非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法

1、非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法概述 控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物標準時，應(yīng)按規(guī)定進行檢驗，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法， 但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。 概述微生物限度檢查法中的控制菌檢查在藥典一、二、三部附錄中內(nèi)容基本一致參照ICH協(xié)調(diào)案”非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查”進行修訂。主要修訂內(nèi)容控制菌檢查項目、培養(yǎng)基體系、 培養(yǎng)基適用性檢查、 檢查方法適用性試驗、結(jié)果判斷等。 供試液制備及實驗環(huán)境要求 -同非無菌產(chǎn)品微

2、生物檢查：微生物計數(shù)法。 -如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。 -中和劑或滅活劑的使用 使用了中和劑或滅活劑應(yīng)確認有效性及對微生物的無毒 性并應(yīng)確認供試液與所使用的中和劑或滅活劑的相容性。 控制菌檢查法 增修訂內(nèi)容 收載方式 檢驗項目 替代法的應(yīng)用原則 結(jié)果判斷方式 修訂前微生物限度檢查 修訂后 非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法非無菌藥品微生物限度標準 收載方式 修訂前 大腸桿菌、 大腸菌群、 沙門菌、 銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌 梭菌、 白色念珠菌 修訂后 大腸桿菌、 耐膽鹽革蘭陰性菌、 沙門菌、 銅綠假單胞菌 金黃色葡萄球菌、 梭菌、 白色

3、念珠菌 檢驗項目 替代法的應(yīng)用原則 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。 修訂前 增菌、分離(純化)、生化試驗適宜的鑒定試驗。修訂后 增菌、分離(純化)、生化試驗其它適宜方法進一步鑒定。 收載方式及結(jié)果判斷方式 修訂內(nèi)容控制菌檢查用培養(yǎng)基數(shù)量減少7個；在增菌過程，使用無選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)理由 污染菌受到環(huán)境、加工過程及儲存等影響，受到損傷，使用無選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，使受損傷的細菌得到修復(fù)，提高檢出率。 培養(yǎng)基適用性試驗培養(yǎng)基是絕大多數(shù)微生物試驗的基礎(chǔ)其質(zhì)量是微生物試驗成功關(guān)鍵因素。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供

4、優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。 培養(yǎng)基適用性試驗 培養(yǎng)基的配制 可按處方制備也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的商品化成品培養(yǎng)基，脫水培養(yǎng)基除附有處方和使用說明外還應(yīng)注明有效期、貯存條件、適用性試驗的質(zhì)控菌株和用途。配制時應(yīng)按使用說明上的要求操作，受潮結(jié)塊不能使用，確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求。 培養(yǎng)基適用性試驗再驗證如果其中有任一控制點發(fā)生變化,應(yīng)重新進行培養(yǎng)基適用性檢查。當檢驗結(jié)果出現(xiàn)異?；?qū)嶒炇屹|(zhì)量控制需要，也可通過培養(yǎng)基適用性檢查提供一定依據(jù)。 培養(yǎng)基適用性檢查試驗固體培養(yǎng)基或原料變質(zhì)不應(yīng)使用；配制培養(yǎng)基儲存過程中發(fā)現(xiàn) 渾濁、變色、有菌生長、嚴重脫水等變化不應(yīng)再使用。不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過培養(yǎng)基適

5、用性試驗確定。除特殊規(guī)定外，培養(yǎng)基配制采用蒸餾水或純化水，但應(yīng)進行檢測控制，如蒸餾水pH值應(yīng)為57。盡量臨用現(xiàn)配。 培養(yǎng)基適用性檢查配制培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基滅菌后，不得在高壓鍋內(nèi)過夜；固體培養(yǎng)基滅菌或融化后，放置不得超過8h；培養(yǎng)基于225 保存，但不應(yīng)超過21 d；固體瓊脂培養(yǎng)基 熔化再使用應(yīng)不超過1次。 培養(yǎng)基適用性檢查 菌種來源 國內(nèi)外認可的菌種保藏中心。試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心 獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性 金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26 003銅綠假單胞菌 CMCC（B）10 104大腸埃希菌 CMC

6、C（B）44 102乙型副傷寒沙門菌 CMCC（B）50 094白色念珠菌 CMCC（F）98 001生孢梭菌 CMCC（B）64 941 菌種及菌液制備菌液制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌胰酪大豆胨肉湯或在胰酪大豆胨瓊脂3035，1824h白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯2025， 23天生孢梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基3035，置厭氧條件下培養(yǎng)2448小時 菌懸液的制備稀釋劑 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。菌懸液的貯存若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在28

