第三章熒光分光光度法

1、第三章第三章 熒光分光光度法熒光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：前言：v1852年，斯托克斯（Stokes）發(fā)現(xiàn)螢石在暗處受到光的照射會(huì)發(fā)出一種藍(lán)白色的光，他把這種光命名為“熒光”。v1868年 Goppelstroeder發(fā)表了利用Al-桑色素綠色熒光來分析微量Al的分析方法，可見熒光分析是一種歷史悠久的分析方法。 時(shí)至今日，熒光分析在方法上取得了極大的進(jìn)展。促進(jìn)了諸如時(shí)間分辨、相分辨、熒光偏振、熒光免疫、同步熒光等熒光分析新方法的發(fā)展，同時(shí)促使各種各樣新型熒光分析儀器的出現(xiàn)。 在儀器化方面，微機(jī)控制的全自動(dòng)熒光分析儀具有靈敏度高（比紫外-可見

2、分光光度法高23個(gè)數(shù)量級(jí)）、選擇性好、工作曲線線性范圍寬，且能提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光壽命、量子產(chǎn)率、偏振和各向異性諸多信息等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種重要的痕量分析技術(shù)。 在生物、醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境和石油工業(yè)等諸多領(lǐng)域，熒光分析法都有廣泛的應(yīng)用。不僅能直接和間接地分析眾多的有機(jī)化合物，而且利用與有機(jī)試劑間的反應(yīng)還能進(jìn)行許多無機(jī)元素的測(cè)定。 隨著科技的發(fā)展進(jìn)步，熒光這種光致發(fā)光（photoluminescence）的本質(zhì)進(jìn)一步被揭開。v物質(zhì)除了受紫外-可見光照射后會(huì)發(fā)出紫外和可見（UV-Vis）熒光之外，受其它各種不同波長(zhǎng)光的照射后，同樣也有發(fā)光現(xiàn)象。例如：例如：X-熒光、紅外熒光等。v除了

3、吸收光能使分子激發(fā)而發(fā)光，根據(jù)起始激發(fā)形成的方式，可以將熒光同其它的發(fā)光類型（例如例如：生物發(fā)光、熱發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和摩擦發(fā)光）區(qū)別開來。v通過化學(xué)反應(yīng)使分子受激而發(fā)光稱為“化學(xué)發(fā)光”。利用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行分析工作叫“化學(xué)發(fā)光分析”。 v化學(xué)發(fā)光分析、熒光分析和磷光分析統(tǒng)稱為“分子發(fā)光分析(molecular luminescence)”。v熒光和磷光同屬光致發(fā)光。通過測(cè)定發(fā)光的強(qiáng)度可以定量測(cè)定許多痕量的無機(jī)物和有機(jī)物。v相對(duì)于磷光和化學(xué)發(fā)光而言，目前熒光法的應(yīng)用較多。 本章主要討論熒光分析。圖圖3-1 吸收光譜和熒光光譜能級(jí)躍遷示意圖 3.1 分子熒光產(chǎn)生的本質(zhì)分子熒光產(chǎn)生的本質(zhì)(Molecula

4、r Fluorescence)v電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1（S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和（0或1） 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定（洪特規(guī)則），三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低。v激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑：（1）多種途徑和方式（見能級(jí)圖）：返回速度最快、 激發(fā)態(tài)壽命最短（停留時(shí)間短）的途徑占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。（2）第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài)表示為S1、S2； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài)表示為T1、T2。（3）電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷（發(fā)光）和無輻射躍遷等方式失去能量；（4）輻射躍遷輻射躍遷：熒光、延遲熒光和磷光；v無輻射躍遷（無輻射躍遷（非輻射能量傳遞過程

5、）：系間跨越、內(nèi)轉(zhuǎn)移、外轉(zhuǎn)移和振動(dòng)弛豫。 （1）振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過程，其效率較高。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級(jí)間，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的分子內(nèi)過程。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍遷回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。（3）外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其它分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。（4）系間跨越系間跨越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。/激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。 改變電子自旋，

6、禁阻躍遷，通過自旋-軌道耦合進(jìn)行。1.1.產(chǎn)生熒光的原因產(chǎn)生熒光的原因 熒光物質(zhì)的分子吸收了特征頻率的光能后，由基態(tài)躍遷到能級(jí)較高的第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)，然后通過無輻射躍遷返回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上，再?gòu)脑撃芗?jí)降落至基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)上，同時(shí)放出相應(yīng)能量的分子熒光，最后以無輻射形式回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。 需要注意的是：（1）整個(gè)過程是在單線態(tài)之間進(jìn)行的；（2）產(chǎn)生熒光的過程極快，約在10-8秒左右內(nèi)完成；（3）熒光的產(chǎn)生是由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)開始，而與熒光分子被激發(fā)至哪一個(gè)能級(jí)無關(guān)。 因此，熒光光譜的形狀和激發(fā)光的波長(zhǎng)無關(guān)。2. 磷光（磷光（Phospho

7、rescence） 當(dāng)某些物質(zhì)分子被激發(fā)到較高的能級(jí)，并通過無輻射躍遷降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)之后，尚不能繼續(xù)直接降落至基態(tài)，而是通過另一次無輻射躍遷降至一個(gè)中間的亞穩(wěn)態(tài)能級(jí)三重線態(tài)上，這些分子在三重線態(tài)上經(jīng)短暫停留后，再降落至基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)上，同時(shí)發(fā)出輻射光，稱這種發(fā)出的輻射光為磷光。 l磷光與熒光的區(qū)別主要為：（1）產(chǎn)生磷光的過程稍長(zhǎng)，約在10-5秒0.1 秒，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)1秒以上；（2）兩者發(fā)光機(jī)理不同；（3）在輻射停止幾秒或更長(zhǎng)一段時(shí)間后，仍能檢測(cè)到磷光，而上述熒光現(xiàn)象在照射光一旦停止照射，熒光便立即消失。3. 遲滯熒光（延遲熒光）遲滯熒光（延遲熒光） 某些分子在躍遷至

