微米大黃炭治療胃潰瘍出血作用機制的實驗研究

1、微米大黃炭治療胃潰瘍出血作用機制的實驗研究                作者：時昭紅，張介眉，張書，馮云霞，侯光華【摘要】  【目的】探討微米大黃炭治療胃潰瘍出血的止血作用機制?！痉椒ā窟x用昆明種小鼠和SD大鼠為研究對象，隨機分為空白對照組、云南白藥組（劑量為9g·kg-1·d-1）和微米大黃炭高、中、低劑量組（劑量分別為8、4、2g·kg-1·d-1），灌胃給藥6d后檢測小鼠出、凝血時間及血小板計數(shù)；測

2、定大鼠血小板功能及纖溶活性等指標。【結(jié)果】與空白對照組比較，微米大黃炭各劑量組均能縮短小鼠出、凝血時間（1），增加血小板計數(shù)（5或1），提高大鼠血小板聚集性，上調(diào)血栓烷素B2（TXB2）而下調(diào)6酮前列腺素F1（6ketoPGF1）水平（或1），升高血小板顆粒膜蛋白140（GMP140）含量（5或1）；縮短大鼠凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）（1），而對組織型纖溶酶原激活劑（tPA）和組織型纖溶酶原抑制劑（PAI1）活性無顯著影響（）?！窘Y(jié)論】通過激活內(nèi)源性和外源性途徑的多種凝血因子而促進凝血過程中的凝血酶原和凝血活酶的生成，增加血小板計數(shù)和聚集性可能是微米大黃炭止血的重要

3、作用機制。 【關(guān)鍵詞】  微米大黃炭/藥理學(xué)；胃腸出血/中藥療法；疾病模型，動物；大鼠；小鼠微米大黃炭為武漢市第一醫(yī)院治療消化性潰瘍并出血的新型中藥制劑，臨床運用療效確切1。本研究觀察了該制劑對實驗動物凝血時間、血液凝固系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)及血小板的影響，闡明其治療胃潰瘍出血的止血作用機制，現(xiàn)報道如下。    1材料與方法   11藥物微米大黃炭由武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑科制備（批號：200506）；云南白藥由云南白藥集團股份有限公司生產(chǎn)（批號：20051113）。   12動物清潔級昆明種小鼠180只，體質(zhì)量（20&#

4、177;2）g，雌雄各半，由同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物室提供，合格證號：SCXK（鄂）20040007；清潔級SD大鼠100只，體質(zhì)量200250g，雌雄各半，由同濟醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號：SCXK（鄂）20040007。   13試劑與儀器大鼠組織型纖溶酶原激活劑及其抑制劑（tPA/PAI1）試劑盒及血小板顆粒膜蛋白140（GMP140）試劑盒均由大連泛邦化工有限公司提供；125I6酮前列腺素F1（6ketoPGF1）放射免疫分析藥盒、125I血栓烷素B2（TXB2）放射免疫分析藥盒均購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：20060725）；LBYNJ2型血液凝聚儀

5、（北京普利生公司產(chǎn)品）；MK3型Thermo酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；DFM96型多管放射免疫計數(shù)器（合肥眾成機電技術(shù)公司）。   14指標檢測   141凝血時間和出血時間的測定取昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機分為微米大黃炭低、中、高劑量組（簡稱大黃炭低、中、高劑量組），云南白藥組和空白對照組5組，每組12只，大黃炭低、中、高劑量組分別以2、4、8g·kg-1·d-1劑量灌胃給藥，云南白藥組給予云南白藥，劑量為9g·kg-1·d-1，空白對照組給予等容積生理鹽水。連續(xù)給藥6d，1次/d。于末次給藥1h后，

6、按毛細血管法2測定凝血時間，以斷尾法3記錄小鼠出血時間。   142血小板計數(shù)的測定取昆明種小鼠60只，分組方法及給藥方法同141，每組12只，于末次給藥1h后摘取右側(cè)眼球取血05mL，在全自動血小板計數(shù)儀上檢測。   143血小板凝集性測定取SD大鼠50只，雌雄各半，分組方法及給藥方法同141，每組10只。于末次給藥05h后，30mg/L戊巴比妥鈉10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心臟穿刺取血18mL，按說明書要求分離富含血小板血漿（PRP）和血小板血漿（PPP），分別置于比色杯中，調(diào)整好透光度后，將誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷（ADP）2mol(1mol/m

