2013用于鼻咽癌高效靶向診療的多肽脂質(zhì)納米探針研制

1、A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of theRequirements for the Degree of Doctor of Philosophy in SciencePeptide-lipid nanoprobes for the theranostics ofnasopharyngeal carcinomaPh.D.CandidateMajor Supervisor: Haiming Luo: Biomedical engineering: Prof. Zhihong ZhangHuazhong University of S

2、cience and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaMay, 2013獨(dú)創(chuàng)性本人所呈交的是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明的內(nèi)容外，本不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全本的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：日期：年月日使用書(shū)本作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用的規(guī)定，即：學(xué)校保留并向有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交的復(fù)印件和，被查閱和借閱。本人華技大學(xué)可以將本的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等保存和匯編本。

3、，在年不。（請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“”）后適用本書(shū)。作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日華技大學(xué)博士要*摘鼻咽癌是中國(guó)南方和東南亞等地域廣泛流行的高度，具有發(fā)病部位隱蔽和易于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要之一。目前化療，但是有 30%以上的患者由對(duì)于局部晚期鼻咽癌主要使用以順鉑為基礎(chǔ)的于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，其 5 年總生存率僅為 25%-30%?？?EGFR 單克隆抗體 Cetuximab但尚存在著人化療可以一定程度提高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者的總生存率，抗體（HAMA）反應(yīng)導(dǎo)致的顯著毒副作用問(wèn)題。與小化療藥物相比，基于納米載體的靶向具有延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)周期、提高

4、的利用率、增加的細(xì)胞內(nèi)攝取能力等優(yōu)點(diǎn)，并在一定程度上降低了的毒副作用。因此，研制高效的鼻咽癌靶向納米，對(duì)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究取得如下創(chuàng)新結(jié)果：（1）發(fā)明了一種八價(jià)多肽納米熒光探針，可用于靶向多肽的在體評(píng)價(jià)，由此鑒定了一條鼻咽癌高特異性的靶向多肽（TTP）。具體方法是，將靶向多肽序列偶聯(lián)到四聚體遠(yuǎn)紅色熒光蛋白（tfRFP）序列的碳、氮兩端，通過(guò) tfRFP 成熟后的四聚化效應(yīng)自組裝形成一種八價(jià)多肽納米熒光探針 Octa-FNP。在體熒光成像證實(shí)， 它對(duì)鼻咽癌 5-8F 皮下腫瘤具有高特異性的靶向能力、增強(qiáng)的富集能力和高對(duì)比度的腫瘤顯像能力，因此利用 Octa-FNP

5、可以快速靈敏地評(píng)價(jià)多肽的靶向能力。本文利用此方法鑒定出一條鼻咽癌高特異性的靶向多肽LTVSPWY（TTP），并通過(guò)對(duì) 125I 標(biāo)記的Octa-FNP 進(jìn)行放射成像，同樣發(fā)現(xiàn)其能夠高效蓄積于腫瘤組織內(nèi)；（2）發(fā)明了一種新型的同時(shí)具有鼻咽癌協(xié)同靶向增強(qiáng)能力和能力的多肽R4F-TTP。具體方法是將鑒定的TTP 多肽與兩親性 螺旋多肽R4F 親水端進(jìn)行偶聯(lián)。熒光顯微成像和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的 R4F-TTP 被 5-8F 細(xì)胞攝取的量是FITC 標(biāo)記的TTP 的3.1 倍，是FITC 標(biāo)記的R4F 的10.4 倍。此結(jié)果表明R4F-TTP多肽對(duì) 5-8F 細(xì)胞確實(shí)具有協(xié)同增強(qiáng)的靶

6、向能力。碘化丙啶（PI）染色結(jié)果證實(shí)，R4F-*基金資助：科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB910401）、自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81172153）和科技支撐計(jì)劃（2012BAI23B02）I華技大學(xué)博士TTP 對(duì) 5-8F 細(xì)胞還具有選擇性能力。（3）研制了一種對(duì)鼻咽癌 5-8F 腫瘤具有高選擇性靶向能力和良好治療效果的超小粒徑納米顆粒。透射電鏡和納米粒度儀結(jié)果顯示，NP-TTP 是一種直徑約為11 nm 的球形納米顆粒。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，NP-TTP 被 5-8F 細(xì)胞攝取的量是納米顆粒 NP（不含多肽 TTP）的 20.5 倍，是 NP-scrTTP（scrTTP 為 TTP 的隨機(jī)序列多肽

