細(xì)菌的各種計(jì)數(shù)法

1、1、計(jì)數(shù)器測(cè)定法：即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（O.1mm3）,因而根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。本法簡(jiǎn)便易行，可立即得出結(jié)果。本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌抱子計(jì)數(shù)。2、電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法：電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí)，電阻明顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。3、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法，是根

2、據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：一般選取菌落數(shù)在30300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，過(guò)多或過(guò)少均不準(zhǔn)確；為了防止菌落蔓延，影響計(jì)數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮吵（TTC）;本法限用于形成菌落的微生物。廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn)，是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。4、比濁法比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍

3、內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液，用光密度（OD值）表示樣品菌液濃度。此法簡(jiǎn)便快捷，但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液，得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目，對(duì)顏色太深的樣品，不能用此法測(cè)定。5、測(cè)定細(xì)胞重量法此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重。此法適于菌體濃度較高的樣品，是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。6、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量氮、碳是細(xì)胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。7、顏色改變單位法（colourch

4、angeunit,簡(jiǎn)稱CCU）這種方法通常用于很小，用一般的比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微生物，比如支原體等，因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色，因此無(wú)法用比濁法來(lái)計(jì)數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用cfu法也不容易計(jì)數(shù)，因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法，即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的，下面以解月尿月尿原體為例，簡(jiǎn)單介紹其操作：（1） .取12只無(wú)菌試管，每一管裝1.8ml解月尿月尿原體培養(yǎng)基。（2） .在第一管加入0.2ml待測(cè)解月尿月尿原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到最末一管（3） .于37度培養(yǎng)

5、，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現(xiàn)顏色改變，他的相對(duì)濃度就是10的6次方CCU/ml.一般來(lái)說(shuō)，比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)，但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法很多，各種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，也不是在任何情況下都適用。在微生物學(xué)工作中一般常用的是平皿菌落計(jì)數(shù)法、計(jì)數(shù)器法和比濁法。至于哪種方法比較適合你，得根據(jù)你的具體條件而定。采用濾膜法進(jìn)行微生物檢測(cè)是一種國(guó)際公認(rèn)的微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，其得到AOAC、美國(guó)、歐洲和日本等國(guó)家的藥典、FDA和EPA等組織的承認(rèn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品及

6、飲料工業(yè)、化妝品、制藥工業(yè)品質(zhì)控制和電子工業(yè)等領(lǐng)域。而在我國(guó)每一新版藥典中無(wú)菌檢查法（微生物限度檢查）在都有不同程度的改進(jìn)和提高，特別是2000年版藥典較95版藥典有了較大提高，大幅度增加了樣品的取樣量，提高了陽(yáng)性檢出率。2005年版藥典更加完善，既增加了樣品的取樣量，又延長(zhǎng)了培養(yǎng)時(shí)間，降低了漏檢率，提高了安全性，和各國(guó)藥典接近，與國(guó)際接軌，提高了我國(guó)的藥典標(biāo)準(zhǔn)。2005版中國(guó)藥典規(guī)定只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。賽多利斯公司的濾膜法微生物檢測(cè)產(chǎn)品成功地應(yīng)用于濾膜法已有20多年的歷史，實(shí)用而且方便實(shí)用，它簡(jiǎn)化了微生物檢測(cè)程序。濾膜法微生物檢測(cè)：將適當(dāng)孔徑的濾膜放入濾器，過(guò)濾樣品，由于濾

7、膜的作用而將微生物保留在膜的表面上。樣品中微生物生長(zhǎng)抑制劑可在過(guò)濾后用無(wú)菌水沖洗濾器而除去。然后，將濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)物和代謝物通過(guò)濾膜的微孔進(jìn)行交換，在濾膜表面上培養(yǎng)出的菌落可以計(jì)數(shù)，并和樣品量相關(guān)。濾膜法的優(yōu)點(diǎn)：- 與直接法比較，可以檢測(cè)大量的樣品- 濃縮效應(yīng)使微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確度提高- 帶有菌落的濾膜，可作為檢測(cè)的永久記錄存檔- 可見(jiàn)的菌落和樣品量直接對(duì)應(yīng)，得出定量結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)countingofbacteria指測(cè)計(jì)酵母、細(xì)菌等的細(xì)胞數(shù)。有總菌計(jì)數(shù)和活菌計(jì)數(shù)兩種計(jì)數(shù)法。后者是測(cè)計(jì)試樣中的活細(xì)菌數(shù)。二者都是先把試樣稀釋成適于測(cè)計(jì)的濃度，再用種種方法進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的測(cè)計(jì)。一般認(rèn)為用細(xì)胞計(jì)

8、數(shù)器測(cè)計(jì)更為精確。有的方法是把細(xì)胞用血球容量計(jì)進(jìn)行離心沉淀，從其刻度的容積進(jìn)行換算；還有一種方法是比濁法。在測(cè)計(jì)固氮細(xì)菌時(shí)，可用凱氏定氮法測(cè)定有機(jī)氮（或是蛋白態(tài)氮），然后換算成細(xì)菌數(shù)。進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)時(shí)，先把樣品稀釋，然后將一定量稀釋樣品混入依菌性質(zhì)制成的溶融狀態(tài)的瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行平面培養(yǎng)，再根據(jù)菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)已鑒別過(guò)的菌種或具有某種特定性質(zhì)的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，活菌計(jì)數(shù)比較簡(jiǎn)單，但對(duì)土壤微生物區(qū)系量的分析就比較復(fù)雜了。在微生物學(xué)研究中，經(jīng)常需要測(cè)定培養(yǎng)溶液中細(xì)菌數(shù)量，比色法和比濁法是常用的方法，細(xì)菌培養(yǎng)液中含有活的和死的細(xì)菌、未利用完的培養(yǎng)基以及細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物等，因此,培養(yǎng)液的吸光度值并不完