8、三重線態(tài)之后，通過熱激活作用，可以再回升至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)上，然后再由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)（v=0）降落至基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)而發(fā)出熒光，這種光叫做遲滯熒遲滯熒光光（或：延遲熒光延遲熒光）。. 分子吸收光譜與分子熒光光譜的關(guān)系分子吸收光譜與分子熒光光譜的關(guān)系 分子吸收光譜和分子熒光光譜都是分子內(nèi)部振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)的反映，但是分子吸收光譜是反映電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)情況。 在大多數(shù)分子中，由于電子激發(fā)態(tài)和電子基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)相似，因此吸收光譜和熒光光譜往往呈現(xiàn)大致的鏡像對(duì)稱關(guān)系。 這是由于熒光物質(zhì)不管它被激發(fā)到哪一個(gè)更高的電子能級(jí)，它返回到基態(tài)時(shí)總是先以多種無輻射形式

9、過渡到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上，然后才輻射躍遷到電子基態(tài)的任一能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出熒光光譜。所以熒光光譜比吸收光譜簡(jiǎn)單一些。 3.2 熒光與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系熒光與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系. 物質(zhì)產(chǎn)生熒光的兩個(gè)物質(zhì)產(chǎn)生熒光的兩個(gè)必須條件必須條件物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與熒光的發(fā)生及熒光強(qiáng)度的大小有著緊密有關(guān)。v 分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：（1）物質(zhì)分子必須具有能吸收一定頻率光的特征結(jié)構(gòu)；（2）物質(zhì)分子在吸收了特征頻率的輻射能之后，必須具有高的熒光率，即具有較高的熒光效率（fluorescence efficiency）。 熒光效率（又稱：量子產(chǎn)率，記為 ） 吸收的光子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)

10、發(fā)射熒光的分子數(shù) 熒光效率愈大，熒光的發(fā)射強(qiáng)度愈大，無輻射躍遷幾率就愈小。 當(dāng)熒光效率等于零時(shí)就意味著不能發(fā)射熒光。因此，熒光物質(zhì)必須具有較大的熒光效率。. 物質(zhì)產(chǎn)生熒光與其分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系物質(zhì)產(chǎn)生熒光與其分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系(1) 有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)與分子熒光的關(guān)系 什么樣結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物會(huì)發(fā)出熒光？一般可以從以下三方面來分析：a. 碳原子骨架碳原子骨架 一般含有共扼體系的分子可產(chǎn)生熒光。共扼度越大，則離域電子愈易被激發(fā)，愈易產(chǎn)生熒光。所以絕大多數(shù)熒光物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。 b. 分子的幾何排布分子的幾何排布 物質(zhì)的分子為平面型，且具有一定的剛性結(jié)構(gòu)，這樣的分子熒光強(qiáng)烈。 對(duì)于順反異構(gòu)體，順式分子的兩

11、個(gè)基團(tuán)在同一側(cè)，由于位阻原因不能共平面，而沒有熒光。 c. 芳環(huán)上取代基的類型和位置 （!）類型）類型v有些取代基可增強(qiáng)熒光：如-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等；v有些取代基可減弱熒光：如-COOH、-C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等；v有些取代基影響不明顯：如-F、-SH、-SO3H等。（!）位置）位置v鄰、對(duì)位取代，熒光增強(qiáng)；間位取代，熒光減弱。 注：分子所處的環(huán)境，如溶劑、溫度、pH等都可能會(huì)影響分子的結(jié)構(gòu)或立體構(gòu)象，當(dāng)然也就會(huì)影響分子能否產(chǎn)生熒光。(2) 無機(jī)化合物的熒光 除過渡元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無輻射躍

12、遷，因而不能產(chǎn)生熒光。 但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬離子的測(cè)定。 不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)增大，常會(huì)發(fā)出熒光。 例如：8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強(qiáng)的熒光。這也是由于剛性和其平面性增加所致。 一般來說，能產(chǎn)生這類熒光的金屬離子具有硬酸型結(jié)構(gòu)，例如：例如：Be2+、Mg2+、Al3+等。 螯合物中金屬離子的發(fā)光機(jī)理發(fā)光機(jī)理，通常是螯合物首先通過配位體的*躍遷而被激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)移給金屬離子，導(dǎo)致d d*躍

13、遷或f f*躍遷，最終發(fā)射的是d*d躍遷或f*f躍遷光譜。 了解熒光和物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以幫助我們考慮如何將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)或?qū)晒鈴?qiáng)度不大或選擇性不高的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度大及選擇性高的熒光物質(zhì)，以提高分析的效果。 3.3 熒光分析的方法及影響因素?zé)晒夥治龅姆椒坝绊懸蛩?. 熒光參數(shù)熒光參數(shù)(1) 激激發(fā)光譜發(fā)光譜和和發(fā)射光譜發(fā)射光譜 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是用熒光法進(jìn)行物質(zhì)的定性、定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。a. 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 選擇并固定發(fā)射波長(zhǎng)EM和狹縫寬度S，讓激發(fā)單色器進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，記錄熒光強(qiáng)度（F）隨激發(fā)波長(zhǎng)的變化而變化的關(guān)系曲線，叫激發(fā)光譜。b. 發(fā)射光譜發(fā)射光譜

