血細胞儀白細胞五分類法原理和散點圖特征

1、血細胞儀白細胞五分類法原理和散點圖特征北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 張時民血細胞分析技術(shù)已經(jīng)進入自動化時代，而具有白細胞五分類或更多分析參數(shù)的儀器也普遍的應用于國內(nèi)各級醫(yī)院試驗室中，為臨床診斷和治療服務。而具有18項參數(shù)帶有白細胞三分群功能的血細胞分析儀也已經(jīng)普及進入到基層醫(yī)院和社區(qū)醫(yī)療中心，在很多大型醫(yī)院中已不占主流位置，因此可以說目前在較大醫(yī)院的檢驗科，常規(guī)血細胞分析儀已經(jīng)進入全自動化和白細胞五分類的時代。 本文主要介紹全自動血細胞分析儀在白細胞五分類上的原理和散點圖分布特點。此類儀器在紅細胞、血紅蛋白、血小板和計算參數(shù)上一般會接受類似的測定原理和計算方法，此類儀器的進展和其功能特點可參考

2、作者撰寫的其它文章（見參考文獻）。具有白細胞五分類功能的血細胞分析儀器是指通過各種物理和化學技術(shù)對白細胞進行分析，以獲得外周血液中白細胞的五種常見類型，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，淋巴細胞和單核細胞的百分率和確定值的測定結(jié)果，此外還應當具有對消滅特別白細胞的提示或初步分類功能。目前國內(nèi)外具有開發(fā)研制白細胞五分類法儀器的主要為歐美和日本生產(chǎn)廠商，比較有名的歐美廠家有Beckman-Coulter；ABBOTT；Siemens（Bayer）；ABX；日本有Sysmex和Nihon Kohdon。在國內(nèi)已經(jīng)有邁瑞（MINDRAY）公司生產(chǎn)幾個型號的五分類血細胞分析儀器投入醫(yī)療市場。一

3、簡要進展史 1974年，一種名為HEMALOG D的具有初步白細胞分類功能的白細胞分析儀問世。1982年，Technicon公司生產(chǎn)了H6000型血液細胞分析儀器，應當是首款具有白細胞五分類力量的儀器。同時代日本日立公司推出圖像分析法的白細胞分析儀HITACHI 8200型，僅僅是用于完成白細胞血片分類的儀器，沒有其他血細胞計數(shù)分析力量。 Technicon 公司1985 年開發(fā)了比較成熟的具有白細胞五分類功能的Technicon H1 型血液細胞分析儀，隨后升級為H2型和H3型。 COULTER公司在1987 年開發(fā)研制其經(jīng)典VCS技術(shù)，并推出持續(xù)具有多年影響力

4、的、具有白細胞五分類功能的血液細胞分析儀MAXM 型。 1990年前后，歐洲和日本很多廠家都間續(xù)推出了各種類型的具有白細胞五分類功能的血細胞分析儀器。各廠家設計生產(chǎn)的此類血細胞分析儀，其在白細胞分類技術(shù)上原理各不相同，分析測定項目略有不同，且形式多樣，結(jié)構(gòu)簡單，試劑種類和成分也趨于簡單。不斷改進和升級的新產(chǎn)品使得儀器在白細胞分類技術(shù)上更加成熟和牢靠。而技術(shù)的提高也帶來了儀器和消耗品（試劑）價格的增加。二 儀器原理和散點圖特點 1 體積、電導和激光散射原理   這是BeckmanCoulter公司生產(chǎn)的血細胞分析儀所接受的經(jīng)典分析方法，他集三種物

5、理學檢測技術(shù)于一體，在細胞處于自然原始的狀態(tài)下對其進行多參數(shù)分析。該方法也稱為體積、電導、激光散射血細胞分析法。此技術(shù)接受在標本中首先加入紅細胞溶血劑溶解掉紅細胞，然后加入穩(wěn)定劑來中和紅細胞溶解劑的作用，使白細胞表面、胞漿和細胞體積保持穩(wěn)定不變。然后應用鞘流技術(shù)將細胞推動到流淌細胞計數(shù)池（Flowcell）中，接受儀器VCS三種技術(shù)的檢測。   V代表體積（Volume）測量法，是接受經(jīng)典的庫爾特專利技術(shù)，用低頻電流精確分析細胞體積。體積是區(qū)分白細胞亞群的一個重要的參數(shù)，它可有效區(qū)分體積大小差異顯著的淋巴細胞和單核細胞。C代表高頻電導性（Conductivity）

