醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢驗(yàn)-免疫熒光技術(shù)課件

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢驗(yàn)-免疫熒光技術(shù)課件 PriCells-免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique） 光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù) 是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo) 記的抗原或標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光 素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾 物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁 輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。這種物質(zhì)，稱為熒光素。由 光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光；由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光，為化學(xué)熒 品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于

2、水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中 應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo) 于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為 PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分 激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測(cè)器檢測(cè)PerCP。）： （DNA、RNA）的雙螺旋堿基對(duì)中。在對(duì)DNA染色時(shí)，需用RNase對(duì)細(xì)胞進(jìn) PI的發(fā)射光譜為610-620nm。FL2探測(cè)器檢測(cè)PI。 B-GMUGMU360450APMUPMU360450酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用 銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)等的螯合

3、物可發(fā)射特征性的熒光，而且激發(fā)光波長(zhǎng)范 圍寬、發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄、熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合于時(shí)間分辨熒光免疫 復(fù)合物，可通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體形成攻膜復(fù)合體而導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔。因 此，水溶性染料如臺(tái)盼藍(lán)可進(jìn)入受損細(xì)胞，染成藍(lán)色，為陽(yáng)性反應(yīng)；不帶 鑷子夾住胸腺反復(fù)輕輕研磨單個(gè)細(xì)胞 加入5%小牛血清PBS制備細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至3-4107/ml 細(xì)胞膜穿孔的細(xì)胞呈藍(lán)色，細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞不著色。細(xì)胞毒 性作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：陰性反應(yīng)()死細(xì)胞占0-10%可疑陽(yáng)性反應(yīng)() 抗體能形成抗原抗體免疫復(fù)合物，通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，形成攻膜復(fù)合 物，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞受損，臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞，染成藍(lán)色，呈陽(yáng)

4、不能形成抗原抗體免疫復(fù)合物，也無(wú)補(bǔ)體，因此不能形成攻膜復(fù)合物，不 所以沒(méi)有抗原抗體免疫復(fù)合物的形成，補(bǔ)體不能被激活，不能形成攻膜復(fù)合物，細(xì)胞無(wú)受損，臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入而不被染色，呈陰性反應(yīng)。說(shuō)明CDC 物的形成，也無(wú)補(bǔ)體，細(xì)胞無(wú)受損，臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入而不被染色，呈陰性 第一節(jié)第二節(jié)第三節(jié)第四節(jié)第五節(jié)第六節(jié)抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)檢測(cè)常 用標(biāo)記技術(shù)免疫細(xì)胞的檢測(cè)免疫分子的檢測(cè)免疫相關(guān)基因的檢測(cè)免疫學(xué)檢 抗原抗體反應(yīng):抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 應(yīng)用已知抗體或抗原檢測(cè)未知抗原或抗體，可以對(duì)感染性、非感染性致病 一種抗原一般只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合 或親合力(avi

5、dity)來(lái)表示。親和力是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合強(qiáng)度。親合力是指整個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原在抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，當(dāng)抗原與抗體達(dá)到最適比例時(shí)，沉淀物形 根據(jù)抗原性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)成分的不同，可將抗原抗 體反應(yīng)分為：凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)采用標(biāo)記物的抗原抗體反 顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，這一 在定量抗體中分別加入不同濃度的抗原，經(jīng)一定時(shí)間后可形成免疫復(fù) 合物。用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，復(fù)合物形成越多，濁度越高，可根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的抗原含量。該法快速簡(jiǎn)便，可取代免疫擴(kuò)散法 火箭電泳單向擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)流電泳雙向

6、擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳 AgAbAg第二節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)常用的標(biāo)記技術(shù) 定量甚至定位測(cè)定，結(jié)果易于觀察、適合自動(dòng)化檢測(cè)等很多優(yōu)點(diǎn)。廣泛用 根據(jù)標(biāo)記物與檢測(cè)方法不同，標(biāo)記技術(shù)可分為:免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定免疫酶標(biāo)技術(shù)發(fā)光免疫分析免疫金標(biāo)記技 術(shù) 用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中的抗原反應(yīng)，抗原 性高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢查。缺點(diǎn)：非特異 入補(bǔ)體，使之與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體進(jìn) 還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等)進(jìn)行多 FPIA)熒光物質(zhì)經(jīng)偏振光藍(lán)光照射而躍入激發(fā)態(tài)，在恢復(fù)至基態(tài)后可釋放 用具有潛在熒光的物質(zhì)作為酶的底物，經(jīng)過(guò)酶解反應(yīng)產(chǎn)生高強(qiáng)度熒光，可 放射免疫測(cè)定法(rad