7、）的 3.0 倍。NP-TTP 表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的鼻咽癌細(xì)胞特異性攝取能力，提示多肽TTP 被呈現(xiàn)在納米顆粒的表面。整體熒光成像結(jié)果證實(shí)，近紅外熒光DiR-BOA標(biāo)記的 NP-TTP 能夠高效蓄積于鼻咽癌 5-8F 腫瘤內(nèi)，并有效地?cái)U(kuò)散到整個(gè)腫瘤組織中，DiR-BOA 的熒光信號(hào)在腫瘤組織與肝、腎等正常臟器之間具有極高的對(duì)比度。通過(guò)尾靜脈連續(xù)兩次隔天給藥，NP-TTP 對(duì) 5-8F 腫瘤的生長(zhǎng)抑制率為 88±7%，對(duì)5-8F-mRFP 轉(zhuǎn)移性腫瘤也具有明顯的抑制效果。NP-TTP 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的這種抑制作用，被證明與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬體形成密切相關(guān)。當(dāng) NP-TTP 同步裝載后，表現(xiàn)出

8、更強(qiáng)的抑制鼻咽癌 5-8F-mRFP 腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，明顯延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)小鼠的生存期。綜上所述，本文基于四聚體熒光蛋白發(fā)明了一種八價(jià)多肽納米熒光探針，鑒定了一條鼻咽癌高特異性的靶向多肽TTP。將 TTP 與兩親性 螺旋多肽R4F 偶聯(lián)所形成的雜交多肽 R4F-TTP，不僅具有協(xié)同增強(qiáng)鼻咽癌靶向攝取和選擇性的能力，還能脂質(zhì)納米顆粒形成及其功能。利用 R4F-TTP 形成的脂質(zhì)納米顆粒，具有鼻咽癌高對(duì)比度靶向成像的能力和極低毒副作用的靶向治療效果。本研究為靶向和治療性多肽的在體評(píng)價(jià)、腫瘤的靶向成像和診斷以及多策略治療提供了新方法。：鼻咽癌，靶向多肽，熒光納米探針，治療性多肽，靶向治療，納米載體，協(xié)同靶

9、向，II華技大學(xué)博士AbstractNasopharyngeal carcinoma (NPC) is an epidemic malignant cancer in Southern China and Southeast Asia with hidden location and early distant metastasis, which results to its treatment failure as one of the main reasons. Cisplatin-based combination chemotherapy remains the main treatm

10、ent for locoregional advanced NPC, but over 30% of patients fail with local recurrent or distant metastases in the treatment and their 5-year survival rate is just 25%-30%. Anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody cetuximab combined with chemotherapy improves the overall surv

11、ival of metastatic NPC patients to some extent but still with side effects induced by human anti-mouse antibody (HAMA) response. Compared with small-molecule chemothera- peutic agents, nanocarrier-based drugs can extend the half-time of drugs in the blood, improve drugs utilization and increase intr

12、acellular concentration of drugs but with low side effects. Thus, it is valuable in clinical applications for developing nanodrugs targeted NPC with high efficiency to treat metastatic NPC. The innovation results in this thesis can be summarized as follows.1) We develop an octavalent peptide fluores

13、cent nanoprobe (Octa-FNP) which can be used to evaluate peptides in vivo and utilize it to identify a NPC-targeting peptide TTP. This was accomplished by combining a tetrameric far-red fluorescent protein (tfRFP) as a scaffold with a tumor-targeting peptide to engineer an Octa-FNP. Whole-body imagin

14、g in vivo demonstrated Octa-FNP could specifically target 5-8F subcutaneous tumor with enhanced tumor accumulation and high-contrast tumor imaging which was valuable for assessing the targeting capability of peptides. We used the methods to identify a NPC-targeting peptide LTVSPWY (TTP), which could

15、 high efficiently accumulate in the tumor tissue when radioimaging with 125I-labeled Octa-FNP.2) We creat a novel NPC-targeting peptide R4F-TTP with synergistic enhancement and selective killing. It was designed by conjugating a tandem NPC-targeted peptide (LTVSPWY) with an amphipathic -helical pept

16、ide R4F. Confocal imaging and FACS analysis demonstrated the uptake of R4F-TTP by 5-8F cells after incubated 24 h is3.1-fold of TTP, 10.4-fold of R4F, indicating R4F-TTP exhibit a synergistic effect onIII華技大學(xué)博士enhancing the targeting to 5-8F cells. Propidium iodide (PI) staining further demonstrated

