葎草多糖的超聲提取及抑菌活性研究

1、葎草多糖的超聲提取及抑菌活性研究        【摘要】  目的優(yōu)化葎草多糖的超聲輔助提取工藝，并研究其抑菌活性。方法以多糖中的葡萄糖含量為指標，對超聲波功率、料液比和超聲時間進行L9（34）正交實驗，確定超聲輔助提取葎草粗多糖的最佳工藝。用DE-52交換柱對葎草粗多糖進行分離，以濾紙片法研究葎草粗多糖和多糖分離組分的抑菌能力。結(jié)果以水為提取溶劑，料液比128（g/ml），超聲功率120W，超聲90 min提取2次，葎草多糖的得率為0.755。葎草粗多糖的抑菌效果具有一定的劑量依賴性；各多糖組分中HSP-

2、、HSP-、HSP-發(fā)揮主要抑菌作用，其中HSP-效果最顯著，HSP-抑菌效果不明顯，且各組分間表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系。結(jié)論超聲波輔助提取葎草多糖方法可行，得率高。葎草多糖具有抑菌活性。 【關(guān)鍵詞】  葎草多糖分離抑菌活性Abstract：ObjectiveTo optimize the ultrasound-assisted extraction method and to study the antibacterial activity of polysaccharides from Humulus scandens. MethodsTaking the content of gluco

3、se as observation index, we optimized the extraction process by L9（34）orthogonal experiment. The Humulus scandens polysaccharides (HSP) was purified into HSP-, HSP-, HSP- and HSP- by ion exchange chromatography with DE-52. The antibacterial activity of each component was tested by means of filter pa

4、per.ResultsThe optimal extraction conditions were obtained as follows: water refluxing, a ratio of solid -liquid as 1g:28ml,120W for the intension of ultrasonic power, extracting time 90min and extracting two times. Under aforesaid optimization conditions, the yield of polysaccharides was 0.755%. An

5、tibacterial experiments indicated that the inhibitory effect of crude polysaccharides showed dose-dependent. Among the isolated components, HSP-, HSP-, HSP- played main antibacterial roles and HSP- was ineffective. It was cooperative with different isolated components. ConclusionThe yield of Humulus

6、 Scandens polysaccharides is high with ultrasound-assisted extraction method. The Humulus scandens polysaccharides has obvious antibacterial action.Key words：Humulus scandens;   Polysaccharides;   Isolation;   Antibacterial activity    葎草Humulus scandens

7、(Lour.)Merr.又名拉拉藤，拉拉秧，一年生或多年生草本植物，全國各地幾乎均有分布。葎草生長旺盛，富含營養(yǎng)，既可以作為飼料，提高飼喂動物的生長狀況，又可以藥用，有清熱解毒、利尿消腫之功效1。據(jù)報道，葎草中含有木犀草素、葡萄糖苷、膽堿、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、樹脂、天門冬酰胺等物質(zhì)2，其提取物具有抗結(jié)核菌的功效3，因而漸漸引起人們的研究興趣。近年對于葎草中的木犀草素、黃酮類物質(zhì)的提取已有少量研究4，5，但對葎草中多糖類物質(zhì)的提取和活性研究還未見報道。本文采用超聲波輔助提取方法制備葎草總多糖，并對多糖的抑菌活性進行研究，以期為這一優(yōu)勢植物資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。1   材

8、料與儀器1.1  材料葎草，采自江蘇科技大學校園內(nèi)，晾干后粉碎過100目篩，干粉于干燥器中密封保存。大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis、鏈球菌Streptococcus，由本校生物與環(huán)境工程學院微生物實驗室提供。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3.5 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g，水1 000 ml，pH 7.07.2，121滅菌30 min）。1.2  試劑葡萄糖、硫酸、苯酚、活性炭、乙醇、牛肉膏、蛋白胨等，均為國產(chǎn)分析

9、純。1.3  儀器UV-9100紫外分光光度計，KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，F(xiàn)A2104型精密天平，Avanti J-25高效大容量冷凍離心機（Beckman），DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱，瑞士Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀，HWS-20恒溫水浴箱，超凈工作臺等。2  方法2.1  多糖的提取與純化2.2 多糖含量的分析方法1             換算因子= W/C×D。式中：W為所取的純化多糖重量（mg），C為多糖儲備液中葡萄

10、糖質(zhì)量（mg），D為多糖的稀釋因素。實驗測定結(jié)果換算因子為4.47。2.3   葎草多糖的抑菌活性7，8將供試菌種分別接種到裝有培養(yǎng)基的試管內(nèi)，進行擴大培養(yǎng)（37培養(yǎng)24 h）。取活化好的菌種斜面，用無菌生理鹽水配制成106個ml的菌懸液，備用。抑菌作用的測定采用濾紙片法。將濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的圓形小紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿中，干熱滅菌(160，2 h)后備用。將葎草多糖配置成不同濃度溶液，用無菌鑷子將濾紙片放入溶液中，另取濾紙片放入蒸餾水中作陰性對照，放入10mg/紅霉素中作陽性對照，均浸泡24 h。取制備好的菌懸液0.2 ml，滴入已經(jīng)倒有固體培養(yǎng)基的

11、平皿表面，用涂布器使其均勻分布。用無菌鑷子夾取浸有上述樣品的濾紙片，放入含菌平皿中，每皿3片。按上述相應條件培養(yǎng)，每種菌作3個重復試驗，量取抑菌圈直徑，取平均值。3  結(jié)果3.1  超聲波功率對葎草多糖含量的影響在其他條件一致的情況下（水為提取溶劑，料液比130，提取時間90 min），取不同的超聲波功率80，100，120，140，160，180 W和200W提取多糖，提取兩次，合并濾液，計算多糖含量。實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著超聲波功率的增加，葎草多糖的含量呈現(xiàn)出一定的波動，分別在100W和160W處出現(xiàn)兩個峰值，且100W的含量高于160W。超聲功率增加，對