7、L)加入PRP中，記錄濁度改變曲線及最大聚集率（pMA/%）。   144TXB2、6ketoPGF1及血小板GMP140含量測定取清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，分組及給藥方法同141，每組10只。末次給藥后05h后，按002mL/kg劑量腹腔內(nèi)注射20mg/L戊巴比妥鈉麻醉，心臟穿刺取血2mL，用消炎痛乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）抗凝備檢，以3 000r/min離心10min，分離血漿，嚴格按試劑盒說明書步驟操作，采用放射免疫法測定TXB2和6ketoPGF1含量，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）雙抗體夾心法測定GMP140含量。   145組織

8、型纖溶酶原激活劑（tPA）及其抑制劑（PAI1）水平測定取清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，分組及給藥方法同141，每組10只。末次給藥后1h，以30mg/L戊巴比妥鈉10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心臟穿刺取血2mL，用EDTANa2抗凝備檢，3 500r/min離心15min，分離血漿，采用ELISA法檢測tPA、PAI1水平。   146凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血活酶時間（APTT）測定取清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，分組及給藥方法同141，每組10只。末次給藥后1h,以30mg/L戊巴比妥鈉10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心臟穿刺取血18mL，3

9、8mg/L枸椽酸鈉（與血液容積比為19）抗凝，以3 000r/min離心10min分離血漿后，在全自動血凝分析儀上檢測PT和APTT值。   15統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 130統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。            2結(jié)果   21各組對小鼠出、凝血時間及血小板計數(shù)的影響表1結(jié)果顯示，大黃炭高、中、低劑量組和云南白藥組均能縮短小鼠出、凝血時間，與空白對照組比較有顯著性差異（P001）；與云南白藥組比較，大黃炭高劑量組作用顯著（P005）。各給藥組均能

10、顯著提高小鼠血小板計數(shù)（P005），其中大黃炭高、中劑量組作用顯著（P001）；與云南白藥組比較，大黃炭高劑量組可顯著提高小鼠血小板計數(shù)（P005）。   22各組對大鼠血小板聚集性及TXB2、6ketoPGF1、GMP140含量的影響表2結(jié)果顯示，各給藥組均能顯著提高血小板最大聚集率及TXB2、GMP140含量（P005或P001），顯著降低6ketoPGF1含量（P005或P001），大黃炭低、中、高劑量作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，且大黃炭高劑量組除GMP140含量外，作用均優(yōu)于云南白藥組（P005）。   23各組對大鼠PT、APTT和tPA、PI

11、A1活性的影響表3結(jié)果顯示，各給藥組均可顯著縮短大鼠PT、APTT（P001）,且大黃炭中、高劑量組縮短PT的作用優(yōu)于云南白藥組（P005），但大黃炭各劑量組對tPA及PAI1活性無顯著影響（P005）。   表1各組對小鼠出、凝血時間及血小板計數(shù)的影響表2各組對大鼠血小板凝集性及TXB2、6ketoPGF1、GMP140含量的影響   3討論大黃止血最早文獻記載于漢代張仲景傷寒論，臨床運用于各種血證，故有“血證要藥”之稱。血證論中亦云：“大黃一味，既是氣藥，又是血藥，止血而不留瘀，尤為妙藥?！贝簏S有效止血成分單體d兒茶素和沒食子酸為闡述大黃止血功能提供

12、了物質(zhì)依據(jù)4。根據(jù)中藥“燒炭存性”的原理5，我們在采用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)與傳統(tǒng)炮制技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上研制新型中藥制劑，該藥物采用超微粉碎儀將大黃炭粉碎過200目篩制成微米中藥，使其在保持原有藥性的基礎(chǔ)上又最大限度地提高藥物的吸收和生物利用度，同時縮短了藥物的起效時間。凝血時間可反映內(nèi)源性凝血途徑凝血因子的活性，活化部分凝血活酶時間的測定亦是用于檢測對內(nèi)源性凝血途徑的影響，涉及因子、等多種凝血因子的功能，而凝血酶原時間測定主要用于檢測外源性途徑的有關(guān)因子，因而可反映藥物對外源性凝血途徑的作用6。本文結(jié)果表明，微米大黃炭組的凝血時間、活化部分凝血活酶時間以及凝血酶原時間均顯著縮短，說明其對內(nèi)源性和外