17、 the selective killing tumor cells of R4F-TTP.3) We develop a ultra-small nanocarrier for 5-8F tumors with high-specific targeting and significant therapeutic effects. Both transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) revealed NP-TTP with an average size of 11 nm and sph

18、erical structure. FACS analysis demonstrated the uptake of NP-TTP by 5-8F cells after incubated 3 h is 20.5-fold of TTP, 3.0-fold of R4F-scrTTP (scrTTP is the scramble peptide of TTP). The enhanced specific uptake of NP-TTP by 5-8F cells suggested that targeting peptide TTP was presented on the surf

19、ace of the NP-TTP. Whole-body imaging demonstrated NP-TTP loaded with near infrared fluorescent dyes DiR-BOA could be efficiently accumulated in the 5-8F-mRFP tumor and diffused into entire tumor tissue, which resulted in extremely high contrast between the tumor tissue and normal tissues, such as l

20、iver and kidney. When administered twice every other day by post-injection, NP-TTP achieved 88±7 % inhibition rate in subcutaneous growth of 5-8F tumors and significant higher survival rate when compared with PBS. The inhibition of tumor growth was demonstrated to be related with the induction

21、of apoptosis and autophagy formation by NP-TTP. When synchronized with curcumin, NP-TTP showed a strong preventive effect on 5-8F metastasis.In sumarry, we invented an octavalent peptide fluorescent nanoprobe based on tetrameric far-red fluorescent protein and used it to identify a target-specific p

22、eptide TTP for NPC. Conjugating the TTP peptide with an amphipathic -helical peptide R4F created a novel NPC-targeting peptide R4F-TTP, which not only synergistically enhance the target-specific cellular upatke by 5-8F cells and their selective killing, but only can control the formation of lipid na

23、noparticles and their function. The novel lipid nanoparticle could achieve high-contrast imaging in vivo and therapeutic effects for 5-8F tumors. This study provides new methods for the evaluation in vivo of therapeutic and targeted peptides,tumor-targeted imaging for diagnosis and multi-targeted th

24、erapies for cancer treatment.Keywords: Nasopharyngeal carcinoma, targeting peptide,fluorescentnanoprobes,therapeutic peptide, molecular targeted therapy, nanocarrier, synergistic targeting, curcuminIV華技大學(xué)博士目錄摘要IAbstractIII11.11.21.31.41.522.12.22.32.42.533.13.23.33.43.544.1緒論鼻咽癌的診療現(xiàn)狀(1)鼻咽癌的靶向治療(4)的腫

25、瘤治療(12)基于納米基于仿 HDL 納米顆粒(17)選題背景及本文的主要研究?jī)?nèi)容(20)腫瘤靶向多肽的評(píng)價(jià)與鑒定新方法引言(23)材料與方法(25)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(35)討論(44)本章小結(jié)(45)基于八價(jià)多肽納米熒光探針的鼻咽癌放射成像引言(46)材料與方法(46)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(49)討論(55)本章小結(jié)(56)鼻咽癌靶向診療多肽及其脂質(zhì)納米顆粒的研制引言(58)V華技大學(xué)博士4.24.34.44.555.15.25.35.45.566.16.26.3致材料與方法(58)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(64)討論(79)本章小結(jié)(81)鼻咽癌靶向納米的腫瘤治療作用研究引言(82)材料與方法(82)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(85)討論(9

26、0)本章小結(jié)(91)結(jié)論與展望研究結(jié)果(92)主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)(93)展望(93)謝(95)參考文獻(xiàn)(97)附錄 1附錄 2攻讀學(xué)位期間、專利及獲獎(jiǎng)目錄(111). (113)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)技術(shù)VI華技大學(xué)博士1緒論1.1鼻咽癌的診療現(xiàn)狀，具有地域和種族性分布特點(diǎn)1。在中鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽上皮的高度，每十萬(wàn)人中就有 20 至國(guó)南方、東南亞、非洲北部和阿拉斯加等地域具有高50 例鼻咽癌患者2。鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽、灶小，且與眼、耳、鼻、咽喉、顱底骨和腦神經(jīng)等重要相鄰，導(dǎo)致它很難進(jìn)行手術(shù)治療。而且它還易于較早地上行向顱底顱內(nèi)侵襲，下行向頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至骨、肝、肺等組織，其早期癥狀復(fù)雜，局部癥狀不

