免疫學(xué)質(zhì)量控制流程

1、v1.0可編輯可修改免疫學(xué)質(zhì)量控制流程【目的】保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可*,充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點?！驹揝OP變動程序】本標(biāo)準(zhǔn)操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：專業(yè)主管、科主任。【方法】【分析前質(zhì)控】1.人員培訓(xùn)實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識：1檢驗項目的基本原理（ELISA原理）；2臨床意義；3熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點；4熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；5熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。6某些特殊項目的檢測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培

2、訓(xùn)班，考試合格后持證上崗?！驹噭┖羞x擇】衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼 有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品?！驹噭┖性u價】試劑評價需要有權(quán)威的血清考核盤（Panel）進(jìn)行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般實驗室不易開展，可以通過以下信息，了解試劑質(zhì)量。1 .根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計劃選擇 靈敏度高的或特異性高的試劑；2 .通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學(xué)合成），片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；3 .參考室間質(zhì)評報告中對試劑的評價結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績。4 .根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布

3、的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣?！緝x器質(zhì)控】為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP ,所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。1 .移液器：ELISA力口樣量?。?-100 ul）,其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在土10%A內(nèi)；2 .水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有土 1C的誤差；3 .洗板機(jī)：每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ,人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；4 .酶標(biāo)儀：

4、經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到，準(zhǔn)確性為土1%重復(fù)性達(dá)酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在,新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為,而其線性范圍僅這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)予注意?！久笜?biāo)儀校正程序】1 .濾光片波長精度檢查：將不同波長的

5、濾光片從酶標(biāo)儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計（波長精度土）于可見光區(qū)對每個濾光片進(jìn)行掃描，其檢測值與標(biāo)定值之差為濾光片波長精度。一般酶標(biāo)儀無 585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm）。2 .通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標(biāo)板小孔杯（杯底須光滑，透明，無污染以酶標(biāo)板架作載體， 將其（內(nèi)含200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至左右）置于8個通道的相應(yīng)位置，蒸溜水調(diào)零，于490nm處連續(xù)測三次，觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)果的一致性，可用極差值來表示。孔間差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標(biāo)2板條（8條共96

6、孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調(diào)至左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零 ，于490nm處檢測，其誤差大小用土衡量。3 .零點飄移（穩(wěn)定性觀察）：取 8只小孔杯分別置于 8個通道的相應(yīng)位置，均加入 200ul蒸儲水并調(diào)零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個通道4小時內(nèi)吸光度的變化。4 .精密度評價：每個通道3只小杯分別加入 200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解，蒸儲水調(diào)零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續(xù)測定20天。分別計算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度，日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV值。5 .線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于

7、490nm平行測8次,取其均值。計算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計誤差 s,并用土表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液 （測定波長為490nm, 校正波長為585nm）,先后于8個通道檢測，每個通道測 3次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計 學(xué)差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。【標(biāo)本的采集和保存】1 .標(biāo)本采集時應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀 方法的結(jié)果，以 HRP%;標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本會增加非特異性顯色造成假陽性。2 .長菌的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽，f因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP&會產(chǎn)生假

8、陽性反應(yīng)。3 .抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是 不使用用肝素抗凝劑。4 .標(biāo)本在冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4c冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要-20C冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，如需保存作多次檢測， 宜少量分裝冰存。5. ELISA的靈敏度1ng/ml水平上，標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標(biāo)本?！痉治鲋匈|(zhì)控】ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步

9、驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點。因此，應(yīng)建立實驗項目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。1 .加樣1加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部， 不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。2每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交*污染；干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。3樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特 別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。4如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2 .溫育1抗

10、原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（37。C）,經(jīng)過一定的時間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡 占 八、2 2 ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡 的水浴法。水要浸至板條的1/3處。3反應(yīng)板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不 宜多于兩塊板同時測定。3 .洗滌1手工洗滌一般采用浸泡方法： 1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；2）用洗滌液過洗一遍（即注 滿孔后即甩去）；3）微孔重新注滿洗液后浸泡 2-3分鐘，間歇搖動；4）甩去孔內(nèi)液體，拍 板，用紙吸干。重復(fù)以上操作至少 5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。2洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個放

11、液和吸液纖孔都能一致 地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干， 同時要設(shè)置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時應(yīng)再用手工洗 2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。4 .顯色1 HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時間和溫度，2 一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37。C, 10-15分鐘）恒定反應(yīng)后終止3或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)左右使的時間而恒定反應(yīng)時間5 .酶標(biāo)儀判讀結(jié)果1 .顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）。2 .常見的顯色系統(tǒng)有 OPD TMBT種，以后者最為常見，而 TMEm不易終止因此必須 盡快比色以免影響結(jié)果。 OP璐止后顯棕色，測定波長為 490

12、nm； TM啜止后顯黃色，測定 波長為450nm,二種底物的校正波長均用 630nmo3 .使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應(yīng)板應(yīng)用 紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片?！痉治龊筚|(zhì)控】【報告方式】1 .定性試驗：國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/COV方式報告，S為標(biāo)本A值，COV即Cut Off 值（或 COV1夾心法和間接法以 S/COVM 為陽性；競爭法與中和法以 S/COV 1為陽性2 2 COV的計算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有：A COV=N （當(dāng)N不足時按計），此公式由P/N>換算而來，常用于夾心法。B） COV=

13、N,從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。Q COV=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。D） COV=C< P+N（ C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽 性對照測定值要基本恒定。2.定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。1用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對量或單位表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測標(biāo)本做在同一塊板上。2現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確 的結(jié)果實屬不易?！居涗洝?所有實驗的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊；原始登記表應(yīng)記 錄試劑來源、批號；質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控

14、；簽上實驗者姓名及審核者姓名。2如試驗結(jié)果對臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留，至少與病歷保存期一致【定性試驗】ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所設(shè)的陰陽性對照作為內(nèi)對照指示反應(yīng)；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對照，與標(biāo)本同時檢測，臨界值 S/>1,高值質(zhì)控血清 S/>10,正常人血清A值在之間。陽性質(zhì)控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為"HOOK效應(yīng)監(jiān)控）應(yīng)重做陰性標(biāo)本；陰性對照失控應(yīng)重做陽性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結(jié)果，作為QC資料存檔。 【定量試驗】ELISA定量試驗常見于腫瘤因子（如AFP, CEA CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量（正常范圍），超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。