組織培養(yǎng)技術(shù)

1、第五章組織培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)植物組織培養(yǎng)所謂植物組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng),指從植物體別離出符合需要的組織.器官或細(xì)胞,原生質(zhì)體等,通過(guò)無(wú)菌操作,在人工限制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù).狹義上是指用植物各局部組織,如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株,也包括在培養(yǎng)過(guò)程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng),愈傷組織再經(jīng)過(guò)再分化形成再生植株.一、概述一概念1 .植物組織培養(yǎng)：是指通過(guò)無(wú)菌操作,把植物的外植體接種于人工配置的培養(yǎng)基上,在人工限制的條件下進(jìn)行培養(yǎng),使其成為完整植株的方法.2 .外植體：是指用于植物組織培養(yǎng)的接種材料,它包括植物體的各個(gè)器官

2、、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等.3 .愈傷組織Callus:原指植物在受傷之后于傷口外表形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞,在組培中那么指人工培養(yǎng)基上由外植體長(zhǎng)出來(lái)的一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞.二組織培養(yǎng)類(lèi)型1 .根據(jù)接種的外植體不同分：胚胎培養(yǎng)；器官培養(yǎng)；3組織培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)；2 .根據(jù)培養(yǎng)基態(tài)相不同分：固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；3.根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程不同分：初代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)；三植物組織培養(yǎng)歷史植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初開(kāi)始,以植物生理學(xué)為根底開(kāi)展起來(lái)的.有以下過(guò)程：思想準(zhǔn)備階段；理論奠基階段；技術(shù)建立階段；形態(tài)發(fā)生階段；應(yīng)用研究階段；1902年彳惠國(guó)植物學(xué)家Haberlandt提出了細(xì)胞全能性概念.1939年Wh

3、ite報(bào)道了煙草組培成功.并提出植物細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō).同年,Gautheret與Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜成功.三人被譽(yù)為植物組培奠基人.羅士韋是我國(guó)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)研究的開(kāi)拓者和奠基人之一四植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1,植物的快速繁殖：園藝、花卉植物的大規(guī)模快速繁殖；搶救瀕危珍稀植物進(jìn)行某些植物的種質(zhì)資源保存2 .培育無(wú)病毒的植物,如脫病毒草莓等；3 .制造人工種子.4突變體的篩選培育5藥用植物的工廠化生產(chǎn)6花藥培養(yǎng)和花粉單倍體育種7基因工程的應(yīng)用等二、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和設(shè)備一實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)一般具有：1 .準(zhǔn)備室器皿洗滌,培養(yǎng)基配制、分裝、高壓滅菌,植物材料的預(yù)處理,重蒸儲(chǔ)水的制備以及進(jìn)行生理、生化因素的分

4、析等各種操作都要在此室中進(jìn)行2 .緩沖室進(jìn)入無(wú)菌室前需在緩沖室里換上經(jīng)過(guò)滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋,戴上口罩.最好安裝1盞紫外燈,用以滅菌.3 .無(wú)菌操作室也稱(chēng)接種室.主要有超凈工作臺(tái)、空調(diào)機(jī)、醫(yī)用小平車(chē)等4 .培養(yǎng)室具備適宜的溫度、濕度、光照、通風(fēng)等條件.有培養(yǎng)架子和燈光;通風(fēng)設(shè)施；邊臺(tái)；5 .馴化室和溫室二常用設(shè)備1 .超凈工作臺(tái)2 .無(wú)菌箱3 .空調(diào)機(jī)4 .除濕機(jī)5 .恒溫箱又稱(chēng)培養(yǎng)箱6 .烘箱7 .高壓滅菌器8 .冰箱9 .天平10 .顯微鏡11 .搖床或轉(zhuǎn)床12 .酸度計(jì)等三器皿用具1、培養(yǎng)器皿器皿按材料分：有玻璃器皿與塑料器皿兩種；按其形狀分：主要有試管、三角瓶、圓形培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿L型管和

5、T型管等2、分注器3、離心管4、移液管5、細(xì)菌過(guò)濾器6、器械用具：鑲子、剪刀、接種工具、大解剖刀等7、實(shí)驗(yàn)器皿三、培養(yǎng)基及其配制一培養(yǎng)基的種類(lèi)：1 .根據(jù)態(tài)相不同分為：固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基2 .根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程分為：初代培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基.3 .作用不同分為：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基.4 .根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平不同分為：根本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基.根本培養(yǎng)基主要有MSWhite>B5N6改進(jìn)MSHeller、Nitsh、Miller、SH等；完全培養(yǎng)基就是在基本培養(yǎng)基的根底上,根據(jù)試驗(yàn)的不同需要,附加一些物質(zhì).二培養(yǎng)基的成分主要包括：1、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)即無(wú)機(jī)鹽類(lèi)：分為大量元素和微量元素2、維生素類(lèi)