27、明顯，因此很容易造成誤診和漏診。據(jù)Vokes 等新確診的鼻咽癌中 75%-90%已為鼻咽癌局部晚期，且通常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移3。目前對(duì)于早期局部鼻咽癌率達(dá)到 64%-95%，而對(duì)于局部晚期鼻咽癌的率只有 44%-68%，因此需要對(duì)鼻咽癌進(jìn)行早期診斷4。目前，對(duì)鼻咽癌最直接的早期診斷方法是使用鼻咽鏡進(jìn)行檢查。它不僅易于對(duì)鼻咽部病變部位或腫瘤直接觀察，還方便對(duì)鼻咽部腫塊進(jìn)行活檢來(lái)進(jìn)一步確診。但是鼻咽鏡不能對(duì)鼻咽部粘膜下或咽隱窩進(jìn)行觀察，具有 5%的漏診率5, 6。為了確診鼻咽部有無(wú)鼻咽癌的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，常用的影像學(xué)檢查主要是 CT 和 MR7。CT 可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)鼻咽部腫瘤的范圍，清晰

28、顯示難以被鼻咽鏡檢查發(fā)現(xiàn)的粘膜下浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤，但是對(duì)鼻咽腔內(nèi)微小的腫瘤卻很難發(fā)現(xiàn)8。磁共振成像（MRI）對(duì)軟組織具有極好的成像對(duì)比度，能清楚地顯示鼻咽腔和咽旁間隙的病灶及其病理解剖狀態(tài)，對(duì)早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的診斷優(yōu)勢(shì)5, 9。由于它在鼻咽癌的診斷、準(zhǔn)確分期、放療設(shè)野及治療后隨診中的顯著優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為鼻咽癌的首選影像學(xué)檢查。對(duì)于淋巴結(jié)分期晚期和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者， 全身正電子發(fā)射斷層顯像（PET-CT）可以提供更加客觀和準(zhǔn)備的診斷10, 11。鼻咽癌對(duì)放療和化療都具高度敏感性，放療是早期鼻咽癌的首選治療方案。但是對(duì)晚期鼻咽癌，常采用 放療和化療的治療方案12，因?yàn)榉暖焹H適用于腫瘤原發(fā)

29、灶及其前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌治療，而不適合遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的治療?，F(xiàn)在臨1華技大學(xué)博士常采用的是一種調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）的治療方法，它通過(guò)調(diào)節(jié)輻射光束，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織高劑量輻射的同時(shí)減少對(duì)正常組織的輻射劑量，從而減少放療的毒副作用。這種放療方法對(duì)局部鼻咽癌率可以達(dá)到 90%以上。有數(shù)據(jù)顯示同步進(jìn)行 IMRT和化療，可以進(jìn)一步降低治療的毒副作用并提高 5 年總生存率13，但仍有 30%-40%局部晚期鼻咽癌患者由于復(fù)發(fā)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗14。對(duì)于復(fù)發(fā)性鼻咽癌目前主要使用再次放療外加局部手術(shù)的治療方法，但放療顯著的毒副作用與鼻咽特殊的部位易導(dǎo)致患者出現(xiàn)治療相關(guān)的并發(fā)癥和潛在的功能性，其 5 年

30、總生存率只有 44%6, 9。盡管有研究者使用鼻咽鏡切除術(shù)治療復(fù)發(fā)性鼻咽癌，其 2 年總的生存率達(dá)到 80%以上15，但由于鼻咽癌惡性程度高，很難將病變部位完全切除而不復(fù)發(fā)16（如圖 1.1 所示）。對(duì)于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌主要使用以順鉑為基礎(chǔ)的化療，最常用的是順鉑和 5-氟尿嘧啶，但是總的五年生存率只有 25%-30%17。因此需要發(fā)展有效的鼻咽癌靶向治療是十分必要的。圖 1. 1 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和復(fù)發(fā)。腫瘤區(qū)域與復(fù)發(fā)類型之間的關(guān)系。在最近的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上區(qū)域是由一個(gè)或多個(gè)粘膜區(qū)域具有癌相關(guān)或表型改變的上皮細(xì)胞組成。淡區(qū)域?yàn)閱慰寺〖?xì)胞，沒(méi)有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的行為，這是浸潤(rùn)性癌的標(biāo)志。前病

