DB53∕T 1059.2-2021 滇金絲猴檢疫技術 第2部分：毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范

1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標準DB53/T 1059.22021滇金絲猴檢疫技術 第 2 部分：毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 2:Technical specifications for laboratory examination of Capillaria2021 - 09 - 30 發(fā)布2021 - 10 - 14 實施云南省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布1學兔兔 標準下載DB53/T 1059.22021目次前言III引言1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術語和定義14 縮略語1

2、5 試驗原理26 試驗條件26.1 實驗室通用要求26.2 人員要求26.3 生物安全要求27 儀器設備和試劑27.1 主要儀器設備27.2 主要試劑28 樣品采集與保存39 試驗步驟39.1 形態(tài)學檢測39.2 PCR 檢測310 試驗數據處理310.1 蟲卵檢測410.2 蟲體檢測4附錄 A（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法5附錄 B（規(guī)范性）毛首線蟲的基本形態(tài)特征7IDB53/T 1059.22021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件是DB53/T 1059滇金絲猴檢疫技術的第2部分。DB53/T 1059已經發(fā)布了

3、以下部分：第 1 部分：產氣莢膜梭菌實驗室檢測技術規(guī)范；第 2 部分：毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范；第 3 部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術規(guī)范；第 4 部分：志賀桿菌實驗室檢測技術規(guī)范。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。 本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。本文件由云南省林業(yè)標準化技術委員會（YNTC02）歸口。本文件主要起草單位：云南農業(yè)大學、云南省標準化研究院、昆明動物園、云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所。本文件主要起草人：楊建發(fā)、黃艷梅、蒙英雯、朱勛程、衡昭君、楊俊、鄒豐才、陳培富、宋海洋、張譽方、李云喬、朱尤帥。IIIDB53/T 1059

4、.22021引言滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）是中國特有珍稀瀕危靈長類動物，屬于國家級重點保護野生動物，列入世界自然保護聯盟（IUCN）瀕危物種紅色名錄。編制并發(fā)布DB53/T 1059滇金絲猴檢疫技術地方標準，推進滇金絲猴疫病診斷的標準化和規(guī)范化，指導從事野生動物保護相關的專業(yè)人員按規(guī)范程序實施對滇金絲猴相關病原的實驗室檢測，為滇金絲猴的科學研究和保護工作提供病原或疫病調查的基礎數據，為滇金絲猴檢疫、疫病監(jiān)測和防治提供重要的參考依據，促進滇金絲猴繁育和擴群， 維護地區(qū)物種與生態(tài)平衡，提升生物多樣性保護成效。本文件已發(fā)布4個部分：第 1 部分：產氣莢膜梭菌實驗室檢測技術規(guī)范

5、。本部分從產氣莢膜梭菌實驗室檢測技術的總則、產氣莢膜梭菌分型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規(guī)范；第 2 部分：毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范。本部分從毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范的試驗原理、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品采集與保存、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規(guī)范；第 3 部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術規(guī)范。本部分從隱孢子蟲實驗室檢測技術的試驗原理、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規(guī)范；第 4 部分：志賀桿菌實驗室檢測技術規(guī)范。本部分從志賀桿菌實驗室檢測技術涉及的總則、志賀桿菌分類、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制

6、定了規(guī)范。DB53/T 1059.22021滇金絲猴檢疫技術第 2 部分：毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范1 范圍本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）檢疫技術中毛首線蟲實驗室檢測技術規(guī)范的試驗原理、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品采集與保存、試驗步驟、試驗數據處理。本文件適用于滇金絲猴檢疫技術中毛首線蟲實驗室檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489 實驗室 生物安全通用要求3 術語和定義下列術

7、語和定義適用于本文件。3.1線蟲 nematodes線蟲動物門為假體腔動物，線蟲屬通常呈圓柱形，線狀或毛發(fā)狀，某些種類呈鞭狀或球狀。不分節(jié)，兩側對稱并具有三胚層假體腔，一般為雌雄異體。蟲體大小隨種類不同差別較大，雄蟲一般較雌蟲小。 寄生性線蟲最常見寄生于消化道。3.2毛首線蟲 trichuris毛首線蟲是滇金絲猴最為常見也是危害最大的消化道線蟲。蟲卵隨滇金絲猴糞便排到外界，在糞便 和土壤中發(fā)育為感染性蟲卵；經口感染后，幼蟲在小腸內孵出，鉆入腸絨毛間發(fā)育，然后移行到盲腸和 結腸內發(fā)育為成蟲。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。PCR：聚合酶鏈式反應 Polymerase Chain Reactio

8、n TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液 Tris Acetate-EDTA Buffer DNA：脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI：美國國家生物技術信息中心 National Center for Biotechnology Information BLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具 Basic Local Alignment Search Tool1DB53/T 1059.220215 試驗原理鏡檢滇金絲猴消化道內的毛首線蟲蟲卵或蟲體，依據其形態(tài)特征鑒定病原；采用PCR方法開展分子鑒定。6 試驗條件6.1 實驗室通用要求實驗室應滿足GB 19489的要求

9、。6.2 人員要求采樣與試驗人員具有相應的專業(yè)知識。6.3 生物安全要求采樣及試驗過程中做好自身防護，試驗結束后的檢驗器具要進行消毒處理，廢棄樣品要及時進行無 害化集中處理。7 儀器設備和試劑7.1 主要儀器設備7.1.1 正置光學顯微鏡。7.1.2 載玻片及蓋玻片若干，漏斗、玻璃棒、燒杯。7.1.3 金屬篩：60 目。7.1.4 PCR 擴增儀。7.1.5 高速臺式離心機。7.1.6 單道可調移液器（量程 0.5 µL10 µL、2 µL20 µL、10 µL100 µL 和 100 µL1000 µL）。7.1

10、.7電子天平（量程 0.01 mg10 000 mg）。7.1.8恒溫水浴鍋：36 ±1 ，65 ±1 。7.1.9電泳槽、電泳儀，紫外凝膠成像儀，渦旋振蕩器。7.2 主要試劑7.2.1 飽和食鹽水。7.2.2 2.5%重鉻酸鉀液。7.2.3 基因組 DNA 提取試劑盒。7.2.4 2×Taq PCR Master Mix。7.2.5 DL 2000 DNA Marker。7.2.6 無菌水。7.2.7 50×TAE 緩沖液：Tris 堿 242 g 和 57.1 mL 冰醋酸，用雙蒸水定容到 1 L。7.2.8 核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。7.2.