6、：B族維生素,如硫胺素維生素B1、叱哆醇維生素B6、煙酸維生素B3,又稱(chēng)維生素PP和泛酸鈣維生素B5、葉酸維生素Bc、抗壞血酸維生素C等3、氨基酸：有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺類(lèi)物質(zhì)如天門(mén)冬酰胺和多種氨基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等4、有機(jī)附加物：包括有些成分尚不清楚的天然提取物,5、糖類(lèi)和瓊脂：6、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：主要包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素.常用的生長(zhǎng)素有呷咪乙酸IAA、呷咪丁酸舊A、蔡乙酸NAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、呷咪丙酸IPA、蔡氧乙酸NOA.常用細(xì)胞分裂素有玉米素ZT、6-茱基腺喋吟6-BA、沖動(dòng)素KT等.7、活性碳三培養(yǎng)基配制1

7、.水和藥品的準(zhǔn)備：2 .器皿和用具的準(zhǔn)備：不同型號(hào)的燒杯、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基分裝器等3 .母液的配制和保存：經(jīng)常使用的培養(yǎng)基,可先將各種藥品配成濃縮一定倍數(shù)的母液,放入冰箱內(nèi)保存,用時(shí)再按比例稀釋.一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素、氨基酸等母液；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)也可分別配制成溶液,儲(chǔ)存于冰箱1配制M以量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液,使用時(shí)再分別稀釋100倍.分別稱(chēng)取NH4NO3165gKH2P0417gKNO3190gCaCl2-2H2O44gMgSO47H2O37/自配成1L的母液.倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中.2配制MS散量元

8、素母液一般將微量元素配制成100倍母液.依次稱(chēng)取KI0.083g、Na2MoO42H2O0.025gH3BO30.62gMnSO4H2O1.69gCuS045H2O0.0025gCoCl2-6H2O0.0025gZnSO47H2O0.86g配成1L母液,倒入1L試齊1J瓶中,存放于冰箱中.CuSO45H2O和CoCl2-6H2O由于稱(chēng)取量很小,如果天平精確度沒(méi)有到達(dá)萬(wàn)分之一,可先配成調(diào)整液,即先分別稱(chēng)取CuSO45H2O0.05g、CoCl26H2O0.05g、各自配成100mL的調(diào)整液,然后取5mL就還有0.0025g的量.3配制MST機(jī)母液一般配制成100倍MSa機(jī)母液.依次稱(chēng)取肌醇10g

9、、鹽酸硫胺素VB.0.01g、煙酸0.05g、甘氨酸0.2g、鹽酸叱哆醇VBR0.05g配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中.4配制MS鐵鹽母液一般配制成100倍MSK鹽母液.依次稱(chēng)取EDTAC2鈉3.73g、FeSO47H2O2.78g配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中.5激素母液的配制各種生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制,不能混合在一起,生長(zhǎng)素類(lèi)一般要先用少量95%勺酒精或1當(dāng)量的NaOHS解,細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解,然后再加蒸儲(chǔ)水定容.一般取100mg配成100mL#液.4.培養(yǎng)基的配制及其滅菌：應(yīng)當(dāng)注意的是,某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA、ZT、ABA等以及某些維

10、生素遇熱是不穩(wěn)定的,不能和其它培養(yǎng)基一起高壓消毒,而要進(jìn)行過(guò)濾消毒四常用培養(yǎng)基配方及特點(diǎn)1 .MS培養(yǎng)基：特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽的濃度高,具有高含量的氮、鉀,尤其硝酸鹽的用量很大,同時(shí)還含有一定數(shù)量的錢(qián)鹽,這使得它營(yíng)養(yǎng)豐富2 .White培養(yǎng)基：特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽濃度較低3 .N6培養(yǎng)基：特點(diǎn)是KNO曾口NH42SO4含量高且不含鋁.4 .B5培養(yǎng)基：特點(diǎn)是含有較低的錢(qián)鹽,較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素.四、植物組織培養(yǎng)根本操作和培養(yǎng)技術(shù)一玻璃器皿清洗二培養(yǎng)基配制三外植體的選擇和滅菌操作技術(shù)根本要點(diǎn)：一是要?jiǎng)?chuàng)造無(wú)菌的條件；二是要在無(wú)菌的適當(dāng)條件下培育植物材料,這就必須注意材料的選擇、培養(yǎng)基的組成、激素的應(yīng)用、培養(yǎng)方