6、，接受高頻電磁探針原理測量細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)間的差異，也是該公司的專利技術(shù)。細胞膜對高頻電流具有傳導性，當電流通過細胞時，細胞核的化學組份可使電流的傳導性產(chǎn)生變化，其變化量可以反映出細胞內(nèi)含物的信息。該參數(shù)可用來區(qū)分體積相近而內(nèi)部性質(zhì)不同的細胞群體，如淋巴細胞和嗜堿性粒細胞，由于它們的細胞核特性不同而在傳導性參數(shù)上有所區(qū)分。S代表激光散射（Scatter）測量技術(shù)，接受氦氖激光源發(fā)出的單色激光掃描每個細胞，收集細胞在10°70°角度內(nèi)消滅的散射光 (MALS)信號。該激光束可穿透細胞，探測細胞內(nèi)核分葉狀況和胞漿中的顆粒狀況，供應有關(guān)細胞顆粒性的信息，可以區(qū)分出顆粒特性不同的細胞群

7、體。例如細胞內(nèi)顆粒粗的要比顆粒細的散射光更強，因此可以用于區(qū)分粒細胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜堿性三種細胞。 圖1 VCS法的測定原理   儀器將分析每個細胞在V、C、S 三種檢測技術(shù)上的測量結(jié)果，由于不同類別的細胞會在體積、表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面呈現(xiàn)明顯的不同。將這些特征性信息被定義到以VCS為三維坐標(辨別率為256×256×256=16,777,216)所形成的立體散點圖中，這五類細胞可在三維空間中形成特定的細胞群。通過計算某群細胞數(shù)量占白細胞總數(shù)的百分比，即可得到五項白細胞分類結(jié)果。儀器不僅僅做出對正常白細胞的五項分類結(jié)果，給出

8、典型的散點圖型，還可以提示很多特別細胞區(qū)域的報警。 圖2 各類白細胞在VCS三維空間中的分布特點VCS技術(shù)可通過DF1、DF2、DF3三個散點圖將五種類型白細胞明顯區(qū)分開。三個散點圖的縱坐標均定義為細胞體積。DF1為細胞體積和激光散射的直方圖，DF2和DF3為細胞體積和高頻電導性的直方圖，DF3為除去粒細胞群體后顯示出淋巴細胞后面的嗜堿性粒細胞圖像。圖3 各類白細胞在散點圖中的分布特點 VCS技術(shù)是BeckmanCoulter公司開發(fā)研制的經(jīng)典專有方法，到目前為止的各種高檔血細胞分析儀均接受該方法對白細胞進行分析。該方法在白細胞分析上尚有特殊力量，例如可以測定和分析中性粒細

9、胞的體積、核漿比例、細胞顆粒特性等參數(shù)，也就是將中性粒細胞的VCS三個參數(shù)分別給出，用于了解細菌感性疾病與其它疾病的區(qū)分。也可對淋巴細胞、單核細胞等均作出其細胞群體的三個技術(shù)參數(shù)值，是比較有前景的爭辯內(nèi)容。   儀器在RBC、PLT、WBC計數(shù)上照舊接受電阻抗法，血紅蛋白仍舊接受比色法測定。該公司的五分類法血細胞分析儀先后推出多種類型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755和最新的LH780等型號，在某些機型還具有網(wǎng)織紅細胞分析功能和T淋巴細胞亞群分析功能。2. 電阻抗、射頻和細胞化學技術(shù)日本Sysmex公司系列血細胞分析儀是在國內(nèi)應用格外廣泛的儀器

10、，從三分類法到五分類法的各種型號儀器都有大量用戶。其儀器型號種類豐富，功能和測定參數(shù)各異，其各種儀器間均有近似的檢測原理，但在結(jié)合特定的功能以達到不同的分析目的方面，其原理和所用試劑又有不完全相同之處。本文以目前其最高配置的XE-2100型血細胞分析儀為例說明其在白細胞計數(shù)和分類方面的原理和特點。 Sysmex XE-2100在白細胞分類上接受半導體激光流式細胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)進行白細胞計數(shù)和分類。半導體激光照射在通過鞘流技術(shù)處理的細胞上，可依據(jù)每個細胞所產(chǎn)生的三種信號來鑒別細胞類別。前向散射光（FSC）信號可反應細胞體積大?。粋?cè)向散射光（SSC）信號可反應細胞的顆粒和細胞核

11、等內(nèi)含物的信息；側(cè)向熒光（SFL）強度信號則用于分析細胞內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量。在白細胞分析上主要接受兩個通道進行細胞計數(shù)和分類，兩個通道均接受激光和鞘流進樣的方式測定。DIFF通道： STROMATOLYSER-4DL試劑中的表面活性劑可以溶解掉標本中的紅細胞和血小板，并在白細胞膜上打出小孔；然后其次種試劑 STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通過這個小孔進入白細胞中，與細胞核的核酸和細胞器結(jié)合，在經(jīng)過波長633nm的激光照射，產(chǎn)生的熒光強度與細胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL試劑還具有與嗜酸性顆粒特異性結(jié)合的力量，可依據(jù)側(cè)向