31、變區(qū)域可能有不典型增生組織畸變特性，但不是必須的。臨床暗示它可能是局部復(fù)發(fā)，也可能是第二 腫瘤手術(shù)切除后的初始癌16。Fig. 1. 1 Field cancerization and local relapse. The relationship between field cancerization and types of relapse is shown. On the basis of recent molecular findings, field cancerization is defined as the presence of one or more mucosal are

32、as consisting of epithelial cells that have cancer-associated genetic or epigenetic alterations. A precursor field (or field; shown in light blue) is monoclonal in origin and does not show invasive growth or metastatic behaviour, which are the hallmarks of an invasive carcinoma. A field is preneopla

33、stic by definition; it may have histological aberrations characteristic of2華技大學(xué)博士dysplasia, but not necessarily. An important clinical implication of a field is that it may be the source of local recurrences and second primary tumours after surgical resection of the initial carcinoma16.鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清

34、楚，但普遍認(rèn)為是由于遺傳因素、和環(huán)境誘導(dǎo)交互作用造成的。其中遺傳因素主要指鼻咽癌的性和易感性。中山大學(xué)腫瘤防治中心團(tuán)隊(duì)于今年發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)新的散發(fā)性鼻咽癌易感，并證實(shí)人類白細(xì)胞抗原（HLA）與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，對(duì)實(shí)現(xiàn)高危人群的準(zhǔn)確極具意義18。Epstein-Barr（EBV）是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)病的另一個(gè)致病因素19。鼻咽癌與 EBV 之間的關(guān)系最初通過(guò)血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，后來(lái)通過(guò)在鼻咽癌腫DNA 及其細(xì)胞核抗原蛋白得到進(jìn)一步證實(shí)20。由于鼻咽癌瘤細(xì)胞中檢測(cè)到EB患者血清中EBV 抗體水平與健康者存在顯著差異，因此 EBV 抗體及其DNA 已用于鼻咽癌的早期篩選和輔助診斷21。EBV后的鼻咽癌細(xì)胞

35、，其、和表型都發(fā)生了改變（如圖 1.2 所示），如膜表面受體 EGFR、VEGFR，c-MET、Her-2 等表達(dá)顯著增加3。圖 1. 2 EBV 的導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞的改變。AKT - 蛋白激酶 B，AP-1 - 激活蛋白 1，c-MET- 間質(zhì)上皮過(guò)渡因子，cyclin-D1 - 細(xì)胞周期蛋白D1，EBV - Epstein-Barr，EGFR - 表皮生長(zhǎng)因子受體，ETS1 - ETS1蛋白，HIF-1 - 缺氧誘導(dǎo)因子 1，LMP - 潛伏膜蛋白，NF - 激活的 B 細(xì)胞輕鏈增強(qiáng)核因，PI3K - 磷脂酰肌醇三激酶，STAT3 - 轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3。VEGF -3華

36、技大學(xué)博士Fig. 1. 2 Molecular aberrations in NPC arising from EBV infection. AKT protein kinase B, AP-1 activator protein 1, c-MET mesenchymal epithelial transition factor, cyclin-D1 cyclin protein D1,EBV Epstein-Barr, EGFR epidermal growth factor receptor, ETS1 ETS1 family protein,HIF-1 hypoxia inducibl

37、e factor 1 alpha, LMP latent membrane protein, NF nuclear factorkappa light chain enhancer of activated B cells, PI3K phosphoinositide 3-kinase, STAT 3 signal transducer and activator of transcription 3 and VEGF vascular endothelial growth factor3.隨著現(xiàn)在診療技術(shù)的進(jìn)步，同步放療與化療對(duì)局部鼻咽癌的率可以達(dá)到94.9%，但鑒于目前治療的局限性，鼻咽癌

38、總的五年生存率仍然只有 50%-70%17,22。而且由于傳統(tǒng)的放療和化療缺乏腫瘤特異性，在取得療效的同時(shí)也給患者帶來(lái)很大13的毒副作用23。因此，需要探索更為有效的治療降低轉(zhuǎn)移率，從而進(jìn)一步提高患者總的 5 年生存率。以提高鼻咽癌局控率、1.2鼻咽癌的靶向治療隨著生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展和對(duì)發(fā)病機(jī)制研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤是一種多因素參與、多步驟發(fā)展的全身性和系統(tǒng)性疾病，它主要是通過(guò)癌突變、抑癌或表達(dá)調(diào)控失常而導(dǎo)致的。因此，選擇與腫瘤相關(guān)的特異性作為靶點(diǎn)，利用靶標(biāo)特異性抑制劑或?qū)δ[瘤進(jìn)行選擇性，從而避免對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷，這種腫瘤靶向治療的方法因其具有療效高、副作用低的特點(diǎn)而成為近年