14、 選擇并固定激發(fā)波長(zhǎng)EX和狹縫寬度S，讓發(fā)射單色器進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，記錄熒光強(qiáng)度（F）隨發(fā)射波長(zhǎng)的變化而變化的關(guān)系曲線，叫發(fā)射光譜，見圖3-4。注意：注意：上述記錄的激發(fā)和發(fā)射光譜均為“表觀光譜”，它受儀器的光源特性儀器的光源特性、單色器的單色器的特性特性和檢測(cè)器的特性檢測(cè)器的特性等因素影響。 對(duì)于同一試樣，用不同的熒光儀記錄的“表觀光譜”需進(jìn)行校正，經(jīng)過校正的光譜稱為“真實(shí)熒光光譜”又叫“校正光譜”。 現(xiàn)代化的儀器都具有自動(dòng)記錄校正光譜的功能。(2) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度熒光物質(zhì)吸收輻射能后才發(fā)射熒光，因此溶液的熒光強(qiáng)度和該溶液的吸光程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。 設(shè)I0和I分別為照射在待測(cè)

15、溶液上的入射光和透過光強(qiáng)度，c和l分別為待測(cè)溶液濃度和液層厚度，則被測(cè)溶液吸收的光強(qiáng)度為： Ia= I0-I 根據(jù)光的吸收定律，得：I=I010-cl 則： Ia =I0-I=I0-I010-cl= I0(1- e-2.303cl) （3-1） 因?yàn)槿芤旱臒晒獍l(fā)射強(qiáng)度F和它吸收的光能Ia成正比，并且與熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。所以： F= Ia= I0(1-e-2.303cl) (3-2)式中： 為熒光效率，而其中e-2.303cl展開得 e-2.303cl=1-2.303cl+(-2.303cl)2/2!+ (-2.303cl)3/3!+ (3-3) v若溶液濃度c很低， 、l都是定值，則cl

16、的值很小，當(dāng)A=cl0.05時(shí)，上面級(jí)數(shù)展開式中第二項(xiàng)以后的各項(xiàng)可以忽略不計(jì)，因此： e-CL = 1- 2.303cl （3-4）將（3-4）代入（3-2）得 ： F= 2.303I0cl （3-5）式中：量子效率； I0：入射光強(qiáng)度；：摩爾吸光系數(shù)；b： 光程； c：濃度 當(dāng)入射光強(qiáng)度I0一定時(shí)， F= Kc （3-6）v公式成立前提條件：bc=A0.05 即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c0.05/b），F(xiàn)與c方成線性。熒光物質(zhì)的最大濃度為Cmax 0.05/L左右。當(dāng)濃度較大時(shí)，即它的吸光度大于0.05時(shí)，熒光強(qiáng)度與其濃度的線性關(guān)系將發(fā)生偏離。熒光測(cè)定的線性范圍一般在10-5100 g/mL之間

17、。 在濃度較高時(shí)，產(chǎn)生這種偏離的原因可能是激發(fā)分子間互相碰撞而失去能量（自身自身猝滅猝滅），或者是熒光被未激發(fā)的分子所吸收（自身吸收自身吸收）。(3) 熒光總量熒光總量 熒光發(fā)射譜的面積積分，稱為熒光總量。(4) 峰值波長(zhǎng)和譜帶寬度峰值波長(zhǎng)和譜帶寬度 峰峰值波長(zhǎng)值波長(zhǎng)在譜圖（包括激發(fā)譜和發(fā)射譜）中具有最大熒光強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱為峰值波長(zhǎng)。譜帶寬度譜帶寬度常用“半寬”來表示，即熒光峰強(qiáng)度值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)寬度。 或：熒光譜的半高寬稱為譜帶寬度。(5) 量子產(chǎn)率量子產(chǎn)率（或稱：（或稱：熒光效率熒光效率） =發(fā)出的光量子數(shù)/吸收的光量子數(shù)。 (6) 熒光偏振熒光偏振 在研究分子的結(jié)構(gòu)變化時(shí)用。

18、用來研究熒光的各向異性（熒光的偏振性）。它是在激發(fā)和發(fā)射光路中引入兩個(gè)偏正器。它可用偏振度偏振度（P）表示：P=（FII -F）/（FII +F） 式中：FII表示與激發(fā)光振動(dòng)方向平行振動(dòng)的偏光成分；F表示與激發(fā)光振動(dòng)方向垂直振動(dòng)的偏光成分。(7) 熒光壽命熒光壽命 它是研究分子結(jié)構(gòu)時(shí)要求的參數(shù)。 定義定義：熒光強(qiáng)度衰減到1/e所需的時(shí)間，用表示。 任意時(shí)間（t）的熒光強(qiáng)度： If =If0e-t/=If0e-Kt 式中：If移去激發(fā)光源后任一時(shí)間t時(shí)的熒光強(qiáng)度；If0激發(fā)時(shí)最大的熒光強(qiáng)度；K儀器衰減常數(shù)；激發(fā)態(tài)的平均壽命。(8) 熒光分析的靈敏度熒光分析的靈敏度 對(duì)整個(gè)發(fā)射光譜而言； /H對(duì)

19、部分發(fā)射光譜而言，即對(duì)所測(cè)到的不是整個(gè)熒光光譜，只是靠近熒光峰的一個(gè)狹窄的譜帶（H為熒光峰的半高寬/譜帶寬度）。2. 熒光分析方法熒光分析方法（1）定性方法定性方法 不同分子結(jié)構(gòu)的各種熒光物質(zhì)，具有不同的激發(fā)光譜（即: 吸收光譜）和熒光光譜，這是分子熒光分析的定性依據(jù)。 在定性分析時(shí)，一般是在一定實(shí)驗(yàn)條件下，用熒光分光光度計(jì)作試樣和標(biāo)樣的激發(fā)光譜和熒光光譜，然后比較它們的光譜圖，即可鑒定試樣物質(zhì)。有時(shí)需改變?nèi)軇┖笤俦容^它們的光譜圖，如二者一致，即為同一物質(zhì)。（2）定量方法定量方法 目前，熒光分析多數(shù)用于熒光物質(zhì)的定量分析。常用的定量方法有直接比較法直接比較法、工工作曲線法作曲線法和內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法