12、散射光信號強度，將嗜酸性粒細胞從中性粒細胞中分別出來。這樣可以將中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞清楚的分別開。在DIFF散射圖當中可以得到白細胞的四個分群（LMNE）。WBC/BASO通道是專用作檢測嗜堿性粒細胞的通道，由于嗜堿性粒細胞數(shù)量格外少，因此必需接受特殊技術(shù)處理。STROMATOLYSER FB是一種酸性試劑，可將紅細胞和血小板形成淡影化，將除嗜堿性粒細胞以外的白細胞處理成裸核形態(tài)，然后接受前向散射光（FSC）信號和側(cè)向散射光（SSC）信號使嗜堿性粒細胞從其它細胞中分別出來。前向散射光與細胞體積測定相關(guān)，側(cè)向散射光與裸核后的細胞結(jié)構(gòu)簡單性有關(guān)。在這個通道中可以獲得白細胞總

13、數(shù)和嗜堿性粒細胞的數(shù)量。圖4 Sysmex XE-2100白細胞分類散點圖 儀器在稚嫩粒細胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI檢測通道中主要應用射頻（RF）技術(shù)和直流電阻抗法（DC）。這個測定通道依據(jù)稚嫩細胞膜表面比成熟細胞膜表面含有脂質(zhì)少的現(xiàn)象，在稀釋液中加入硫化氨基酸（IM試劑），由于占位不同，結(jié)合在稚嫩細胞表面的氨基酸較多，對溶血劑有抵制作用，對稚嫩細胞具有愛護作用。當加入溶血劑后成熟細胞易被溶解掉，而稚嫩細胞不易被溶解破壞，可通過電阻法檢測出來。射頻技術(shù)用于測量細胞核的大小和顆粒的多少，而直流電信號可反應出細胞體積的大小。 在有核紅細胞計數(shù)上通過特地的有核紅細胞檢測程序和專用

14、通道-NRBC通道，在處理標本時加入STROMATOLYSERNR專用試劑，它能使成熟紅細胞溶解又可保持有核紅細胞的核結(jié)構(gòu)，同時也將白細胞保持完好。STROMATOLYSERNR試劑中的聚次甲基熒光染料可滲透進入白細胞膜內(nèi)，將白細胞和有核紅細胞的核染色。通過檢測熒光強度得到：白細胞核大熒光強度高，有核紅細胞核小，熒光強度低，正常紅細胞無細胞核和裂開，熒光強度極低。依據(jù)熒光強度差和前向散射光信號測定的細胞體積差，可將有核紅細胞從其他細胞群中區(qū)分出來。 圖5 Sysmex XE-2100 的稚嫩細胞通道和有核紅細胞通道散點圖 該儀器在紅細胞和血小板的計數(shù)和分析上仍舊沿用了經(jīng)典的

15、電阻抗方法，在血紅蛋白測定上接受了無劇毒物質(zhì)的SLS溶血劑比色法。3 激光散射和細胞化學染色技術(shù)最早接受該技術(shù)的是Technicon公司的H1,H3型，現(xiàn)在的最新型為西門子公司的Advia120型和2120型（2007年以前為Bayer公司產(chǎn)品）。他是一款開發(fā)比較早的高等級儀器，其在白細胞分類上接受了過氧化酶測定通道和嗜堿粒細胞測定通道。依據(jù)細胞化學染色的特性進行白細胞分類。在紅細胞和血小板分析都接受了雙角度激光法。在儀器的管路、電磁閥門、反應杯上接受了獨特設計的集成液流版管路系統(tǒng)，是目前血細胞分析儀中所獨有和特有的技術(shù)。集成液流板實際上是將各種管路和電磁閥門、反應杯等血球計數(shù)儀的常用硬件進行

16、綜合處理，系統(tǒng)化，微小化，透亮化和集成化。形成的集成板被放置在儀器的明顯部位，便利觀看，并具肯定的美觀效果。其另一特點則是細小的管路和反應杯可是標本和試劑用量明顯削減。圖6 Advia 120的集成液流板。在白細胞分類上，該儀器接受兩個通道進行，一個為過氧化酶檢測通道，另一個為嗜堿細胞檢測通道。 過氧化酶反應（peroxidase，POX）是血涂片染色的一個常用細胞化學染色方法，用于鑒別原始細胞與成熟的粒細胞，鑒別粒細胞與非粒細胞。染色后的細胞內(nèi)無藍黑色顆粒消滅為陰性反應，消滅細小顆?；蛳∈铇臃植嫉暮谏w粒為弱陽性反應，消滅黑色粗大而密集的顆粒為強陽性反應。過氧化物酶主要存在于粒細胞

