞的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào),后者再通

9、過模數(shù)轉(zhuǎn)換器( ADC 量化為數(shù)字信號(hào),由計(jì)算機(jī)采集、分析、顯示與存貯等,此為流式細(xì)胞儀的單細(xì)胞檢測技術(shù)。2.(1淋巴細(xì)胞及其亞群的測定:通過FCM檢測淋巴細(xì)胞的CD分子,可鑒定淋巴細(xì)胞并計(jì)算出淋細(xì)胞各亞群的百分率;(2淋巴細(xì)胞功能測定:通過FCM檢測淋巴細(xì)胞的表面受體及各種細(xì)胞因子,可區(qū)分各種淋巴細(xì)胞,并推測其功能。FCM還可快速測定混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒、細(xì)胞吞噬功能等;(3白血病細(xì)胞免疫分型:FCM 能快速、精確地分析白血病細(xì)胞系免疫表型的來源及分化階段,用于各種血液腫瘤的原發(fā)性診斷、鑒別、分型分期、療效觀察、殘存瘤細(xì)胞檢測、腫瘤復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)、骨髓移植后的成功與再生檢測;(4腫瘤耐藥基因分析:FCM能快速檢測細(xì)胞P-gp表達(dá),報(bào)告MDR并提示預(yù)測療效,及時(shí)更改治療方案;(5AIDS病程分析:通過FCM檢測Th細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、Th/Tc比值,可及時(shí)進(jìn)行藥物治療干預(yù)和療法評(píng)估;(6自身免疫性疾病相關(guān)HLA分析:通過FCM檢測細(xì)胞某些HLA異常表達(dá),可用于多種生理和病理狀態(tài)的研究。3. 細(xì)胞分選(cell sorting是指從細(xì)胞群體中將選定的細(xì)胞分離出來。細(xì)胞分選時(shí),振蕩裝置充電產(chǎn)生每秒4萬次的振動(dòng)頻率,使噴嘴射出一連串均勻的成千上萬個(gè)小液滴,流動(dòng)