20、。a. 直接比較法直接比較法 設(shè)CX、CS分別為試樣和標(biāo)樣溶液的濃度，F(xiàn)X、FS和FX0、FS0分別為試樣、標(biāo)樣熒光值和試樣、標(biāo)樣的本底熒光值，因?yàn)椋?FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或 Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比較法簡(jiǎn)單快速，它要求被測(cè)樣品濃度與其相應(yīng)的熒光值必須處于線性范圍內(nèi)。b. 工作曲線法工作曲線法 先配一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別測(cè)定其熒光值，然后將減去試劑空白熒光值的標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值與其相應(yīng)濃度作圖，即得其工作曲線。 根據(jù)試液及試液空白熒光值，在此曲線上即

21、可找到試液的濃度。同時(shí)根據(jù)工作曲線的線性情況，可確定試液的最高濃度范圍。c. 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 設(shè)Cx、Cs分別為試樣和標(biāo)樣濃度，F(xiàn)x、Fx0分別為試樣和試樣本底的熒光值；Fs +x為試樣加標(biāo)樣的混合溶液的熒光值。 則 Cx/CS=( FX - FX0)/( FS +x Fx) 或 Cx =CS( FX - FX0)/( FS +x Fx) 除了這種內(nèi)標(biāo)計(jì)算法外，也可采用類似工作曲線的內(nèi)標(biāo)曲線法來求批量試樣的濃度。 用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，由于試樣和標(biāo)樣的熒光值是在相同體系中測(cè)定的，因此可消除試樣中某些雜質(zhì)熒光的干擾。3. 熒光分析中的主要影響因素?zé)晒夥治鲋械闹饕绊懸蛩兀?）溶液濃度溶液濃度 要求c0.05

22、/L，當(dāng)高濃度時(shí)，由于自熄滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與分子濃度不呈線性關(guān)系。（2）溶劑的影響溶劑的影響 一般來說，隨著溶劑介電常數(shù)的增大，熒光峰的波長(zhǎng)越大，熒光效率也越大。 在含有重原子的溶劑（例如例如：碘乙烷CH3CH2I 和四溴化碳CBr4）中，也是由于重原子效應(yīng)，增加系間竄躍速度，會(huì)使熒光減弱、磷光則相應(yīng)增強(qiáng)。 溶劑中雜質(zhì)的熒光光譜或溶劑的拉曼光譜可能干擾測(cè)定。 若拉曼光處于熒光波長(zhǎng)中，則產(chǎn)生干擾。 消除干擾的方法有：（a）選用高分辨的儀器。（b）對(duì)純?nèi)軇┑睦暹M(jìn)行測(cè)定，然后在熒光光譜中進(jìn)行校正。（3）溫度的影響溫度的影響 大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨其所在溶液的溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度

23、減小。 顯然隨著溶液溫度升高，會(huì)增加分子間碰撞的次數(shù)，促進(jìn)分子內(nèi)能的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。為此在許多熒光計(jì)的液槽上配有低溫裝置，以提高靈敏度。（4）pH的影響的影響 當(dāng)熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時(shí)，溶液pH的改變對(duì)溶液的熒光強(qiáng)度有很大的影響，這是因?yàn)樗鼈兊姆肿雍退鼈兊碾x子在電子構(gòu)型上的差異。（5）熒光的熄滅熒光的熄滅熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光熄滅。這些引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熄熄滅劑滅劑。引起溶液中熒光熄滅的原因很多，機(jī)理也很復(fù)雜。下面討論幾種導(dǎo)致熒光熄滅作用的主要類型。（a）碰撞熄滅碰撞熄滅 碰撞熄滅是熒光熄滅的主要原因。 它是指處于單重激發(fā)態(tài)

24、的熒光分子M*與熄滅劑Q發(fā)生碰撞后，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生熄滅作用。碰撞熄滅的定量方程： F0/F-1=k Q 上式稱為Stern-Volmer方程式。 式中：k為熄滅常數(shù)；Q為熄滅劑濃度，單位mol/L；F0、F分別為熄滅劑不存在時(shí)和存在時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度。）k與體系的粘度有關(guān)系，粘度越大，k越??；）k與體系的溫度有關(guān)系，溫度升高，k也升高；溫度每升高1C，k值增加在2%以下；）熄滅劑的濃度Q不得大于10mol/L。（b）組成化合物的熄滅組成化合物的熄滅有些熒光熄滅現(xiàn)象不能用碰撞熄滅理論來解釋。 例如例如：某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之后，（*）溶液的吸收光譜有了

25、顯著的改變，（*）溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低。 又如又如：某些熒光物質(zhì)的溶液在加入熄滅劑之后，它的熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而增強(qiáng)。 以上幾種情況都是因?yàn)榻M成化合物熄滅所致。上述情況可能是： 絡(luò)合 M（有熒光）+Q MQ（無熒光） 分解T， MQ M+Q （熒光增強(qiáng)）如果MQ的形成是由于強(qiáng)大的力，則MQ將具有它自己的特征吸收，因此溶液的吸收光譜也發(fā)生了改變。（c）轉(zhuǎn)入三重線態(tài)（級(jí)）的熄滅轉(zhuǎn)入三重線態(tài)（級(jí)）的熄滅含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些雜環(huán)化合物，容易轉(zhuǎn)入三重線級(jí)，溶液中絕大部分轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的分子在一般溫度下不發(fā)光，它們將多余的能量消耗于它們與其它分子的

26、碰撞之中，因而引起熒光熄滅。 溶液中的溶解氧溶解氧常對(duì)熒光產(chǎn)生熄滅作用。這可能是由于順磁性的氧分子與處于單重激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)分子相作用，促進(jìn)形成順磁性的三重態(tài)熒光分子，即加速系間竄躍所致。 實(shí)驗(yàn)證明：O2的熄滅作用，似乎是隨溶劑的介電常數(shù)的減小而增加，所以O(shè)2在水溶液中熄滅作用較小，而在有機(jī)溶劑中熄滅作用較強(qiáng)。（d）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅 某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)的分子相互作用時(shí)，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，即氧化-還原反應(yīng)，因而引起熒光的熄滅。 例如例如：甲基蘭熒光溶液被Fe2+熄滅 D* + Fe2+ D- + Fe3+ 有熒光 無熒光 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金屬