17、系和單核細胞系中，各類白細胞對過氧化物酶的反應是這樣的：早期的原始粒細胞為陰性，早幼粒以后的各階段都含有過氧化物酶，并隨著細胞的成熟過氧化酶含量漸漸增加，中性分葉核粒細胞會消滅強陽性反應，嗜酸性粒細胞具有最強的過氧化物酶反應，嗜堿粒細胞不含此酶呈陰性反應。在單核細胞系統(tǒng)，除早期原始階段外，稚嫩單核和單核細胞會消滅較弱的過氧化物酶反應。淋巴細胞、稚嫩紅細胞、巨核細胞等都為過氧化物酶陰性反應。Advia 120/2120血細胞分析儀的過氧化酶（Perox）檢測通道就是依據(jù)這個原理設計的，它檢測每一個通過流淌計數(shù)池中的白細胞，經(jīng)過激光照射所產(chǎn)生的過氧化酶散射光吸取率，來當然試劑和幫助試劑均進行了改良

18、。在Perox通道所產(chǎn)生的散點圖，橫軸表示在5°-15°激光散射獲得的細胞過氧化物酶含量狀況，縱軸是低角度散射光測量的細胞體積大小。在此通道內(nèi)細胞被分為五類。1）過氧化酶最強陽性的嗜酸性粒細胞；2）過氧化酶強陽性的嗜中性分葉核粒細胞；3）體積較大、過氧化酶弱陽性的單核細胞；4）體積較小、過氧化物酶陰性的淋巴細胞；5)體積大于淋巴細胞且過氧化物酶陰性的未染色大細胞，此類細胞增加提示稚嫩或原始的各類細胞可能消滅。在嗜堿細胞（Baso）通道中接受的檢測原理是：專用的嗜堿細胞試劑（Baso）將除了嗜堿細胞以外的白細胞除去細胞膜，使其裸核化并體積變小，僅將嗜堿性粒細胞保持原有狀態(tài)，體

19、積明顯大于其他類的白細胞。在散點圖上處于上面區(qū)域的為嗜堿性粒細胞；散點圖的橫坐標可表示細胞核結(jié)構(gòu)的簡單性，處于左側(cè)的為單個核的細胞群，包括單核細胞和淋巴細胞；處于右側(cè)的為分葉核細胞；中間部位則考慮為桿狀核細胞；左下端為單個核的原始細胞區(qū)。圖7：ADVIA 120/2120儀器Perox通道和Baso通道散點圖該儀器在紅細胞、血小板的測定上也接受了光學檢測技術(shù)。通過激光照射掃描每個通過Flowcell的紅細胞，低角度散射光（2 °3 °）用于測量細胞體積；高角度(5°15°)散射光測量每個紅細胞內(nèi)的血紅蛋白濃度（CH）和血紅蛋白含量平均值CHCM。這兩個值

20、不受紅細胞數(shù)量和血紅蛋白測定的影響。還可依據(jù)每個紅細胞內(nèi)血紅蛋白濃度，計算出紅細胞內(nèi)血紅蛋白分布寬度（HDW）值。其依據(jù)紅細胞在體積大小和單個紅細胞內(nèi)血紅蛋白含量的分析，將紅細胞劃分為9個區(qū)域，得到紅細胞體積和色素含量分布的九分圖，也是該儀器在紅細胞分析方面獨有的特色，依據(jù)紅細胞分布狀況可初步推斷疾病類別（下圖中）。在血小板計數(shù)分析上也同樣接受了二維光散射分析法，即可獲得血小板體積大小，可測量160fl內(nèi)的各種大小不同的血小板，還可對血小板內(nèi)容物含量（MPC）進行測定。血紅蛋白測定接受連續(xù)流淌比色法和紅細胞散射光直接測定法兩種方法，有助于高脂血和高膽紅素血標本的血紅蛋白測定精確性。圖8：ADV

