氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)課件

1、1氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)1、氨基酸2、肽、肽鍵與肽鏈3、蛋白質(zhì)的分離與鑒定4、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定2除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下結(jié)構(gòu)通式。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的不同。從蛋白質(zhì)中分離出來的所有氨基酸（除甘氨酸外）都是L-型的。-氨基酸可變部分不變部分氨基酸的種類與結(jié)構(gòu)320種基本氨基酸按側(cè)鏈極性可分為3類：非極性氨基酸、極性但不帶電荷的氨基酸、帶電荷的氨基酸。按組成也可分為3類：脂肪族氨基酸（15）、芳香族氨基酸（3）、雜環(huán)族氨基酸（2）。氨基酸的種類與結(jié)構(gòu)4氨基酸按R基極性分類 非極性氨基酸:Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met

2、R基具極性不帶電荷的氨基酸:Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln R基帶正電荷的氨基酸:Lys, Arg, His R基帶負(fù)電荷的氨基酸:Asp, Glu 5 甘氨酸 Gly G6 丙氨酸 Ala A7 纈氨酸 Val V8 亮氨酸 Leu L9 異亮氨酸 Ile I10 甲硫氨酸 Met M11 半胱氨酸 Cys C12精氨酸 Arg R13 賴氨酸 Lys K14 天冬氨酸 Asp D15 谷氨酸 Glu E16 絲氨酸 Ser S17 蘇氨酸 Thr T18 天冬酰胺 Asn N19 谷氨酰胺 Gln Q20 脯氨酸 Pro P21 組氨酸 His H22 苯丙氨酸

3、Phe F23 酪氨酸 Tyr Y24 色氨酸 Trp W25氨基酸的酸堿性質(zhì)兩性電離性質(zhì)：根據(jù)L-氨基酸可電離基團(tuán)的pK值，氨基酸在生理pH下并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化形式存在，羧基是以離解狀態(tài)存在。26氨基酸的兩性電離性質(zhì) 在不同的pH條件下，氨基酸的電離狀態(tài) 會隨之發(fā)生變化。pH 強(qiáng)酸性 中性 強(qiáng)堿性凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子 負(fù)離子 等電點(diǎn)PI27氨基酸的等電點(diǎn)：當(dāng)溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡稱pI。在等電點(diǎn)時，氨基酸既不向

4、正極也不向負(fù)極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。氨基酸的酸堿性質(zhì)28側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK1和pK2的算術(shù)平均值。側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值。無論氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)欠窠怆x，其pI 值均決定于凈電荷為零的兩性離子兩邊的pK值的算術(shù)平均值。29氨基酸分離和分析基于氨基酸的酸堿性質(zhì)和極性大小進(jìn)行分析分離。常用的分析分離方法有： 濾紙層析、薄層層析分配柱層析離子交換層析：陰/陽離子交換樹脂高效液相層析電泳分離30氨基酸的電泳分離電泳是指帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。氨基酸是兩性電解質(zhì)，在一定pH緩沖液的電場中，氨基酸混合物中各組分根據(jù)它

5、們所帶凈電荷的種類和數(shù)量不同，以不同速度向不同方向泳動，從而得以分離。31氨基酸的電泳分離帶電顆粒在電場中的泳動速度（電泳遷移率）與分子的凈電荷、半徑、介質(zhì)粘度及電壓有關(guān)。凈電荷可用pI-pH 來近似計(jì)算。可作電泳固相支持物的有濾紙、淀粉、醋酸纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠等。32離子交換層析法分離氨基酸離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的不溶性高分子化合物。陽離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)可解離出Na+ 或H+，當(dāng)溶液中含有其它陽離子時，它們可以和Na+或H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上；同樣，陰離子交換樹脂含有的堿性基團(tuán)可解離出OH-，溶液中的陰離子和OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。33分離氨

6、基酸混合物常使用陽離子交換樹脂。交換柱中的樹脂先用堿處理成鈉型，將氨基酸混合液上柱，由于各種氨基酸與樹脂的親和力不同，用洗脫液可將各種氨基酸以不同的速度洗脫下來。在pH3左右, pI10, pI6，pI3的氨基酸混合物的分離情況？34氨基酸與樹脂間的親和力，主要決定于它們之間的靜電吸引，其次是氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用。在pH3左右，氨基酸與陽離子交換樹脂間的親和力次序是堿性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸。則洗脫順序是？35氨基酸與氨基酸之間通過-氨基和-羧基之間失水形成的酰胺鍵共價的結(jié)合在一起，這樣形成的化合物稱為肽。在蛋白質(zhì)化學(xué)中，這種酰胺鍵稱為肽鍵。2、肽、肽鍵與肽鏈36

7、由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽，這樣就形成了一條線性的鏈狀分子肽鏈。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。37在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。通常在多肽鏈的一端含有一個游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln生物活性肽。如谷胱甘肽,其重要生理功能有清除有害的氧化劑、作為植物體內(nèi)的電子傳遞體等。此外，許多重要的激素如舒緩激肽、腦啡肽，某些抗菌素如短桿菌肽S也