13、源性凝血途徑的多種凝血因子具有可靠的激活作用而實現(xiàn)內(nèi)促凝血。正常止血與凝血機制包括血管壁、血小板和凝血因子等多方面的作用，而血小板的黏附、聚集作用在止血初期具有重要意義7。TXA2是目前已發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管物質(zhì)與血小板聚集劑之一8。PGI2則是較強的血小板功能的抑制劑，具有抑制血小板的黏附、聚集和釋放反應(yīng)，抑制血小板的促凝活性等作用9。PGI2和TXA2之間的動態(tài)平衡是維持正常止血功能的基礎(chǔ)，血小板與血管壁接觸時被激活，合成和釋放TXA2并促進血小板聚集，而血管壁利用自身或外源性的花生四烯酸合成PGI2。由于TXA2和PGI2的半衰期很短，一般將TXA2和PGI2穩(wěn)定的代射產(chǎn)物TXB2和6ke

14、toPGF1作為判斷其濃度的指標10。而血漿GMP140是目前所知較能反映血小板活化和釋放反應(yīng)的特異性標記物11。本研究結(jié)果表明，微米大黃炭能顯著提高大鼠血小板聚集性，且高劑量組作用最為顯著，效果優(yōu)于云南白藥。通過TXB2和6ketoPGF1含量的檢測證實，微米大黃炭高劑量組能顯著提高大鼠TXB2的含量同時下調(diào)6ketoPGF1的含量，且調(diào)節(jié)作用優(yōu)于云南白藥，說明微米大黃炭活化血小板的作用優(yōu)于云南白藥。而在對GMP140的檢測中亦證實了這一點。在纖溶系統(tǒng)中，產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細胞的組織型纖溶酶原激活劑（tPA）及其抑制劑（PAI1）發(fā)揮重要作用12。tPA能選擇性地激活纖溶酶原形成纖溶酶，繼而催化

15、纖維蛋白水解。PAI1是tPA活性主要的生理性抑制劑，PAI1能快速與tPA結(jié)合，形成11復(fù)合物而使tPA失活。tPA與PAI1在纖溶系統(tǒng)激活過程中起著相互拮抗的作用13。在對tPA及PAI1活性的檢測中發(fā)現(xiàn)，微米大黃炭對大鼠tPA及PAI1活性無顯著影響，提示微米大黃炭的止血作用與纖溶活性無關(guān)。因此我們初步認為，通過激活內(nèi)源性和外源性途徑的多種凝血因子而促進凝血過程中的凝血酶原和凝血活酶的生成，同時增加血小板計數(shù)和聚集性可能是微米大黃炭止血作用的重要作用機制?！緟⒖嘉墨I】  1時昭紅，張書，胡偉，等.微米大黃炭胃鏡下噴灑治療消化性潰瘍出血的臨床觀察J.內(nèi)科急危重癥雜志,2007,1

16、3(3):134.2Koo Y J,Taylor N H,Hely D Y,et al.Endometrial cell proliferation in the women following endometrial ablationJ.Hum Reprod,1996,11(5):1067.3Abberton K M,Tayior N H,Healy D L,et al.Vascular smooth muscle cell proliferation in arterioles of the human endometriumJ.Hum Reprod,1999,14(4):1072.4陳燕,趙輝,謝銳.大黃的藥理及臨床研究近況J.西南國防醫(yī)藥,2005,2(15),180.5葉定江,張世臣.中藥炮制學(xué)M.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1995:98.6王鴻利.血栓與止血檢驗技術(shù)M.上海:上?？萍汲霭嫔?1991:98.7王振義.止血與血栓基礎(chǔ)理論與臨床M.第2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1996:104.8龐愛明,阮長耿.綠茶的主要成分沒食子兒茶素、沒食子酸酯(EGCG)對血小板功能影響的研究J.中國血液流變學(xué)雜志,2004,14(1):37.9劉耀武,馬騰飛,蔣新穎,等.鹽酸戊乙奎醚對高黏血癥大鼠微循環(huán)和血液流變性的影響J.中國微