27、離子，I-， Br-，S2O32-等易于給出電子的陰離子對(duì)奎寧、羅丹明及熒光素鈉等有機(jī)熒光物質(zhì)也會(huì)發(fā)生熄滅作用。（e）熒光物質(zhì)的自熄滅熒光物質(zhì)的自熄滅熒光物質(zhì)溶液的濃度大于1g/L時(shí)，常常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，所以液態(tài)純物質(zhì)的熒光一般都不強(qiáng)烈。 此種熄滅的原因：）由于濃度大，分子碰撞幾率大，因而引起能量損失大；）溶液濃度過高，物質(zhì)分子發(fā)生二聚體乃至多聚體，這些多聚體不發(fā)光。綜上所述：綜上所述： 無論何種類型的熄滅作用，均隨熄滅劑濃度的增加而增大。 如對(duì)試液進(jìn)行稀釋則可消除或降低熒光的熄滅作用。 這里O2的熄滅作用并未消除，需在試液中通N2或CO2以驅(qū)逐O2，方可達(dá)到消除的目的。（6）光散射光散射光散

28、射常常關(guān)系到一個(gè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度和再現(xiàn)性。 實(shí)踐中常遇到的光散射包括溶液的瑞利散射和拉曼散射、器壁的散射及膠粒的散射（丁鐸爾散射）。 當(dāng)物質(zhì)分子吸收了頻率較低的光能后，并不足使分子中的電子躍遷到電子的激發(fā)態(tài)，而只是上升到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí)上去，若在10-1510-12s返回到原能級(jí)，此時(shí)輻射出和激發(fā)光相同波長(zhǎng)的光，稱為瑞利散射瑞利散射。 若返回到較原能級(jí)稍高或稍低的振動(dòng)能級(jí)上，輻射出較激發(fā)光稍長(zhǎng)或稍短的光，稱為拉曼散射拉曼散射。（7）表表面吸附面吸附在稀溶液中（1g/mL），表面吸附尤為明顯，特別是有機(jī)溶劑，此吸附更為厲害。溶質(zhì)常常吸附在瓶子、吸管和吸收池等壁上。 芳香族化合物易吸附，并且所用溶

29、劑的極性越小，吸附就越大。 在非極性溶劑中加一點(diǎn)極性溶劑，常?？梢詼p少這種吸附損失。 3.4 熒光分析的儀器、特點(diǎn)及注意事項(xiàng)熒光分析的儀器、特點(diǎn)及注意事項(xiàng). 熒光的分析儀器熒光的分析儀器 由光源發(fā)出的光，經(jīng)第一單色器（激發(fā)單色器）后，得到所需要的激發(fā)光波長(zhǎng)。 熒光物質(zhì)被激發(fā)后，將向四面八方發(fā)射熒光，但為了消除入射光及散射光的影響，熒光的測(cè)定應(yīng)在與激發(fā)光呈直角的方向上進(jìn)行。儀器中的第二單色器稱為熒光單色器。它的作用是消除溶液中可能共存的其它光線的干擾，以獲得所需要的熒光。（1）光源光源 光源應(yīng)具有強(qiáng)度大、適用波長(zhǎng)范圍寬兩個(gè)特點(diǎn)。常用光源有高壓汞燈和氙弧燈。 v 高壓汞燈常用在熒光計(jì)中，發(fā)射強(qiáng)度大

30、而穩(wěn)定，但不是連續(xù)光譜。高壓汞燈的平均壽命均為15003000 h，熒光分析中常用的是365 nm、405 nm、436 nm三條譜線。 v 氙弧燈（氙燈）是連續(xù)光源，發(fā)射光束強(qiáng)度大，可用于200700 nm波長(zhǎng)范圍。在200 400 nm波段內(nèi)，光譜強(qiáng)度幾乎相等。 但氙燈需要穩(wěn)壓電源以保證光源的穩(wěn)定。 此外，高功率連續(xù)可調(diào)染料激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光光源的單色性好、強(qiáng)度大。脈沖激光的光照射時(shí)間短，并可避免感光物質(zhì)的分解。 （2）激發(fā)光單色器激發(fā)光單色器 在熒光計(jì)中，通常采用激發(fā)濾光片和熒光濾光片作為激發(fā)光束和熒光輻射的波長(zhǎng)選擇器。而大部分的熒光光度計(jì)中至少選用一個(gè)，而常常是用兩個(gè)

31、光柵單色器，且均帶有可調(diào)狹縫，以供選擇合適的通帶。 作用：提供單波長(zhǎng)的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào) 。 激發(fā)濾光片、激發(fā)單色器的作用是讓所選擇的激發(fā)光透過并照射于被測(cè)試樣上。 熒光濾光片、發(fā)射單色器的作用是把激發(fā)光所發(fā)生的容器表面的散射光、瑞利散射光和拉曼光以及溶液中雜質(zhì)熒光濾去，讓熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光通過而照射到檢測(cè)器上。 分光熒光計(jì)的入射狹縫及出射狹縫是用以控制通過波長(zhǎng)的譜帶寬度及照射到測(cè)定試樣上的光能強(qiáng)度的。 測(cè)定的目的不同，可以選擇不同的狹縫，以獲得較好的測(cè)定結(jié)果。（3）試樣池試樣池 熒光分析用的試樣池需用低熒光材料制成。常用石英為材料，形狀為四面透光的方形。 試樣池的