11、9 1%瓊脂糖凝膠：1 g 瓊脂糖與 100 mL 1×TAE 緩沖液，加熱融化均勻，加入 10 µL 核酸染料，60 時，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。2DB53/T 1059.220218 樣品采集與保存糞樣的采集和保存方法見附錄A。9 試驗步驟9.1 形態(tài)學檢測9.1.1 蟲卵檢測采用飽和食鹽水漂浮法，毛首線蟲卵富集在飽和液表面。取糞樣5 g，加飽和食鹽水50 mL，用玻璃棒攪勻，通過 60目金屬篩或雙層紗布過濾到干凈燒杯中，靜置0.5 h；蘸取表面液膜，點樣于載玻片上， 蓋上蓋玻片，進行鏡檢。9.1.2 蟲體檢測用生理鹽

12、水清洗干凈蟲體，放于載玻片，滴加乳酸酚透明液23滴，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下 觀察透明蟲體的內部形態(tài)構造。對于存疑蟲體，結合下述PCR擴增方法對其進行蟲種鑒定。9.2 PCR 檢測9.2.1 DNA 提取和保存取糞樣，用商品化DNA提取試劑盒進行DNA提取，提取步驟按照DNA提取試劑盒說明書進行。1周內使 用到的DNA，放置于4 冰箱中；需要長期保存的DNA，放置于-20 冰箱中。9.2.2 PCR 擴增9.2.2.1 PCR 擴增引物針對線蟲線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基（COXI）基因設計引物，此引物靈敏度和特異性較高。上下游引物序列如下：JB3：5-TTTTTTGGGCATCCTGAG

13、GTTTAT-3；JB4.5：5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3。9.2.2.2 PCR 擴增體系PCR擴增體系為25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，無菌水10.5 µL，引物JB3和JB4.5 各0.5 µL，DNA模板1.0 µL。9.2.2.3 PCR 擴增程序用PCR擴增儀設置反應程序，94 預變性5min；94 變性30s，55 退火45s，72 延伸1min，設置36個循環(huán)反應，最后72 延伸5min，16 結束反應，同時設陰性對照和陽性對照。9.2.2.4 PC

14、R 產物檢測PCR擴增完成后，取PCR產物5 µL，加入1%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL 2000 DNA Marker作為參照， 110 V電壓電泳30 min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像儀中觀察并拍照。若出現預期的420 bp左右的條帶，擴增條帶進行測序后驗證。10 試驗數據處理3DB53/T 1059.2202110.1 蟲卵檢測經飽和食鹽水漂浮法鏡檢發(fā)現如附錄B中圖B.1所示的蟲卵，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。若發(fā)現存疑蟲卵，對其進行PCR擴增后，將PCR產物測序結果與NCBI GenBank中的序列進行BLAST在線比對，判定是否為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。10.2

15、蟲體檢測對蟲體進行鏡檢觀察到如附錄B中B.2描述的蟲體，直接判定為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。若發(fā)現 存疑蟲體，對其進行PCR檢測后，將PCR產物測序結果與NCBI GenBank中的序列進行BLAST在線比對，判定是否為滇金絲猴毛首線蟲感染陽性。4DB53/T 1059.22021附錄A（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法A.1 采樣工具一次性PE手套、自封袋、樣品管、記號筆、標簽紙等。A.2 糞樣新鮮程度判定將糞便樣品放于自封袋，根據糞便表面的濕潤程度、完整程度以及氣味等條件，判斷糞便樣品的新 鮮程度并記錄。A.3 糞樣的選取原則A.3.1 應采集滇金絲猴新鮮糞樣，同一堆糞樣只采集一份樣品，兩堆樣

16、品的距離應大于3 m。A.3.2 如遇到滇金絲猴母幼糞樣應分開采集；依據母猴和幼猴的糞樣大小有明顯差異作出判斷，并在備注欄記錄。A.4 樣品采集方法A.4.1 采集糞樣外部和內部的樣品，每次采樣時應更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。A.4.2 采集時，直接剝取分離新鮮糞樣的表層部分和內部部分，分別放入自封袋，貼上樣品標簽紙， 寫上樣品編號，將樣品管放入自封袋，并再次寫上樣品編號。A.4.3 同一堆糞樣應盡量多取樣品。A.5 樣品記錄與編號在采集糞樣時，應填寫滇金絲猴糞樣采集記錄表（見表A.1）。記錄采樣信息包括樣品編號， 采集管數，內部管數，外部管數，種群，采集地名，經緯度、海拔，新鮮程度、采集日期，采集人等信 息。表 A.1滇金絲猴糞樣采集記錄表樣品編號采集管數內部管數外部管數種群采集地名經緯度、海拔新鮮程度采集日期采集人注：新鮮程度等級：新鮮、一般、較差。A.6 樣品的臨時保存野外樣品采回后，有條件在4 下低溫保存，直到樣品送到相關實驗室。A.7 樣品的運輸和實驗室保存5DB53/T 1059.22021野外樣品采集完成后，應于48 h內送到相關實驗室，并盡快進行DN