11、法和培養(yǎng)條件等等.1,選擇優(yōu)良種質(zhì)、健壯的植株、選擇最適時(shí)期、選取適宜大小2.外植體的滅菌：外植體在接種前先要滅菌,在滅菌前,又先要進(jìn)行預(yù)處理.植物材料一般采取預(yù)處理是,先對(duì)植物組織進(jìn)行修整,去掉不需要局部,在流水中沖洗干凈.經(jīng)過(guò)預(yù)處理植物材料,其外表仍有很多細(xì)菌和真菌,因此還需進(jìn)一步滅菌.常用滅菌劑使用濃度及效果比擬表滅菌劑名稱(chēng)使用濃度消毒難易滅菌時(shí)間火菌效果酒精7075易0.13好氯化汞0.10.2較難210最好漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2活性氧易530很好過(guò)氧化氫1012最易515好抗菌素450mg/L中3060較好五無(wú)菌培養(yǎng)接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去

12、培養(yǎng)1,培養(yǎng)條件最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣等.光照普通要求每日光照12h16h,光強(qiáng)1000lx5000lx;溫度大多數(shù)植物最適溫度在23132七之間.一般所用的溫度是25七±2七.低于15口C或高于35°C,對(duì)生長(zhǎng)都是不利；濕度一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度,它的濕度條件?？杀ＷC100%二是培養(yǎng)室的濕度.要求室內(nèi)保持70%-80%勺相對(duì)濕度.X愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭,水分散失,以及積累一些組織代謝產(chǎn)物,因此必須將組織轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上.這種轉(zhuǎn)移過(guò)程稱(chēng)為繼代或稱(chēng)傳代.一般在25七28下進(jìn)行固體培養(yǎng)時(shí),每隔46周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng).六定期檢查和觀察在培養(yǎng)中

13、易出現(xiàn)以下現(xiàn)象：1,出現(xiàn)污染現(xiàn)象2 .外植體的褐化現(xiàn)象3 .培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象菌類(lèi)污染、褐化和玻璃化稱(chēng)為植物組織培養(yǎng)的3大難題1.污染的原因：從病源菌方面,主要有細(xì)菌及真菌兩大類(lèi)；從污染的途徑,主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的.2、污染的預(yù)防舉措：預(yù)防材料帶菌的舉措1用莖尖作外植體時(shí),可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2預(yù)防陰雨天在田間采取外植體3目前對(duì)材料內(nèi)部污染還沒(méi)有令人滿(mǎn)意的滅菌方法外植體的滅菌：1屢次滅菌法2多種藥液交替浸泡法器皿與金屬器械的滅菌；布質(zhì)制品的滅菌；無(wú)菌操作室的滅菌；操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格根據(jù)無(wú)菌操作的程序進(jìn)行.外植體的

14、褐變及其預(yù)防舉措1、原因：褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類(lèi)化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關(guān)系.2、影響褐變的因素隨著植物種類(lèi)、基因型、外植體的部位及生理狀況等的不同,褐變的程度也有所不同.3、褐變的預(yù)防舉措：選擇適宜的外植體；采用適宜的培養(yǎng)基和光溫條件；在培養(yǎng)基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑；縮短轉(zhuǎn)瓶周期；培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防舉措1、什么叫玻璃化現(xiàn)象與正常苗有顯著差異：其葉、嫩梢呈水晶透明或半透明,植株矮小月中脹,失綠,葉片皺縮成縱向卷曲,脆弱易碎；葉表皮缺少角質(zhì)層蠟質(zhì),沒(méi)有功能性氣孔,不具有柵欄組織,僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高,但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低.2、

15、玻璃化的原因：激素濃度；瓊脂濃度；溫度；光照時(shí)間；通風(fēng)條件；離子水平；3、預(yù)防玻璃化的舉措：適當(dāng)限制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分；適當(dāng)提升培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度；增加自然光照,限制光照時(shí)間；限制溫度；改善培養(yǎng)器皿氣體交換狀況；培養(yǎng)基中添加其它物質(zhì)；七試管苗的生根、馴化與移栽1,試管苗特點(diǎn)試管苗生態(tài)環(huán)境：高溫、高濕、弱光和無(wú)菌；試管苗與常規(guī)苗相比：第1,試管苗生長(zhǎng)細(xì)弱,莖、葉外表角質(zhì)層不興旺；第2,試管苗莖、葉雖呈綠色,但葉綠體的光合作用功能較差；第3,試管苗的葉片氣孔數(shù)目少,活性差；第4,試管苗根的吸收功能弱.2,試管苗的馴化：目的在于提升試管苗對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性