32、形狀以散射光較小的方形為宜。有的熒光計(jì)附有恒溫裝置，便于控制溫度。 測(cè)定低溫?zé)晒鈺r(shí)，在石英池外套上一個(gè)盛有液氮的石英真空瓶，以便降低溫度。（4）檢測(cè)器檢測(cè)器 熒光的強(qiáng)度比較弱，因此要求檢測(cè)器有較高的靈敏度。 在熒光計(jì)中常用光電池或光電管檢測(cè)。但在熒光分光光度計(jì)中常用光電倍增管檢測(cè)。 二極管陣列和電荷轉(zhuǎn)移檢測(cè)器也應(yīng)用于熒光光度計(jì)，它們可以迅速地記錄激發(fā)和發(fā)射光譜，特別適用于與色譜法或電泳法的聯(lián)用技術(shù)。此外，可以記錄二維熒光光譜圖。 目前，設(shè)計(jì)的許多熒光光度計(jì)具有不少新的功能。v 采用雙光束熒光分析裝置，可以提高方法的精度；v 采用凹面全息光柵的大孔徑異面光學(xué)系統(tǒng)，可減少雜散光的影響，并使檢測(cè)限達(dá)

33、5pg/mL；v采用“區(qū)分器”裝置，可以識(shí)別暗電流而不予記錄，以減少熒光信號(hào)的噪音等。v不少儀器中還配有累加、微分、偏振、流動(dòng)注射和液相色譜聯(lián)用裝置等，大大擴(kuò)展了熒光分析的應(yīng)用范圍。v 光學(xué)纖維可在遠(yuǎn)離光源和檢測(cè)器不同的區(qū)域中，進(jìn)行幾種熒光物質(zhì)的分析。 它是通過光學(xué)纖維將激發(fā)光源發(fā)出的輻射傳輸?shù)酱郎y(cè)試樣，然后由同樣的光學(xué)纖維將發(fā)射的熒光傳輸返回到檢測(cè)器，進(jìn)行測(cè)定。2. 熒光分析的特點(diǎn)及注意事項(xiàng)熒光分析的特點(diǎn)及注意事項(xiàng)（1）熒光分析的特點(diǎn)）熒光分析的特點(diǎn)a. 靈敏度高靈敏度高 分子熒光法的靈敏度通常比分子吸收光譜法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)（測(cè)定下限為0.1 0.001 gg-1）。這是因?yàn)樵跓晒夥治鲋?，可?/p>

34、采用高強(qiáng)度的光源和高靈敏度的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，從而大大地提高了它的分析靈敏度。而在分子吸收光譜法中，由于是測(cè)量入射光和透射光的比率，因而采取提高光源強(qiáng)度的辦法不能提高分析靈敏度。F= 2.303I0clb. 干擾少干擾少 由于多種分子在紫外-可見光區(qū)都能產(chǎn)生吸收，但是其中只有一部分分子能再發(fā)射熒光，因此分子熒光法的固有干擾少。c. 選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 因?yàn)闊晒夥ú坏梢罁?jù)其特征發(fā)射（發(fā)射光譜），而且可以依據(jù)其特征吸收（激發(fā)光譜）來鑒定物質(zhì)；而分光光度法只能根據(jù)被測(cè)物的特征吸收譜來鑒定。d. 試樣量少且方法簡(jiǎn)便試樣量少且方法簡(jiǎn)便 使用熒光微池用10L試液即可。e. 能同時(shí)提供較多的物理參數(shù)能同時(shí)提供較

35、多的物理參數(shù) 包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、熒光總量、極值峰位、譜帶寬度、量子產(chǎn)率、熒光壽命和熒光偏振等參數(shù)。(2) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 熒光分析雖有各種優(yōu)點(diǎn)，但也有其弱點(diǎn)，由于它對(duì)環(huán)境因素特別敏感，所以在熒光測(cè)定時(shí)，干擾因素也比較多，很容易受污染。a. 溶劑和化學(xué)試劑溶劑和化學(xué)試劑 對(duì)于溶劑，一是選擇要適當(dāng)，二是要足夠純。在使用波段范圍內(nèi)，選用的溶劑應(yīng)無吸收才好；另外溶劑中也不應(yīng)含有鹵素、硝基化合物或重金屬離子，否則會(huì)降低熒光強(qiáng)度。 對(duì)于試劑，越純?cè)胶谩. 熒光的污染熒光的污染 熒光的污染源很多（如：活塞的潤(rùn)滑油、橡皮塞和軟木塞、去污粉、洗液、濾紙和微生物等）。 試驗(yàn)器皿須用1:1HNO

36、3浸泡24小時(shí)或煮沸，再用蒸餾水洗凈，涼干備用。 3.5 熒光分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)熒光分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. 熒光計(jì)的校正熒光計(jì)的校正（1）靈敏度的校正）靈敏度的校正 熒光計(jì)的靈敏度可用被測(cè)出的最低信號(hào)來表示；或用某一標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的稀溶液在一定激發(fā)波長(zhǎng)照射下，能發(fā)射出最低信噪比時(shí)熒光物質(zhì)的最低濃度表示。 熒光分光光度計(jì)的靈敏度與三方面有關(guān)：（a）與儀器光源強(qiáng)度、單色器（包括：透鏡、反射鏡等）的性能、放大系統(tǒng)的特征和光電倍增管的靈敏度有關(guān)；（b）與所選用的波長(zhǎng)及狹縫寬度有關(guān)；（c）與空白溶劑的拉曼散射光、激發(fā)光和雜質(zhì)熒光有關(guān)。 由于影響熒光計(jì)靈敏度的因素很多，同一型號(hào)的儀器，甚至同一臺(tái)儀器，在不同時(shí)間操作