39、來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前上市的腫瘤靶向主要有單克隆抗體和小化合物。1.2.1 EGFR 為靶點(diǎn)的靶向治療由于 80%的鼻咽癌高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），并且 EGFR 表達(dá)量的高低與鼻咽癌分期和臨床不良預(yù)后是密切相關(guān)的24，因此EGFR 已成為鼻咽癌治療的一個(gè)重要的靶點(diǎn)。目前抗EGFR 單克隆抗體西妥昔單抗（Cetuximab）和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶（EGFR-TKI）都已應(yīng)用于晚期鼻咽癌的治療25, 26。1.2.1.1 抗體偶聯(lián)的單克隆抗體靶向治療在腫瘤治療方面已經(jīng)展示了良好的臨床應(yīng)用前景。它可以直接靶向腫瘤表面抗原抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可以與放射性核素、或毒素形成偶聯(lián)物，27（如圖

40、通過(guò)抗體靶向到腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特異性1.3 所示）。西妥昔單抗（Cetuximab）是一種人鼠嵌合性IgG 單克隆抗體，于 2006 年被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于4華技大學(xué)博士局部進(jìn)展期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的治療。它通過(guò)與EGFR 胞外端高效、特異性地結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制 EGFR 受體與其配體的結(jié)合，阻斷受體相關(guān)酶的磷酸化， 進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到抗癌目的28。使用 Cetuximab 單抗與卡鉑 治療先期單獨(dú)使用鉑類化療失敗的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者，其疾病響應(yīng)率達(dá)到 12%，臨床 率達(dá)到 60%，但具有很強(qiáng)的毒副作用29。一項(xiàng)臨床隨機(jī)研究發(fā)現(xiàn)，CetuximabIMRT 相比較單獨(dú)的

41、放療組顯著延長(zhǎng)疾病進(jìn)程并提高總的生存率30。因此單抗西妥昔單抗可以增強(qiáng)傳統(tǒng)化療和放療的效果，顯著延長(zhǎng)總生存率和疾病無(wú)進(jìn)展生存期。圖 1. 3 治療性抗體的概念。（a）靶向腫瘤單克隆抗體可通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性直接殺死腫瘤細(xì)胞；（b）通過(guò)雙特異性單鏈抗體或抗體的配體融合蛋白靶向細(xì)胞因子或免疫調(diào)節(jié)來(lái)免疫抑制腫瘤細(xì)胞。而且，抗體的配體融合蛋白可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞及旁觀者細(xì)胞凋亡；（c）通過(guò)將細(xì)胞毒性，毒素或放射性核苷酸與單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)來(lái)殺死靶腫瘤細(xì)胞；（d）通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞的酶和到治療腫瘤的目的27。Fig. 1. 3 Concepts of therapeutic anti

42、bodies. (a) Targeting monoclonal antibodies to the tumour can result in the destruction of the tumour cells by antibody-dependent cellular cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity. (b) Similarly, targeting cytokines or immunomodulatory molecules either by bispecific scFv or antibodyligand f

43、usion proteins to the tumour modulates the immune response against the tumour. In addition, antibodyligand fusion proteins can induce apoptosis to targeted cells as well as bystander cells. (c) A more direct approach to kill the targeted cell is the conjugation of cytotoxic drugs, toxins or radionuc

44、leotides to the monoclonal antibodies. (d) The antibody-directed enzyme prodrug therapy approach specifically aims at causing bystander effects by targeting enzymes to the tumour cell and delivering a prodrug that is converted to a chemotherapeutic by the targeted enzyme27.可轉(zhuǎn)化為化療的前藥引起的旁觀者效應(yīng)來(lái)達(dá)5華技大學(xué)博士

45、1.2.1.2 小EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼（gefitinib）是一種的苯胺喹唑啉化合物，可通過(guò)與 EGFR 胞內(nèi)的酪氨酸激酶催化區(qū)域結(jié)合，選擇且可逆性地抑制 EGFR 酪氨酸激酶的活性，從而阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它于 2003 年被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于治療化療失敗的晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），不少研究者認(rèn)為它對(duì)鼻咽癌也具有很好的療效。但 Hui 等研究者，gefitinib 對(duì) 379 個(gè)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者的治療中，3 年總的生存率只有 37%。在一項(xiàng)鼻咽癌期臨床研究中，gefitinib 治療沒(méi)有轉(zhuǎn)移性的 19 個(gè)局部鼻咽癌患者，只有 2 例腫瘤有微小的收縮31。盡管復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤

46、的鼻咽癌患者對(duì) gefitinib 具有很好的耐受性，但治療率卻很低?？紤]到局部鼻咽癌患者的這種治療結(jié)果，gefitinib 對(duì)鼻咽癌的治療效果是值得懷疑的。因此，EGFR 靶點(diǎn)進(jìn)行的鼻咽癌靶向治療，EGFR-TKI 對(duì)于晚期鼻咽癌的治療其療效甚微，不推薦用于鼻咽癌的臨床治療。Cetuximab鼻咽癌患者有一定的臨床效果，但副作用嚴(yán)重。Cetuximab卡鉑對(duì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性IMRT 或放化療可以顯著延長(zhǎng)疾病進(jìn)展時(shí)間和提高總的生存率，它可能成為局部晚期鼻咽癌治療的新選擇。1.2.2 VEGFR 為靶點(diǎn)的靶向治療內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）被證明在 40%-70%的鼻咽癌中高表達(dá)，并且與高的轉(zhuǎn)移性

47、復(fù)發(fā)率和低的總生存率密切相關(guān)32, 33。它的過(guò)表達(dá)是由于 EB 病毒潛伏膜蛋白或核抗原結(jié)合到啟動(dòng)子位點(diǎn)的c-Jun 和轉(zhuǎn)錄激活因子 ATF2 上，增強(qiáng)激活蛋白 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子的活性而導(dǎo)致的34, 35。因此可以通過(guò)抑制 VEGFR 實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的抗生成治療。目前鼻咽癌VEGFR 靶點(diǎn)進(jìn)行的靶向治療試劑有單克隆抗體貝伐單抗和小酪氨酸激酶抑制劑。盡管VEGFR 是鼻咽癌靶向治療中一個(gè)很有吸引力的靶點(diǎn)，但在實(shí)際臨VEGFR 靶點(diǎn)開(kāi)展的鼻咽癌抗床中生成治療并不多見(jiàn)。根據(jù)美國(guó)腫瘤放射治療協(xié)作組(RTOG)最近完成的一項(xiàng)利用貝伐單抗局部晚期鼻咽癌的 II 期臨床實(shí)驗(yàn)中，貝伐單抗的抗順鉑和5-氟尿嘧啶同

48、步放療治療生成治療被證明是沒(méi)有效果的36, 37。在另一項(xiàng) II 期臨床實(shí)驗(yàn)中，使用治療 26 例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患6華技大學(xué)博士38。因此，者，中位進(jìn)展時(shí)間為 1.8，中位總生存時(shí)間為 4.2鼻咽癌的抗生成治療其臨床效果目前是不樂(lè)觀的，VEGFR 是否能作為鼻咽癌治療的有效靶點(diǎn)，還有待臨床進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。1.2.3 COX-2 為靶點(diǎn)的靶向治療環(huán)氧合酶（COX）是參與的一個(gè)關(guān)鍵酶。它具有兩種形式：COX-1素和COX-2。COX-1 在正常組織的細(xì)胞膜上進(jìn)行組表達(dá)，而 COX-2 只在炎癥和腫瘤發(fā)生過(guò)才被誘導(dǎo)產(chǎn)生，且它對(duì)腫瘤的發(fā)展具有重要的作用。體外和在體實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，COX-2 與腫瘤生長(zhǎng)、

49、轉(zhuǎn)移、生成及其凋亡密切相關(guān)39。有研究表明，43%-75%的鼻咽癌患者都過(guò)表達(dá) COX-2，并且它與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)39, 40。因此 COX-2 是鼻咽癌靶向治療一個(gè)重要的靶標(biāo)，塞來(lái)昔布（Celecoxib）是它的抑制劑。Liu 等，Celecoxib 可以部分通過(guò)抑制STAT3 磷酸化從而抑制鼻機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明41。臨床研究咽癌細(xì)胞的增值并誘導(dǎo)其凋亡，但具體的中，Celecoxib 治療過(guò)的鼻咽癌患者，其生成減少，且腫瘤轉(zhuǎn)錄相關(guān)表達(dá)水平都發(fā)生下調(diào)42。目前鼻咽癌COX-2 靶點(diǎn)進(jìn)行的臨床治療還在進(jìn)一步的評(píng)價(jià)中。除了EGFR、VEGF 及COX-2 的過(guò)表達(dá)與非轉(zhuǎn)移性晚期鼻咽