7、，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。 菌液制備 陰性對照試驗確認試驗條件是否符合要求。稀釋劑代替供試品進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。供試品檢查時也需進行陰性對照試驗。如果陰性對照有菌生長，應(yīng) 進行偏差調(diào)查。 培養(yǎng)基適用性檢查成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查。促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。菌株見表 培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查 培養(yǎng)基 特性 試驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌 腸道菌增菌肉湯 促生長能力 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂 促生長能力+指示特性 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌大腸埃希菌 麥康凱肉湯 促生長能力 大腸

8、埃希菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 麥康凱瓊脂 促生長能力+指示 大腸埃希菌大腸埃希菌 麥康凱肉湯 促生長能力 大腸埃希菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 麥康凱瓊脂 促生長能力+指示 大腸埃希菌 培養(yǎng)基適用性檢查 沙門菌 RV沙門菌增菌肉湯 促生長能力 乙型副傷寒沙門菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂 促生長能力 乙型副傷寒沙門菌 +指示特性 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 指示能力 乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂促生長能力 銅綠假單胞菌 抑制能力 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂 促生長能力 金黃色葡萄球菌 +指示特性 抑制能力 大腸埃希菌梭菌 梭菌增菌培養(yǎng)基 促

9、生長能 生孢梭菌 哥倫比亞瓊脂 促生長能力 生孢梭菌白色念珠菌 沙氏葡萄糖肉湯 促生長能力 白色念珠菌 +指示特性 沙氏葡萄糖瓊脂 促生長能力白 色念珠菌 念珠菌顯色培養(yǎng)基 促生長能力 白色念珠菌 +指示能力 抑制能力 大腸埃希菌 培養(yǎng)基適用性檢查 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 接種不大于100cfu的試驗菌在不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力 接種取菌懸液0.1ml），涂布于培養(yǎng)基平板上，在規(guī)定的溫度及時間下培養(yǎng) 。 不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形 態(tài)特征應(yīng)一致。 培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基

10、抑制能力檢查接種不少于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基。不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。 試驗菌應(yīng)不得生長。 培養(yǎng)基指示特性檢查取試驗菌懸液各0.1ml涂布于培養(yǎng)基平板上在不長于規(guī)定的最短時間下培養(yǎng)， 被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。 修訂前 大腸菌群的驗證，采取大腸埃希菌為驗證菌株。 修訂后耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法，采取大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。 方法適用性試驗試驗菌 修訂前驗證方法取規(guī)定量供試液及10 100cfu試驗菌接入增菌培養(yǎng)基中依相應(yīng)的控制菌檢查方法進行檢查。當采用薄膜過濾時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖

11、洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出接入增菌培養(yǎng)基中. 修訂后適用性試驗按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾 ,注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征 方法適用性試驗 修訂前 若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋 法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供

12、試品的控制菌檢查同時進行。修訂后 若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性。如確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。 方法適用性試驗結(jié)果判斷 供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進行。陽性對照試驗試驗方法 同供試品的控制菌，加菌量應(yīng)不大于100cfu。應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 供試品檢查耐膽鹽革蘭陰性菌耐膽鹽革蘭陰性菌取代2010年版大腸菌群檢查大腸菌群的定義是指在37生長時能發(fā)酵乳糖，24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧

13、的無芽孢桿菌。符合上述定義的菌除埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查檢驗程序 供試液制備 同“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法制成1：10供試液，混勻。預(yù)培養(yǎng) 在2025培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般2小時,使供試品中的細菌充分恢復(fù)但不增殖。未檢出試驗取相當于1g或1mL供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至 腸道菌增菌肉湯中。3035，培養(yǎng)2448小時。劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，置 3035，培養(yǎng)1824小時。平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查定量試驗1、取定量供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌 增菌肉湯中。303

14、5，培養(yǎng)2448小時。2、上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄 糖瓊脂平板上。3035，培養(yǎng)1824小時。若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查對1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。 表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)各供試品量的檢查結(jié)果每1g（或1ml）供試品中可能的菌數(shù)（N）0.1g/ml0.01g/ml0.001g/mlN103102N10310N102N10 供試品檢查大腸埃希菌大腸埃希菌是腸桿菌科埃希菌屬的代表種。大腸埃希菌是兩端鈍圓的短小直桿菌，（1.11.5）m(2.0 6.0)m單個或成對，革蘭陰