21、IA 120/2120 紅細胞散點圖（左）和血小板散點圖（右）4 雙鞘流技術(shù)和細胞化學染色法 ABX是法國生成血細胞分析儀器的有名廠家，其生產(chǎn)的全自動血細胞分析儀Pentra 120型為其高端產(chǎn)品。在白細胞分類上接受該公司特有的專利技術(shù)-雙鞘流（DHSS）分析法。雙鞘流是專利技術(shù)，而測定本身是通過電阻抗和光吸取法雙重原理。標本首先在第一鞘流液中經(jīng)過電阻抗測定分析，得到細胞體積測定結(jié)果，然后通過其次鞘流引導再行光吸取率分析，對細胞內(nèi)容物進行測定，最終將細胞測定信息在散射圖相應的位置表現(xiàn)出來。雙鞘流技術(shù)的核心部件是含有紅寶石小孔的簡單的鞘流池，在雙鞘流系統(tǒng)的上下兩端分別加上恒定電流，是保

22、證電阻法的測量要素。為了保證被檢測的細胞能夠正確通過計數(shù)孔和鞘流通道，需要利用外來鞘流來進行矯正，因此通過左側(cè)鞘流泵注入稀釋液形成第一鞘流液，其作用是愛護溶液能夠直接通過計數(shù)小孔，并且保證其中攜帶的細胞處于中心部位，液流不發(fā)生偏移和扭曲；溶液通過計數(shù)小孔后，再通過中間鞘流泵注入稀釋液形成其次股鞘流，用以保證吸光度測量。這樣的過程被稱為雙鞘流分析技術(shù)。圖9 雙鞘流技術(shù)示意圖 儀器通過兩個通道來完成白細胞的五項分類。其接受的細胞化學染色技術(shù)（Cytochemistry）的原理是經(jīng)典的細胞分類技術(shù)，此染色劑中含有溶血素及氯唑黑活體染料（Chlorazol Black E）。在儀器的LMNE

23、檢測池中，全血樣品與染色劑充分混勻，在35條件下進行孵育，此過程的作用是： 溶解紅細胞 對單核細胞的初級顆粒、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的特異顆粒進行不同程度的染色，同時對細胞的膜（細胞膜、核膜、顆粒膜）也進行不同程度的著色 固定細胞的形態(tài)，使其保持自然狀態(tài)。由于淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞對染色劑的著色程度不同、每種細胞特定的細胞核形態(tài)和顆粒的結(jié)構(gòu)造成光散射的強度不同，產(chǎn)生了特定的吸光率。 染色后的標本被引導進入鞘流池進行雙鞘流分析，首先經(jīng)過60mm紅寶石小孔進行電阻法分析，用于推斷細胞體積大小，在LMNE散點圖上的橫坐標即可表示出細胞大小的特性。然后樣本快速進入直徑

24、為42mm的其次鞘流檢測通道進行光吸取率測定，以推斷細胞形態(tài)和內(nèi)容物等狀況。依據(jù)每類細胞在這兩個分析參數(shù)上所表現(xiàn)出來的特性，形成二維分布的散點圖。在此通道內(nèi)可完成白細胞中淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和嗜酸細胞群的分類。此通道內(nèi)在分析的同時還能夠檢測兩群特別白細胞亞群：巨大未成熟細胞（LIC）百分比及確定值，異型淋巴細胞（ALY）百分比及確定值，同時還可供應多達82種提示和報警信息。在LMNE散點圖上，各類白細胞的特點是：淋巴細胞：典型的淋巴細胞體積較小、形態(tài)規(guī)章、胞漿內(nèi)沒有顆粒，其吸光率最低，所以定位在散點圖的右下部矩陣中，正常淋巴細胞散點圖為正態(tài)體積分布。單核細胞：典型的單核細胞體積較大、

25、腎狀核、胞漿內(nèi)有初級顆粒（幾乎不著色），細胞核大且不分葉，光散射較少，所以位于吸光率軸的最下端，依據(jù)單核細胞的體積，位于體積軸的最右端，而特別單核細胞及特大單核細胞則可能消滅在LIC的矩陣中。中性粒細胞：典型的中性粒細胞具有嗜中性顆粒及分葉核的結(jié)構(gòu)，中性顆粒部分著色，同時由于顆粒及核的分葉等形態(tài)上的簡單性，而產(chǎn)生光散射。所以中性粒細胞群散點圖位于中部。核分葉越多的中性粒細胞，吸光性越強，在散點圖上的位置向右移。同時桿狀細胞（Bands）體積與中性粒細胞接近，但核的簡單程度低，吸光率低，散點圖位于中性粒細胞與單核細胞之間。嗜酸性粒細胞：由于嗜酸性粒細胞含有特異性顆粒，與染色液特異性著色，其著色強