50、癌的不良預(yù)后密切相關(guān)外43，還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌也高表達(dá)c-MET、c-Kit 及Her-2 等，因此它們也可能成為鼻咽癌潛在的治療靶標(biāo)。從以上綜述可知，目前只有 CetuximabIMRT 或放化療，有可能成為局部晚期鼻咽癌治療的新選擇。但是 Cetuximab 為嵌合抗體，尚存在人抗體（HAMA）反應(yīng)導(dǎo)致的毒副作用問(wèn)題。而且，由于抗體量大，對(duì)腫瘤胞外基質(zhì)穿透能力不夠，使得大體積實(shí)體腫瘤的治療效果仍不十分理想。利用工程將完整抗體改造為不同量大小的 Fab、scFV、二價(jià)抗體或重組片段（如圖 1.4 所示），可以增加對(duì)腫瘤的穿透能力，但是相對(duì)于完整抗體，其親和力大大減弱44。隨著抗體與改造技術(shù)的進(jìn)步，

51、越來(lái)越多的完全人源化抗體正在臨床，免疫原性問(wèn)題有可能會(huì)得到解決45。此外，由于抗體為異體蛋白，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，易造成腫瘤的靶向給藥量不足，影響其治療效果。7華技大學(xué)博士圖 1. 4 單克隆抗體和抗體片段。靶向抗體通常是免疫球蛋白G（IgG, A）或 Ig段（B-D）。F(ab )2 (B) 或 Fab (C)片段可以由完整單克隆抗體酶切形成也可以通過(guò)生物學(xué)技術(shù)克隆形成，例如 Fab，scFV，二價(jià)抗體或重組片段。通過(guò)傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的單克隆抗體是的，現(xiàn)在技術(shù)的發(fā)展可以 嵌合抗體、人源化或完全人源化的抗體或片段。VH，可變重鏈，VL， 可變輕鏈44。Fig. 1. 4 Antibodies

52、and antibody fragments. Targeting antibodies are normally monoclonal immune-globulin G (IgG) (Aa) or IgG fragments ( BD). F(ab )2 (B) or Fab (C) fragments can be made by enzymatic cleavage of the whole monoclonal antibody (mAb) (Aa) or by molecular biological techniques, for example, Fab (C), scFV (

53、Da), bivalent ( Db) or recombinant fragments (Dc). mAbs that are made from the traditional hybridoma technique are murine in origin. Recent developments have led to improved techniques for the production of chimeric, humanized or fully human antibodies or fragments (Abd). VH, variable heavy chain; V

54、L, variable light chain44.1.2.4 基于多肽的靶向治療常見(jiàn)的化療和放療對(duì)腫瘤患者會(huì)造成的嚴(yán)重毒副作用，而抗體制劑又具有免疫原性和穿透力弱的缺陷，而多肽類因具有穿透力強(qiáng)、免疫原性低、毒副作用小的特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。不同的活性多肽對(duì)不同腫瘤作用機(jī)制不同，因此根據(jù)多肽進(jìn)行抗腫瘤治療的特點(diǎn)，可以將多肽分為抗腫瘤肽、抗菌肽及靶向多肽這三類。1.2.4.1 抗腫瘤肽腫瘤是多因素、多階段的各種交互作用發(fā)展產(chǎn)生的，但最終都涉及到癌的表達(dá)和調(diào)控?？鼓[瘤肽可以直接與腫瘤相關(guān)的和對(duì)腫瘤產(chǎn)生作用的調(diào)控因子特異性結(jié)合，從而抑制腫瘤 DNA、腫瘤新生生成和轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)8華技大學(xué)博士腫瘤細(xì)胞凋亡。Dasgupta 等研究者利用蛋白激酶Raf-1 的部分多肽（ISNGFGFK）干擾 Raf-1 與成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 Rab 的結(jié)合，從而抑制 Rb 磷酸化、細(xì)胞增殖及VEGF 介導(dǎo)的毛細(xì)生成。而且在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)該多肽處理過(guò)的肺癌 A549 皮下荷瘤鼠，其腫瘤體積縮小 79%，毛細(xì)數(shù)量減少了 57%46。強(qiáng)效的天然生長(zhǎng)抑素（SST）類似物奧曲肽(octreotid)，是一種人工的環(huán)狀八肽抗腫