15、性無芽孢，多有鞭毛培養(yǎng)最適溫度為37可在15-46生長，兼性厭氧。 修訂前取1:10供試液至膽鹽乳糖增菌（大腸、金葡）18-24hMUG培養(yǎng)基（大腸）5h、24h MaC瓊脂（大腸 、指示） 18-24h 修訂后取1:10供試液至TSB（大腸、 金葡、）18-24hMaC肉湯 （大腸、 金葡）42-44 24-48h MaC 瓊脂 （大腸 ）18-72h 方法適用性試驗 大腸埃希菌檢查檢驗程序 取供試品，照附錄“微生物計數(shù)法”制成1：10供試液。取相當于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積 的胰酪大豆胨肉湯中。 3035培養(yǎng)1824小時。 取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱肉湯中

16、。 4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平 板上。3035培養(yǎng)1872小時。結(jié)果判斷 -若麥康凱瓊脂平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試 驗, 確證是否為大腸埃希菌；-若麥康凱瓊脂平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié) 果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。 供試品檢查 沙門菌 沙門菌為革蘭陰性桿菌，無芽孢，菌體 通常（0.40.9）m(13) m，兩 端鈍圓。需氧或兼性厭氧，1042皆可 生長，最適溫度37。 檢驗程序 修訂前 營養(yǎng)肉湯供試液（18-24h )TTB (沙門、金葡） 18-24hSS / MaC 瓊脂（沙門、金-）18-48h RV

17、氯化鎂孔雀綠沙門菌增菌肉湯XLD 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂SS： 沙門、志賀菌屬瓊脂XLD 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂修訂后 TSB 供試液（ 18-24h ）RV肉湯（沙門、金葡）18-24hXLD瓊脂（沙門、 指示）18-48h 沙門菌檢查 沙門菌檢查沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上生長良好，菌落為 紅色、中心有或無黑色。 鑒定試驗 挑選疑似菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層 斜面上培養(yǎng)1824小時，或采用其它適宜方法進一步鑒定。結(jié)果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 斜面為紅色、底層為黃色 或斜面黃色、底層有黑色應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗, 確證是否

18、為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長, 或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面未見紅色、底層未見黃色 或斜面黃色、 底層無黑色 判供試品未檢出沙門菌。 銅綠假單胞菌形態(tài)特征銅綠假單胞菌為革蘭陰性、直或微彎曲的桿菌，其菌體的長短不一，短的為球桿狀，長為絲狀，大小（0.51.0）m(1.53.0)m。除在硝酸鹽培養(yǎng)基中以外都是專性好氧。最適生長溫度為35，在42能生長，4不生長。 檢驗程序 修訂前 取1:10供試液至BL 18-24h 溴化十六烷基三甲銨瓊脂18-24h綠膿菌素測定用培養(yǎng)基24h修訂后 取1:10供試液至TSB （18-24h ) 溴化十六烷基三甲銨瓊脂18-72h 銅綠假

19、單胞菌檢查 銅綠假單胞菌檢查檢驗程序 供試液制備 取供試品，照附錄“微生物計數(shù)法” 制成1：10 供試液。取相當于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積的胰酪 大豆胨肉湯中3035培養(yǎng)1824小時。 接種 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平 板上。3035培養(yǎng)1872小時。 鑒定試驗 取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其它適宜方法進一步鑒定。確證試驗 平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。 金黃色葡萄球菌形態(tài)特征金黃色葡萄球菌屬于微球菌科葡萄球菌屬。菌體呈球形或略呈橢圓形，菌體較小，直徑0.5-1.5m，平

20、均直徑金黃色葡萄球菌對生長的營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度為37，最適生長pH為7.4。 修訂前 1:10供試液至營養(yǎng)肉湯或亞碲酸鹽肉湯 18-24h ，48h甘露醇氯化鈉瓊脂24-72h抑制能力：大腸埃希菌接種量不大于103 ，接種量過大，大腸埃希菌可生長修訂后甘露醇氯化鈉瓊脂18-72h 抑制能力：大腸埃希菌接種量不大于103 ，接種量過大，大腸埃希菌可生長。 金黃色葡萄球菌檢查 金黃色葡萄球菌檢查檢驗程序 取供試品，照附錄“微生物計數(shù)法”制成1：10供試液。相當于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨肉湯中，混勻。3035培養(yǎng)1824小時。修訂前 為亞碲酸鈉（鉀）肉湯或營養(yǎng)肉湯選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上。3035培養(yǎng)1872小時。 金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果判斷若甘露醇氯化鈉瓊脂平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗, 確證。若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或 疑似的菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 梭菌為一大群厭氧或微需氧的粗長芽孢桿菌