37、所測(cè)得的結(jié)果也不盡相同。因而在每次測(cè)定時(shí)，在選定波長(zhǎng)及狹縫寬度的條件下，先用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正（或稱：標(biāo)定），使每次所測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同的數(shù)值（50 %或100%）。如果被測(cè)物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光很穩(wěn)定，自身就可作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。 從紫外區(qū)到可見區(qū)常用的標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)有：酚（溶于甲醇）、吲哚（溶于乙醇）、奎寧（溶于0.05molL-1的H2SO4溶液）及熒光素（溶于水或乙醇）等。 最常用的是硫酸奎寧，產(chǎn)生的熒光十分穩(wěn)定。用0.001g的奎寧標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.05molL-1的硫酸中，使其濃度為1gmL-1，將此溶液進(jìn)行稀釋后用于儀器校正。(2) 波長(zhǎng)校正波長(zhǎng)校正 熒光分光

38、光度計(jì)的波長(zhǎng)刻度在出廠前一般都經(jīng)過校正，但若儀器的光學(xué)系統(tǒng)和檢測(cè)器有所變動(dòng)，或在較長(zhǎng)時(shí)間使用后，或在重要部件更換之后，有必要用汞弧燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器的波長(zhǎng)刻度重新校正，特別在精細(xì)分析工作中尤為重要。(3) 激發(fā)光譜和熒光光譜校正激發(fā)光譜和熒光光譜校正 用熒光分光光度計(jì)測(cè)得的激發(fā)光譜或熒光光譜，往往是表觀的，不是真實(shí)的。其原因很多：?jiǎn)紊鞑ㄩL(zhǎng)刻度不夠準(zhǔn)確；拉曼散射光的影響以及狹縫寬度較大等，但這些因素都可消除或得到校正。最主要的是光源的強(qiáng)度隨波長(zhǎng)而變，檢測(cè)器的響應(yīng)與波長(zhǎng)不成線性。 當(dāng)用單光束熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)光譜和熒光光譜時(shí)，因?yàn)椴挥脜⒈热芤鹤飨鄬?duì)校正，影響特別大。尤其是當(dāng)峰的波長(zhǎng)處在檢測(cè)

39、器靈敏度曲線的陡坡時(shí)，誤差最顯著。 因此，先將每一波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致（用儀器附有的校正設(shè)備），然后根據(jù)表觀光譜上每一波長(zhǎng)的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每一波長(zhǎng)的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正，以消除這種誤差。校正的方法常由于儀器不同而不完全相同。 目前生產(chǎn)的熒光分光光度計(jì)大多采用雙光束光路，可用參比光束抵消光學(xué)誤差。2. 實(shí)驗(yàn)新技術(shù)（1）時(shí)間分辨技術(shù)）時(shí)間分辨技術(shù) 時(shí)間分辨發(fā)光光譜技術(shù)是基于不同發(fā)光體的發(fā)光衰減速率的不同，配置使用帶時(shí)間延遲設(shè)備的脈沖光源（閃光燈或激光器）和帶有門控時(shí)間電路的檢測(cè)器件，通過選定延遲時(shí)間td和門控時(shí)間tg，對(duì)發(fā)射單色器進(jìn)行掃描，得到時(shí)間分辨發(fā)射光譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)光譜重疊但發(fā)光壽命不同的

40、組分進(jìn)行分辨和分別測(cè)定。 或者固定激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)門控時(shí)間掃描，得到發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的衰減曲線，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)光壽命的測(cè)量。 時(shí)間分辨技術(shù)還能利用不同發(fā)光體形成速率的不同進(jìn)行選擇性測(cè)定。（2）偏振和各向異性技術(shù)）偏振和各向異性技術(shù) 在偏振光激發(fā)下，熒光體所發(fā)射的熒光在空間取向強(qiáng)度不同，即偏振光。熒光偏振和各向異性測(cè)定，即只需在熒光分光光度計(jì)的激發(fā)和發(fā)射光路上分別加上起偏器和檢偏器（統(tǒng)稱：偏振附件）。 在處的熒光偏振P()和各向異性r()值可按如下公式計(jì)算：P() = III()- GI()/ III()+ GI()r() = III()- GI()/ III()+ 2GI() 式中：III()和I

41、()分別是檢測(cè)器的取向平行和垂直于起偏器取向時(shí)在波長(zhǎng)處觀察到的熒光強(qiáng)度，G為校正因子，可實(shí)驗(yàn)測(cè)定。 由于熒光偏振不僅與熒光體分子形狀、光選擇性和熒光體吸光對(duì)偏振激發(fā)的取向等內(nèi)在因素有關(guān)，而且許多外界因素，如：環(huán)境的粘度等都會(huì)影響和改變其偏振度，從而在生化領(lǐng)域中獲得了廣泛的應(yīng)用。 例如：例如：已用于生物分子間的締合反應(yīng)，膜內(nèi)微粘度和膜組成對(duì)膜相變的影響，蛋白質(zhì)的衰變和轉(zhuǎn)動(dòng)速度等研究中。 熒光體的偏振度與熒光體的轉(zhuǎn)動(dòng)速度成反比這一特性，可用于熒光免疫分析。例如：例如：當(dāng)小分子熒光體被聯(lián)結(jié)到大分子蛋白質(zhì)或抗體之后，由于體積變大，分子轉(zhuǎn)動(dòng)速度變慢，偏振度增大。若樣品中存在小分子抗原，則聯(lián)結(jié)于抗體上的熒

42、光體可能被抗原奪走，結(jié)果偏振度又下降，因而可用于抗體或抗原測(cè)定。 若采用脈沖偏振光激發(fā)熒光體，還可以進(jìn)行熒光偏振及各向異性的時(shí)間分辨測(cè)量。（3）同步掃描技術(shù)）同步掃描技術(shù) 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描技術(shù)可分為固定波長(zhǎng)差、固定能量差和可變角（可變波長(zhǎng)）同步掃描。 同步掃描技術(shù)具有使光譜簡(jiǎn)化，譜帶窄化，提高分辨率，減少光譜重疊，提高選擇性，減少散射光影響等諸多優(yōu)點(diǎn)。 固定波長(zhǎng)差同步掃描中，波長(zhǎng)差的選擇直接影響到同步光譜的形狀、帶寬和信號(hào)強(qiáng)度，從而提供了一種提高選擇性的途徑。 例如：例如：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜很相似，發(fā)射光譜又重疊嚴(yán)重，但是60nm的同步光譜