16、,最終到達(dá)提升試管苗的移栽成活率.3.試管苗的移栽：第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)無(wú)細(xì)胞壁倍增時(shí)間長(zhǎng),生長(zhǎng)緩慢需氧量少,對(duì)攪拌敏感聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開(kāi)始退化二、生長(zhǎng)特性貼附生長(zhǎng)型：如人胚肺細(xì)胞,Hela細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞：如血液白細(xì)胞,淋巴組織細(xì)胞等三、體外培養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差,敏感培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),易污染四、體外培養(yǎng)條件溫度,37度pH:7.2-7.4氣體：氧,二氧化碳,氮?dú)鉅I(yíng)養(yǎng)條件：需要多種氨基酸,維生素,輔酶,核酸,喋吟,嚅噬,激素和生長(zhǎng)因子,其中多種成分可以由血清提供五、體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程原代培養(yǎng)期；傳代培養(yǎng)期；衰退期六、設(shè)備、試劑及培養(yǎng)基的選擇

17、和配制1 .設(shè)備包括培養(yǎng)箱特別是二氧化碳培養(yǎng)箱、無(wú)菌室或者超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡特別是倒置顯微鏡、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶包括無(wú)鉀玻璃的或無(wú)毒塑料的、封閉式的或螺口式的等2 .常用試劑有抗生素、貼壁因子、生長(zhǎng)因子,還需要激素、凝集素、脂多糖LPS、各種營(yíng)養(yǎng)劑胰酶、膠原酶、EDTA各種生物緩沖劑等3 .培養(yǎng)基的選擇和配制培養(yǎng)基由三局部組成：根底培養(yǎng)基、血清和基質(zhì).自行配制或用現(xiàn)成的化學(xué)合成培養(yǎng)基,常用的化學(xué)合成培養(yǎng)基有Eagle包括BMEMEMDM曲、F10、F12、199、RPMI1640EBSSHBSSMcCoy's5a、Fischer's、BGjb、Swim'sS77等；培

18、養(yǎng)基中血清的濃度范圍為5%20%,以10%濃度最為常用；為維持某些細(xì)胞在體外的生機(jī)或增殖力,還需要事先在培養(yǎng)基中添加纖黏素、昆布氨酸、白明膠之類(lèi)的貼壁因子.一般用無(wú)水粉劑配制培養(yǎng)基,過(guò)濾和收集；七、培養(yǎng)方法懸滴；旋轉(zhuǎn)管；灌注小室；培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)板八、組織培養(yǎng)的污染、檢測(cè)和排除1 .污染的主要途徑和媒介的發(fā)生空氣、清洗消毒、操作、血清、組織2 .組織細(xì)胞污染的檢測(cè)真菌污染細(xì)菌污染支原體污染3 .組織細(xì)胞污染的排除抗生素除菌法、加溫除菌法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法九、細(xì)胞培養(yǎng)物在液氮中的保存和復(fù)蘇一培養(yǎng)物在液氮中的保存二凍存細(xì)胞的復(fù)蘇三細(xì)胞培養(yǎng)物凍存和復(fù)蘇中的平安舉措十、動(dòng)物組織培養(yǎng)的一些新應(yīng)用一組織工程組織工程用于重建組織和器官,強(qiáng)化組織和器官的功能.二毒理學(xué)研究細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用來(lái)作為毒理學(xué)試驗(yàn)的重要手段.三骨溶解病變過(guò)程的觀察四細(xì)胞衰老的研究五神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的研究十一克隆技術(shù)及其應(yīng)用根據(jù)克隆的層次分為基因克隆、細(xì)胞克隆、組織克隆、器官克隆及完整的生物體克隆.1基因克隆是指通過(guò)分子重組技術(shù)或是擴(kuò)增如PCRT增DNA>t斷的相同序列的大量拷貝,它是深入研究基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、調(diào)控及進(jìn)行基因改造的基礎(chǔ).常用的目的基因克隆技術(shù)包括：通過(guò)基因產(chǎn)物的分析和鑒定,進(jìn)一步確定氨基酸順序后推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列,然后通過(guò)抗體、寡聚核甘酸探針或PCR引物來(lái)別離目的基因.通過(guò)遺