26、度最深，位于Y-軸的最上端，此方法提高了嗜酸性粒細胞的分類的精確性。巨大未成熟細胞（Large Immature Cell）：未成熟粒細胞因其體積較大，可含有顆粒，光散射強，位于嗜中性粒細胞散點圖的右側(cè)，在LIC矩陣圖中從左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒細胞，另外各種原始細胞位于單核細胞的右側(cè)區(qū)域中。由于此散點圖中可能有大單核細胞，可引起LIC假性計數(shù)增加（LIC的計數(shù)結(jié)果被計算到在嗜中性粒細胞中）。LIC包括：大單核細胞、高嗜堿性的單核細胞、巨大中性粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞、原始細胞。異型淋巴細胞(Atypical Lymphs)：在散點圖中位于淋巴細胞與單核細胞之間的

27、一群細胞，包括：小原始粒細胞、大淋巴細胞等。在WBC/BASO檢測池中，全血樣品與BasolyseII（PH2.4）溶血素混合，在35°C恒溫下，溶解紅細胞，由于嗜堿性粒細胞具有抗酸性，能夠保持形態(tài)完整，而其他白細胞胞漿溢出，成為裸核狀態(tài)。細胞通過一個直徑為80mm的鞘流微孔時，依據(jù)電阻抗原理進行測定，以細胞體積大小為橫坐標繪制WBC/BASO直方圖。依據(jù)閾值設定區(qū)分裸核化的白細胞與嗜堿性粒細胞。在直方圖上可以看出在中心界標左側(cè)的是細胞體積變小的其它細胞群，界標右側(cè)是體積較大的嗜堿性粒細胞。因嗜堿性粒細胞數(shù)量極少，因此在直方圖上基本見不到明顯分布曲線和峰。圖10 ABX血細胞分析儀L

28、MNE散點圖和BASO直方圖 紅細胞和血小板仍舊接受電阻抗原理測定，血紅蛋白接受比色法。此為在軟件系統(tǒng)中接受了浮動界標技術(shù)用于血小板計數(shù)及嗜堿細胞計數(shù)，直方圖的界標會依據(jù)細胞群的變化做出相應的自動調(diào)整。血小板計數(shù)上還接受了防返流裝置，目的為防止渦流現(xiàn)象對血小板計數(shù)產(chǎn)生影響。在白細胞計數(shù)過程中還接受了白細胞平衡檢測原理（WBC Count Balance），使得白細胞計數(shù)在WBC/HGB通道中與LMNE雙鞘流池計數(shù)結(jié)果相聯(lián)系，假如消滅較大差別則可進行報警提示。最近該廠推出新一代ABX Pentra DX120型血細胞分析儀，其測定原理仍舊接受雙鞘流技術(shù)。接受新技術(shù)擴展了散點圖分布范圍，

29、形成可對血液中未成熟的粒細胞、單核細胞和淋巴細胞共20個參數(shù)的分類或提示性報告信息，這對特別血細胞的篩檢供應了很大掛念。圖11 Pentra DX120型稚嫩細胞散點圖5 多角度偏振光激光散射技術(shù)美國雅培公司（ABBOTT）推出的血細胞分析儀，在白細胞分類中接受獨特的多角度偏振光散射（MAPSS）技術(shù)，其所生產(chǎn)的血細胞計數(shù)儀從CELL-DYN 3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（藍寶石），在白細胞分類上均接受了MAPSS技術(shù)。該技術(shù)基本原理是細胞在激光束的照射下，在多個角度都產(chǎn)生散射光，儀器在四個角度的四個檢測器將接收到的相應的散射光信號，然后經(jīng)過微處理器分

30、析處理，將各類細胞安置在散點圖上的相應位置，并計算出白細胞分類結(jié)果。多角度偏振光散射白細胞分類技術(shù)（MultiAngle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是肯定體積的全血標本用鞘流液按適當比例稀釋。其白細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，因嗜堿性粒細胞顆粒具有吸濕的特性，所以嗜堿性粒細胞的結(jié)構(gòu)有稍微轉(zhuǎn)變。紅細胞內(nèi)部的滲透壓高于鞘液滲透壓而發(fā)生轉(zhuǎn)變，紅細胞內(nèi)的血紅蛋白從細胞內(nèi)游離出來，而鞘液內(nèi)的水分進入紅細胞中，細胞膜的結(jié)構(gòu)仍舊完整，但此時的紅細胞折光指數(shù)與鞘液的相同，故紅細胞不干擾白細胞檢測。在鞘流系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個直