12、細胞壁的機械剪切作用增強，使細胞內(nèi)多糖溶出率增加，溶液中多糖含量也相應提高。但隨著功率的進一步增加，在促進多糖溶出的同時，對多糖的破壞作用也在加強，進而導致多糖含量逐漸下降。考慮到多糖含量和能耗多少，多糖的提取功率以100W較為適宜。3.2  提取時間對葎草多糖含量的影響固定料液比130，按照不同的處理時間，采用超聲波功率100W分別提取兩次，合并濾液，計算多糖含量，實驗結(jié)果如圖2所示。由圖可知，多糖從細胞的溶出量與超聲波作用的時間長短有關(guān)，隨著浸提時間延長，由超聲波引起的剪切作用和空化作用導致多糖溶出量持續(xù)上升，在處理時間為120min時多糖含量達到最高，比處理60min實驗組的多

13、糖含量多出66.9。但時間過長，游離于溶液中的多糖分子又受到超聲波的持續(xù)作用導致分子斷裂，引起多糖含量下降，浸提150min后，多糖含量只有最高值的71.4。由此可以得出超聲波提取時間應以120min為宜。3.3   料液比對葎草多糖含量的影響按照不同料液比（g/ml），以超聲波功率100 W提取120 min，合并兩次濾液，測定并計算多糖含量，結(jié)果如圖3所示。溶劑用量對提取液中的多糖含量有較明顯的影響。隨著提取溶劑用量的逐漸上升，物料與溶劑的接觸面擴大，多糖自細胞溶出后能更加充分的擴散到溶液中，多糖含量逐漸上升，當料液比125時達到最大值。此后隨著提取溶劑的繼續(xù)增加，物料

14、過于分散，超聲波的作用相對減弱，使多糖溶出量較少，多糖含量下降。同時，液料比過大會導致溶劑浪費，多糖分離困難，后續(xù)操作成本增加，根據(jù)圖3結(jié)果，料液比選擇125為宜。3.4  正交實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以超聲波功率、浸提時間和料液比作為主要因素進行正交試驗設(shè)計，葎草干粉用量為每份1.0g，對提取液中的多糖含量進行測定計算，結(jié)果見表1。由表1可知，在所試的3個因素中，料液比對提取液中多糖含量影響最大，時間次之，功率影響最小。其理論最優(yōu)提取工藝為A3B1C3，即功率120 W，時間90 min，料液比128，其組合條件不在本次正交實驗組中，按照A3B1C3進行補充實驗，其提取液中的多糖

15、含量為0.755%，高于正交實驗中的最高值。因此，采用超聲波進行輔助提取時，按128料液比，120 W超聲波功率，浸提90 min時，多糖含量達到最高值。表1  正交實驗結(jié)果分析（略）3.6   葎草多糖對細菌的作用效果將制備的葎草粗多糖配成1.0，10.0，100.0 mg/ml 3個濃度的水溶液，采用濾紙片法進行葎草粗多糖的抑菌實驗，結(jié)果見表2。由表2可知，葎草粗多糖對4種菌均有不同程度的抑制作用，且隨著葎草粗多糖濃度的加大，抑菌作用也逐漸增強。相同濃度下，多糖溶液對大腸桿菌的抑菌效果最好，明顯大于對其他菌種的抑制作用，這可能與大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，其他菌種

16、為陽性菌有關(guān)。    將HSP-、HSP-、HSP-、HSP-均配成10.0mg/ml的溶液，進行抑菌實驗，結(jié)果如表3所示。由表3可知，葎草多糖各組分的抑菌效果存在較大的差異性。HSP-和HSP-對大腸桿菌具有很強的抑制作用，但對蘇云金芽孢桿菌的抑制作用很弱，對后者的抑菌圈直徑僅為對前者抑菌圈直徑的17%。和26%HSP-和HSP-對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，明顯高于HSP-和HSP-的抑制效果。此外對鏈球菌起到抑制作用主要是HSP-，其他組分作用則很弱。而對蘇云金芽孢桿菌的抑菌效果，4種多糖組分都很微弱，幾乎沒有，但是葎草粗多糖對其抑菌效果卻較好，可能是通過

17、4種組分中的兩種或幾種協(xié)同作用實現(xiàn)的。總體看來，HSP-的抑菌作用最為明顯，HSP-的抑菌效果最小，但從分離所得含量上來看，后者明顯高于前者，因此葎草的抑菌活性更多的應是不同組分之間的協(xié)同作用。表2  葎草粗多糖作用于不同菌種的抑菌圈直徑cm（略）表3  葎草多糖組分作用于不同菌種的抑菌圈直徑cm（略）4  結(jié)論    葎草葉片超聲輔助水提取的工藝簡單，成本較低，得率較高，最佳提取工藝為：料液比128（gml），超聲波功率120W，提取時間90min，提取兩次，多糖得率可達0.755%。    葎草粗多糖經(jīng)DE-52柱層析分離后可得四種組分：HSP-、HSP-、HSP-和HSP-，其中HSP-含量最大。    葎草葉片多糖對大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均有一定程度的抑制作用，因而在食品防腐和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)前景廣闊。【】  1孫躍春, 徐彤寶, 王艷玲. 葎草的綜合開發(fā)利用J. 林副特產(chǎn), 2003, 3: 57. 2李俊婕, 王曉靜. 葎草的研究進展J. 齊魯藥事, 2007, 26(6): 353.3陳偉光, 林霞, 睢鳳英, 等. 葎草抗結(jié)核分歧桿菌研究J. 時珍國醫(yī)國藥, 200