8、是重要的生物活性肽。38393、蛋白質(zhì)的分離與鑒定研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)隨時測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。40前處理：(1)破碎生物組織。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。粗分級分離:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。細(xì)分級分離：可用層析法、電泳法等對蛋白質(zhì)進(jìn)行精制。目標(biāo)

9、蛋白的鑒定。41蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)與鹽析分離鹽溶：低鹽濃度范圍內(nèi)，隨著鹽濃度增加，蛋白質(zhì)分子表面的帶電基團(tuán)吸附鹽離子，水合能力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解度增大。鹽析：當(dāng)鹽濃度達(dá)到飽和或半飽和程度，中性鹽大量結(jié)合溶液中的自由水分子，降低水的活度，同時與蛋白質(zhì)競爭水分子，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低，容易發(fā)生沉淀。42鹽析時，先將蛋白質(zhì)混合液調(diào)至目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，此時溶解度最小，可以達(dá)到最佳鹽析效果。常用的中性鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。43離子交換柱層析法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶

10、有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。陽離子交換樹脂適合分離pI大于7的蛋白質(zhì)，陰離子交換樹脂最適合分離pI小于7的蛋白質(zhì)。若用陰離子交換樹脂分離蛋白質(zhì)，則帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶負(fù)電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陰離子洗脫液（如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Cl-的離子交換作用）可以將帶有不同負(fù)電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。4445凝膠過濾層析此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。4647親和層析法這是一種高效分離純化蛋白質(zhì)的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定在載體上的特殊配體具有不同的識別和結(jié)

11、合能力。常用的配體有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。48 選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配體，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配體與載體共價連接。將這種連接有配體的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化蛋白質(zhì)的溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配體發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。親和層析法4950蛋白質(zhì)電泳在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)溶液的pH值不等于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不

12、同，因而在電場中移動的速度也不相同。在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電場強(qiáng)度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f)。51SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約1 2比例結(jié)合。這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且電荷密度也大體相同，因此，遷移速度只與相對分子量有關(guān)，與電荷和分子形狀無關(guān)。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法5253將兩性電解

13、質(zhì)(pH3-9,或其它范圍的如pH5-7)與丙烯酰胺和雙丙烯酰胺混合后預(yù)電泳，建立均勻連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)樣品后加樣再電泳時會根據(jù)它自身的等電點(diǎn)分別向兩極移動，最后在凝膠中相應(yīng)于其等電點(diǎn)處聚焦。等電聚焦與雙向電泳5455564.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目，多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。57測序的一般策略(1)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。(2)多肽鏈的拆分。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中存在鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵時，必需拆分二硫鍵，以獲得伸展的肽鏈。58(3)多肽鏈完全水解進(jìn)行氨基酸組成分

14、析，分析每條多肽鏈的氨基酸組成和各種氨基酸的摩爾數(shù)。(4)多肽鏈斷裂成多個肽段。采用兩種或多種專一性水解方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽碎片，并將其分離開來，以獲得單一的碎片。(5)測定每個肽碎片的氨基酸序列。59(6)確定肽碎片在多肽鏈中的次序。利用兩套或多套肽碎片的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，推導(dǎo)出整條肽鏈完整的氨基酸順序。(7)確定二硫鍵和酰胺基的位置。60N-末端分析 :利用多肽鏈N-末端殘基的游離 氨基能與某些化學(xué)試劑產(chǎn)生特有的化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行分析。二硝基氟苯法（DNFB、FDNB，Sanger試劑）、丹磺酰氯法（DNS）C-末端分析 末端氨基酸殘基的鑒定 61Sanger法：在堿性條

15、件下， 2,4-二硝基氟苯能夠與肽鏈N-端的游離-氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。丹磺酰氯（DNS）法：在堿性條件下，丹磺酰氯可以與N-端氨基酸的游離-氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。62過甲酸氧化法、巰基化合物還原法。1.幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).2.幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍

16、存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。二硫鍵的拆開63氨基酸組成分析常用6 mol/L的鹽酸在105-110條件下封閉水解24、48和72小時。優(yōu)點(diǎn)：不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)：色氨酸被完全破壞；含有羥基的絲氨酸或蘇氨酸等有一小部分被分解；天門冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。色氨酸在堿水解中不受破壞64胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp、酪氨酸Tyr, R2脯氨酸Pro （速度快）肽鏈水解位點(diǎn)肽鏈的部分水解 65胰蛋白酶：R1=賴氨酸Lys 和精氨酸Arg 側(cè)鏈，R2脯氨酸Pro（專一性高）。CNBr 裂解：Met羧基形成的肽鍵肽鏈水解位點(diǎn)66肽碎片的氨基酸順序分析 Edman化學(xué)降解法：逐個降解 酶降解法：氨肽酶、羧肽酶 質(zhì)譜法 根據(jù)核苷酸序列推定法 67Edman （苯異硫氰酸酯）法：在溫和的堿性條件下，苯異硫氰酸酯與肽鏈N-端