31、徑30m的小股液流，該液流將稀釋的血細胞單個排列，然后通過激光束，激光照射于細胞上，在各個方向都有其散射光消滅。0°為前向角散射（1°3°）光，可粗略地測定細胞大小；10°為狹角散射光（7°11°），可測細胞結(jié)構(gòu)及其簡單性的相對特征；90°為消偏振光散射（70°110°），基于顆?？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦裕瑢⑹人峒毎麖闹行粤＜毎推渌毎蟹謩e出來。90°垂直光散射（70°110°），主要對細胞內(nèi)部顆粒和細胞成分進行測量。這四個角度同時對單個白細胞進行測量和分析后

32、，即可將白細胞劃分為嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞5種。ABBOTT的五分類法定量很有意思，不用傳統(tǒng)的體積定量，而是接受數(shù)量定量，每次計數(shù)時完成10000個細胞測定即停止。圖12 MAPSS測定原理示意圖 該類型儀器除了基本的白細胞五分類外，還供應了其它特別白細胞的信息和報警，供應應檢驗者參考，以通過人工顯微鏡檢查復核這些結(jié)果，例如特別淋巴細胞、原始細胞、未成熟粒細胞、桿狀核中性粒細胞。圖13 ABBOTT CELL-DYN五分類血細胞分析儀各類白細胞在散射圖上的分布圖6 激光散射技術(shù) 圖14 日本光電MEK7222型五分類血細胞分析儀散點圖日本

33、光電公司是開發(fā)和生產(chǎn)五分類血細胞分析儀的廠家之一，目前所知僅有兩款類型的儀器投入市場，均接受相同的測定原理，型號是MEK-7222和MEK-8222。其WBC、RBC和PLT計數(shù)原理接受電阻法，白細胞分類測定接受鞘流技術(shù)和激光散射原理。在鞘流液中白細胞通過管路進入鞘流池內(nèi)，激光照射白細胞后發(fā)生的各種散射光，依據(jù)血細胞的體積、血細胞的簡單性（有無顆粒、核的構(gòu)造等）的不同，散射光的強度和方向有所不同。激光直進方向和同方向小角度的散射光（表示Size）、激光直進方向和同方向大角度的散射光（表示Complexity）、與激光直進方向相對垂直的方向的散射光（表示Granularity）為參數(shù)的作為散點圖

34、，對淋巴細胞、單核細胞、嗜中性白細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞進行分類。Size表示血細胞的大小、Complexity表示白細胞結(jié)構(gòu)的簡單度、Granularity表示白細胞顆粒的程度。接受此原理可供應了三個散射圖，MAIN散點圖、 NE-EO散點圖 和MO-BA散點圖。在MAIN散點圖上（大圖部分）下面散點表示淋巴細胞群，右側(cè)為粒細胞群；兩個小圖，NE-EO為中性粒細胞和嗜酸性粒細胞散點圖，MO-BA為單核細胞和嗜堿性粒細胞細胞散點圖。此外儀器還能給出大的不成熟細胞（LIC）提示信息。 7 邁瑞激光散射和細胞化學染色技術(shù) 邁瑞（MINDRAY）公司是國內(nèi)最早有力量生產(chǎn)五

35、分類血細胞分析儀的廠家，他們目前生產(chǎn)有三種型號的五分類血細胞分析儀。BC-5500，BC5380和BC5300型自動五分類血液細胞分析儀，接受半導體激光散射技術(shù)和細胞化學染色技術(shù)，協(xié)作改良的流式分析裝置對白細胞進行精確的五分類分析。BC-5500型為目前最高配置，可選擇使用靜脈血或預稀釋末梢血，均能獲得良好的各種細胞計數(shù)結(jié)果和白細胞五分類結(jié)果?？晒?7項計數(shù)和計算參數(shù)、2個散點圖和2個直方圖以及特別報警信息。測定速度為80個標本/小時（配自動進樣器），全中文的操作界面，操作及提示功能一目了然，具有大型彩色TFT觸摸屏，操作簡潔便利。鞘流技術(shù)是全部高檔血細胞分析儀均接受的細胞進樣技術(shù)，為了達到

36、更高的液流速度壓力差和更穩(wěn)定的液體流淌，該公司獨創(chuàng)性地接受了二次加速鞘流技術(shù)，分級實現(xiàn)鞘液的其次次加速，增加了單位時間內(nèi)細胞的通過流量，從而能夠完成對預稀釋血液進行白細胞五分類分析。儀器通過兩個通道完成白細胞分類測定。在DIFF通道中增加了利用了可對嗜酸性粒細胞進行染色的特殊試劑。激光散射分析技術(shù)是五分類法常用的分析技術(shù)，由于細胞的物理特性，當激光照射到細胞時，會有不同角度的散射光消滅。低角度(1°5°)散射光可反映細胞體積大小信息；中高角度(10°20°)散射光可反映細胞顆粒的簡單性信息。綜合這兩個角度散射光的信息，結(jié)合其他特殊技術(shù)來完成白細胞的五分類