9、全是細(xì)菌（活細(xì)菌、死細(xì)菌）數(shù)量的真實(shí)體現(xiàn)。作者比較了2種方法（細(xì)菌培養(yǎng)原液、培養(yǎng)液離心后沉淀+無(wú)菌水）測(cè)定培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)的差異和對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果的影響，以期為液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌數(shù)的快速測(cè)定提供參考。1材料與方法1.1 試驗(yàn)用菌株由患爛爪病的中華鱉血液中分離所得，并經(jīng)檢驗(yàn)為氣單胞菌屬嗜水產(chǎn)氣單胞菌種。1.2 細(xì)菌培養(yǎng)選用不同pH值的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。在預(yù)先標(biāo)號(hào)的試管中分別加入不同pH值（pH值設(shè)定為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0共13組）的培養(yǎng)基5mL,121.5C滅菌30min，然后在每支試管中加入經(jīng)24

10、h復(fù)壯培養(yǎng)的均勻菌懸液100dL,30C、140r/min振蕩培養(yǎng)24h,待測(cè)；連續(xù)培養(yǎng)，定期采樣。使用500mL錐形瓶，普通肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法同，培養(yǎng)過(guò)程中間隔1h連續(xù)采樣。1.3細(xì)菌濃度與吸光值的相關(guān)性計(jì)算活細(xì)菌數(shù)測(cè)定采用稀釋平板法，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。對(duì)細(xì)菌懸液吸光值的測(cè)定采取3種方法進(jìn)行：以原培養(yǎng)基作對(duì)照，在420nm處直接測(cè)定細(xì)菌懸液吸光值（記ODa）;將培養(yǎng)后的細(xì)菌懸液離心（3000r/min、30min），取沉淀加入與上清液等量的無(wú)菌生理鹽水，混勻后，以無(wú)菌鹽水作對(duì)照，測(cè)定溶液吸光值（記ODb）;以原培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定離心后上清液的吸光值（記ODc）。

11、參照Lambert2Beer定律logI0/I=kC（其中l(wèi)ogI0/I為吸光度、C為細(xì)菌濃度），計(jì)算活菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)與對(duì)應(yīng)溶液吸光值的關(guān)系，并求出常數(shù)k。2結(jié)果與分析1不同pH值條件下細(xì)菌懸液的吸光值測(cè)定不同pH條件下的細(xì)菌培養(yǎng)懸液吸光度與離心沉淀+無(wú)菌鹽水的吸光度值是兩條不同的曲線，離心上清液的吸光值也不是1條與橫坐標(biāo)重疊或平行的直線。說(shuō)明在培養(yǎng)基中除細(xì)菌影響吸光值大小外，不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)吸光值的影響也不盡相同。2連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌懸液吸光值的變化細(xì)菌在連續(xù)培養(yǎng)21h過(guò)程中，間隔1h連續(xù)測(cè)得細(xì)菌培養(yǎng)原液、培養(yǎng)液離心上清液及培養(yǎng)液沉淀+等量無(wú)菌水在420nm處的吸光值。2種菌懸液（

12、培養(yǎng)液，離心沉淀+無(wú)菌鹽水）的吸光值變化趨勢(shì)一致，但在數(shù)量上存在一定差異。在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中不斷有培養(yǎng)液組份消耗和細(xì)菌代謝產(chǎn)物增加，同時(shí)死亡細(xì)菌的消融產(chǎn)物也會(huì)對(duì)離心上清液的吸光值產(chǎn)生影響。因此，顯示出上清液隨時(shí)間延長(zhǎng)吸光值不斷增加。試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，上清液顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)變化明顯，由棕黃色逐步變?yōu)闇\黃色。3細(xì)菌濃度與吸光值的關(guān)系連續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌5h后，在420nm處測(cè)定2種菌懸液（培養(yǎng)原液，培養(yǎng)液離心后經(jīng)無(wú)菌鹽水定容）的吸光值分別為0.519和0.368。經(jīng)1/10梯度稀釋后采用平板法計(jì)數(shù)，培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)為5.082M023個(gè)/mL,根據(jù)Lambert2Beer定律,2種方法測(cè)得的活細(xì)菌數(shù)與吸光度的關(guān)系分別為logI0/I=1.02110->24C,logI0/I=7.24110-25C-。顯微計(jì)數(shù)培養(yǎng)液中細(xì)菌總數(shù)為5.285>1024，是其中活菌數(shù)的10.4倍,證明在細(xì)菌培養(yǎng)液中存在大量已經(jīng)死亡的細(xì)菌。3討論在比濁法測(cè)定細(xì)菌濃度時(shí)，有的方法采用未接種的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照1,3，但是，在細(xì)菌的生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基質(zhì)與原培養(yǎng)基并不完全一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：不同細(xì)菌濃度培養(yǎng)物經(jīng)離心沉淀后，上清液的吸光度并不完全相等，即使使用原培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，也不能完全消除不同培養(yǎng)時(shí)期或不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基對(duì)吸光度的影響。死細(xì)菌對(duì)液體環(huán)