提質(zhì)粒試劑盒說明書

1、Solarbio質(zhì)粒大提試劑盒說明書BeijingSolarbioScience八00-10-S02101DI1120-10（10次）TOC o 1-5 h zRNaseA（10mg/ml）600pl溶液I60ml溶液II60ml溶液III80ml漂洗液（濃縮液）2x15ml洗脫緩沖液30ml吸附柱10個收集管（50ml）10個說明書1份產(chǎn)品簡介：本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的特性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA,可最大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，一般從20-50ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可

2、快速提取200-300聘純凈地高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。注意事項(xiàng)：在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)。1、溶液I在使用前先加入RNaseA（可將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻置于2-8C保存。如果菌液量太大，超過50ml,會造成RNA消化不完全，可先加入500皿RNaseA,提出的質(zhì)粒中再加入余下的100皿,2、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液（如向15ml的漂洗液中加入60ml的無水乙醇）。3、使用前請先檢查溶液II和溶液III是否出現(xiàn)混濁，

3、如有混濁現(xiàn)象，可在37C水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。4、溶液II、溶液III和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。5、如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。操作步驟：1、收集50-100ml過夜培養(yǎng)的菌液11000rpm離心10分鐘，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。2、向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml溶液I（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。3、向離心管中加入5mlP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：翻轉(zhuǎn)一定要

4、溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA。作用時間不要超過2分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。4、向離心管中加入7mlP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5、11000rpm離心10分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。6、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2-3分鐘，llOOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次。）7、向吸附柱中加入

5、8ml漂洗液（請先檢查是否已加入無水乙醇），llOOOrpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。8、向吸附柱重加入5ml漂洗液，llOOOrpm離心1分鐘，棄掉收集管中的廢液。9、將吸附柱重新放回收集管中，llOOOrpm離心3分鐘，將吸附柱置于室溫放置3-5分鐘。注意：此步驟非常關(guān)鍵，其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）試驗(yàn)。10、將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加lml左右經(jīng)65-7OC水浴預(yù)熱的洗脫液緩沖液，室溫放置2分鐘，llOOOrpm離心3分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。注意：為了增加

6、質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入利息吸附柱中，llOOOrpm再次離心3分鐘。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于5OOyl，體積過小影響回收效率。11、DNA產(chǎn)物可-2OC保存。內(nèi)毒素清除劑使用步驟：提取前內(nèi)毒素清除劑放在冰上5分鐘，期間翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次使液體均勻冰冷。預(yù)冷內(nèi)毒素清除劑按照推薦的溫度操作絕對重要，可按比例加大或縮小提取規(guī)模。1、在質(zhì)粒DNA溶液中加入l/lO體積3MNaAc或l/2O體積5MNaCl溶液，冰水浴5分鐘。2、加l/5體積預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻，冰浴lO分鐘，溶液應(yīng)變清亮。3、37C水浴2O-3Omin，不時振蕩。4、l2OOOrpm離心5min，離心溫度應(yīng)在25C以上

7、。5、溶液應(yīng)分為兩相，否則應(yīng)重復(fù)步驟3-4。上層水相含DNA，下層油狀相含內(nèi)毒素。6、將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管，棄層油狀相。重復(fù)抽提2次，即重復(fù)步驟2-6兩次。7、最后加2.5倍體積的無水乙醇或等體積的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，用無內(nèi)毒素的高純水或緩沖液溶解沉淀。8、用內(nèi)毒素檢測試劑測定樣品中內(nèi)毒素活性，并與初始樣品比較。低拷貝或大質(zhì)粒（10kb）提取如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼筚|(zhì)粒10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用100-200ml過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加Pl、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應(yīng)在65-70C預(yù)熱，再吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間，以增加提取效率。其他步驟相同。質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測得到的質(zhì)粒DNA可用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度于純度。電泳檢測可能為單一條帶，也可能為2到3條