43、則只顯現(xiàn)色氨酸的光譜特征，從而可實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。 目前，有關(guān)合適的選擇已有若干理論研究，但在實(shí)際應(yīng)用中多根據(jù)具體的發(fā)光體系通過實(shí)驗(yàn)加以選擇。 固定能量差（）同步掃描可能克服0-0帶躍遷非常弱甚至不顯現(xiàn)的情況，以及不同組分對(duì)的不同要求所帶來的困難。有可能對(duì)同一類化合物（如多環(huán)芳烴）只選擇一個(gè)值用于整個(gè)光譜的掃描。同時(shí)還能最大限度地減小瑞利散射和拉曼散射的干擾。 可變角同步掃描技術(shù)可進(jìn)一步提高測(cè)量的選擇性。同步熒光分析方法的應(yīng)用：v 恒波長(zhǎng)同步熒光分析 多環(huán)芳烴和生物大分子的檢測(cè) 小分子與蛋白相互作用的熱力學(xué)研究v 恒能量同步熒光分析 多環(huán)芳烴的檢測(cè)v可變角同步熒光分析 天然產(chǎn)物檢測(cè) 高背景體系中微

44、量組分的檢測(cè)（4）三維光譜）三維光譜 三維熒光光譜（亦稱：總發(fā)光光譜或激發(fā)-發(fā)射矩陣圖）技術(shù)與常規(guī)熒光分析的主要區(qū)別是能獲得激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)變化時(shí)的熒光強(qiáng)度信息。 三維熒光光譜有兩種表示形式：等（強(qiáng)度）高線圖和等角三維投影圖。 三維光譜技術(shù)能獲得完整的光譜信息，是一種很有價(jià)值的光譜指紋光譜指紋技術(shù)?？稍谑涂辈芍杏糜谟蜌怙@示和礦源判定；在環(huán)境檢測(cè)和法庭判證中用于類似可疑物的鑒別；臨床醫(yī)學(xué)中用于癌細(xì)胞的輔助診斷和不同細(xì)菌的表征和鑒別；另外，作為一種快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)化學(xué)反應(yīng)的多組分動(dòng)力學(xué)研究具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。 3.6 熒光分析的用途熒光分析的用途 分子熒光分析，是測(cè)量試樣溶液在光源輻射激發(fā)下產(chǎn)

45、生的熒光光譜及熒光強(qiáng)度，從而鑒別待測(cè)物質(zhì)和測(cè)定其含量的一種分子光譜分析方法，它實(shí)際上是一種利用光能激發(fā)的分子發(fā)射光譜分析。它在實(shí)際應(yīng)用中主要用于微量物質(zhì)的定量分析。 v熒光法作為一種高靈敏度的分析手段，被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域?？捎脽晒夥y(cè)定的元素達(dá)70多種，可用熒光法測(cè)定的有機(jī)化合物為數(shù)更多，至少在數(shù)百種以上。1. 無機(jī)化合物的熒光分析無機(jī)化合物的熒光分析 能發(fā)生分子熒光的無機(jī)物很少，因此一些無機(jī)元素需與某些有機(jī)試劑生成熒光絡(luò)合物后進(jìn)行間接測(cè)定。 較常采用熒光法測(cè)定的元素有Be、Al、B、Ga、Se、Mg及某些稀土元素?？蓽y(cè)量約60多種元素，測(cè)定的方法可以分為以下四種：（1）熒光熄滅法）熒光熄

46、滅法 一些元素可用熒光熄滅法進(jìn)行測(cè)定，這些元素的離子從發(fā)生熒光的其它金屬-有機(jī)試劑絡(luò)合物中奪取該有機(jī)試劑或金屬離子以組成更穩(wěn)定的絡(luò)合物或難溶化合物，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低，由熒光強(qiáng)度降低的程度來測(cè)定該元素的含量。 用該法測(cè)定的元素有：F、Cl、S、Fe、Ag、Co和Ni等。（2）催化熒光法）催化熒光法 某些熒光反應(yīng)進(jìn)行非常緩慢，熒光微弱，難于測(cè)定，但若有微量金屬離子存在，可起催化作用，反應(yīng)將大大加速，可由在給定時(shí)間內(nèi)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度來定量該起催化作用的金屬離子，稱為催化熒光法。 用該法測(cè)定的元素有Cu、Be、Fe、Co、Os及H2O2等，該方法靈敏度特高，有的可達(dá)0.1ngg-1。（3）低溫?zé)?/p>

47、光法）低溫?zé)晒夥?測(cè)定的元素有Cr、Nb、U、Te等（-196C液氮溫度下）。（4）固體熒光法）固體熒光法 測(cè)定的元素有U、Ce、Sm、Eu、Tb等稀土元素及Sb、V等。 例如：例如：測(cè)定楊梅黃素中痕量鍺鍺的新方法。鍺與楊梅黃素在磷酸介質(zhì)中形成配合物，此配合物在乙醇溶液中具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，Ex=446nm，Em=506nm。2. 有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物的熒光分析 在有機(jī)化合物中，脂肪族化合物的分子結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族化合物因有共軛的不飽和體系，容易吸收光能，其中結(jié)構(gòu)龐大而復(fù)雜的化合物，在光照射下大多能產(chǎn)生熒光。并且采用某些有機(jī)試劑與弱熒光的芳香族化合物作用，可得到很強(qiáng)的熒光物質(zhì)。 因此對(duì)于胺類、甾體內(nèi)、抗菌素、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)和酶等許多具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)都可進(jìn)行分子熒光分析。 尤其適于生物體組分的分析。由于分子熒光法具有很高的靈敏