37、測定。標本在鞘流的帶動下進入儀器的檢測區(qū)域后，激光照射于細胞之上所放射出的低角度和中高角度散射光信號可表現(xiàn)出細胞大小和內(nèi)容物簡單程度（包括細胞內(nèi)顆粒等）的特性信息，經(jīng)儀器檢測分析，將其分布在一個二維空間的散點圖中，可區(qū)分淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。而化學染色技術(shù)可進一步實現(xiàn)對嗜酸性粒細胞的精確判定。在WBC/BASO通道中通過強溶型試劑和特異性染色技術(shù)，可保留完整的嗜堿性粒細胞，并對其進行特異性修飾，同時破壞其它四類白細胞，使之形成膜包核狀態(tài)，在激光的照射下同樣形成兩個角度的散射光，完整的嗜堿性粒細胞體積偏大，其他類別白細胞體積變小，通過激光信號的強弱來計數(shù)嗜堿性粒細胞并在該

38、通道中計數(shù)白細胞總數(shù)。該方法可以有效排解難溶性紅細胞、巨大血小板、血小板聚集及其它非細胞顆粒等因素對計數(shù)的影響，保證嗜堿性粒細胞及WBC總數(shù)的精確分類和計數(shù)。 圖15 邁瑞五分類血細胞分析儀散點圖特征 三 圖像分析法白細胞分類儀器 文章開頭部分已經(jīng)提到在1982年日本日立公司生產(chǎn)的8200型白細胞圖像分析系統(tǒng)，應當是此類儀器的原始機型。而作者在1984年也曾經(jīng)參與過中科院某爭辯所的一個關(guān)于血細胞形態(tài)特征數(shù)字化的爭辯工作，其目的是將5類白細胞基本信息在顯微鏡下掃描后形成數(shù)據(jù)模型，惋惜這項工作由于當時技術(shù)條件的限制而沒有取得預想的結(jié)果。近年來瑞典CellaVision

39、 AB公司開發(fā)出一種新型自動影像血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)CellaVision已經(jīng)投入臨床應用，該產(chǎn)品2005年3月在歐洲開頭投放市場,已經(jīng)有很多試驗室配備了該系統(tǒng)，用于進行血涂片的過篩檢查，該產(chǎn)品2007年進入中國市場，正處于推廣中。該系統(tǒng)目前有兩款機型，CellaVision DM96和CellaVision DM8。該系統(tǒng)是以染色后的血涂片為標本，以最接近傳統(tǒng)顯微鏡觀看法的技術(shù)對血液中的白細胞、紅細胞進行初步分類的儀器，該儀器接受先進的人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡系統(tǒng)和全自動的操作程序，可使血細胞形態(tài)學檢驗在自動化、標準化、智能化方面達到肯定的目的和水準，在強調(diào)形態(tài)學檢驗重要性的背景下有良好的進展前景。&

40、#160; 圖 16 檢驗醫(yī)師在Cellavision顯示屏前審查白細胞分類結(jié)果 該儀器的組成可分為五大部分 1 血片自動傳輸系統(tǒng) 將染色后的標準血涂片放在片盒內(nèi)。該系統(tǒng)不具染色功能，需先將血片用瑞氏或瑞氏-姬姆薩染液染色。血片可依據(jù)挨次被儀器傳輸系統(tǒng)傳送到顯微鏡載物臺上。2 血片自動傳輸系統(tǒng) 將血片從片盒內(nèi)取出并通過掃描條碼記錄標本編號，然后將標本送到自動顯微鏡的載物臺上。3 自動加油系統(tǒng) 自動吸取適量的顯微鏡油，滴加到血涂片適當?shù)奈恢?，用于油鏡頭下的細胞觀看和分類。其感應器能提示加油的狀態(tài)和加油的量。4 自動血涂片掃描系統(tǒng) 包括一臺具有物鏡頭自動轉(zhuǎn)換、血涂片可三維方向移動的自動顯微鏡和一臺具有自動調(diào)焦力量的數(shù)碼照相機。物鏡頭可依據(jù)要求自動轉(zhuǎn)換×10、×40、×100倍鏡頭；載物臺可水平上下左右移動，并可依據(jù)Z字型路線移動血片，供照相機攝取不同部位的細胞形態(tài)圖像。5 數(shù)據(jù)光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng) 數(shù)碼相機拍攝后的數(shù)字圖像信息，將光學信號轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號，然后對每個視野下的圖像進行分析，辨識單細胞層，白細胞定位點，從而為軟件系統(tǒng)