重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白(MBP7-2)在大腸桿菌表達工藝試驗報告論

1、重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白（MBP7/2)在大腸桿菌表達工藝試驗一 實驗目的（1）掌握重組蛋白在大腸桿菌中表達研究的基本方法和基本內(nèi)容（2）熟悉分子生物學基本實驗技術(shù)（3）熟悉研究過程培養(yǎng)分析問題解決問題的能力（4）培養(yǎng)完成整套試驗流程的能力（5）了解將形態(tài)發(fā)生蛋白的功能和應用二實驗原理細胞破碎 超生破碎：細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。IPTG誘導 E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一

2、個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達 。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)b半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

3、半乳糖。后者作為一種誘導劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應用。（4）常用的電泳方法 （1）醋酸纖維薄膜電泳(cellulose acetate electrophoresis ，CAE ），是以醋酸纖維薄膜作為支持物的一項電泳技術(shù)。醋酸纖維分子中每個葡萄糖單位的兩個游離羥基均與醋酸脫水縮合，生成二乙酰葡萄糖。常用于血清蛋白、同工酶的分離 （2）聚丙烯酰胺凝膠電泳 不同蛋白質(zhì)由于帶點性質(zhì)，分子顆粒大小及形狀不同，在聚丙烯酰胺凝膠中向極性泳動速度快慢不同，經(jīng)電泳最終

4、被分離，聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應，它具有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白 （3）瓊脂糖凝膠電泳 以瓊脂糖凝膠作為支持物的一項電泳技術(shù)。瓊脂糖是半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離作用。常用于血漿脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA 酶切片段的電泳分離 （4）本實驗采用SOD電泳的原理 SDS-聚丙烯酰

5、胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量

6、（五）超凈工作臺的原理四實驗步驟質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從冰箱中取出感受態(tài)細胞，冰浴融化細胞在超凈工作臺中將1ul質(zhì)粒加入感受態(tài)細胞，緩慢混均，冰上放置30min于干式恒溫器中，42熱擊90s,快速將關(guān)轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻5min加入400ul無菌SOC液體培養(yǎng)基，37搖床震蕩45min3500r/min離心2min棄上清液，用150ulLB液體培養(yǎng)基重懸感受態(tài)細胞將150ul菌液涂布在AMP（100ul|ML）kan(50ul|ml)BL瓊脂平板培養(yǎng)基中，倒置平板，37培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，時間不超過20h種子培養(yǎng)從培養(yǎng)皿中挑選邊緣清晰又比較大的菌落接入含LB液體培養(yǎng)基的離心管 中（無菌操作）LB液體培養(yǎng)基

7、的制備蛋白胨1gl氯化鈉1g|l酵母提取物5g|l配制100MLLB液體培養(yǎng)基（錐形瓶的選擇 培養(yǎng)基體積：錐形瓶體積+1：5）擴大培養(yǎng)將種子液轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng) 五 實驗分析六注意事項移液槍的使用注意事項1使用完畢，可以將其豎直掛在移液槍架上，但要小心別掉下來。當移液器槍頭里有液體時，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。 2如不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護彈簧。 3使用時要檢查是否有漏液現(xiàn)象。方法時吸取液體后懸空垂直放置幾秒中，看看液面是否下降。4在調(diào)節(jié)量程時千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡住內(nèi)部機械裝置而損壞了移液槍。（五）電

8、泳時各個成分的作用1.聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；2.制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；3.TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；4.十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋 白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。染色劑的選擇電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進行轉(zhuǎn)膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍法染色。銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入0.3 M CuCl2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶，膠置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再