RNA干擾技術(shù)的特點

1、RNAi具有的特征RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNA；RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度， 而且相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)就能完全抑 制相應(yīng)基因的表達，是以催化放大的方式進行的；RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維 持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點；dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內(nèi)被Dicer酶切割為21 bp 左右的siRNA，并由siRNA來介導(dǎo)mRNA切割。而且大于30 bp的dsR

2、NA不能在 哺乳動物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和 凋亡；ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是 一個ATP依賴的過程。可能是Dicer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量。RNAi的生物特性RNAi抑制轉(zhuǎn)座子活性兩方面的證據(jù)提示轉(zhuǎn)座子活性的抑制與siRNA有關(guān)發(fā)現(xiàn)蠕蟲mut-7基因參與RNAi并且與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座抑制有關(guān)；在果蠅中，參與RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突變將導(dǎo)致該基因引起 的基因沉默的缺失，同時提高了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性。RNAi抵御病毒感染在擬南芥中研究轉(zhuǎn)基因引起基因沉默時發(fā)現(xiàn)，sgs2/sde1

3、基因突變的擬南芥對病 毒的侵染表現(xiàn)出高度的敏感性。RNAi參與異染色質(zhì)的形成和維持Hall等研究表明，著絲粒同源重復(fù)序列和RNAi組分一起正負調(diào)節(jié)著異染色質(zhì)的 形成并共同促使異染色質(zhì)組裝成核;Vople等在敲除裂殖酵母(S. pombe)的RNAi 途徑基因(如Argonaute、Dicer、RDRP)時發(fā)現(xiàn)異染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄得到的dsRNA可 以在RNAi途徑的參與下，加工成si RNA,si RNA募集異染色質(zhì)蛋白1( HP1),然后 靶向性引起相應(yīng)異染色質(zhì)區(qū)域的轉(zhuǎn)基因沉默。RNAi參與機體的發(fā)育調(diào)控及生理代謝RNAi只抑制轉(zhuǎn)錄后的基因，所以RNAi在生物體發(fā)育學(xué)研究中具有優(yōu)勢。Chuang 等

4、用RNAi技術(shù)進一步證實了 AG、CLV3、AP1、PAN等已知功能基因在擬南芥 花發(fā)育過程中的功能。在RNAi過程中形成的RISC復(fù)合物可根據(jù)不同情況分別 利用si RNA或stRNA行使不同的功能，但最終均導(dǎo)致特定基因沉默。1.高效性：Elbashir等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25 nmol/L與100 nmol/L的起始雙鏈 RNA產(chǎn)生的結(jié)果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低 到1.5 nmol/L時產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當(dāng)濃度降低到0.05 nmol/L 時，沉默的效果才消失。Holen等也證實1100 nmol/L的雙鏈RNA濃度對基因 沉默的效果是一致的。

5、這說明雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默效率是相當(dāng)高的。需要 ATP： Zamore等認為RNAi過程中至少有2個步驟需要能量的供給：一是長的雙 鏈RNA被Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結(jié)合解鏈后形成 有活性的RISC。.特異性：日bashir等和Brummel kamp等發(fā)現(xiàn)在2123個堿基對中有12個 堿基錯配會大大降低對靶mRNA的降解效果。.位置效應(yīng)：Holen等根據(jù)人TF（tissue factor）不同的位置各合成了 4組雙鏈RNA 來檢測不同位置的雙鏈RNA對基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類型的 細胞中，hTF167i和hTF372i能夠抑制85%90%的

6、基因活性，hTF562i只能抑制 部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中 心依次相差3個堿基對在其左右各合成了幾組雙鏈RNA,有趣的是它們所能抑制 該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和hTF161i只與 hTF167i相距9個和6個堿基，但它們幾乎沒有抑制該基因活性的能力。結(jié)果還 表明雙鏈RNA對mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的 mRNA被沉默效果較好。.競爭效應(yīng)：Hoten等將10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基 因效果無差異，但將20 nmol/L基因抑制效

7、果很差的PSK314i和10 nmol/L的 hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低。.可傳播性：在線蟲中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠的地方，甚至于全 身。Feinberg和Hunter在線蟲細胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白SID1,它可以將雙鏈 RNA轉(zhuǎn)運出細胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了 SID1介導(dǎo)的雙鏈RNA在細胞間的 運輸。但在果蠅上并未發(fā)現(xiàn)有此基因的同源物，因此在果蠅上通過注射產(chǎn)生的 RNAi不能擴散。植物中RNA干擾具有如下特點：（1）在確定基因功能時具有靶向性，在一個沉默 載體中插入部分基因序列就能確定某一基因的功能；能用來選擇性地沉默某 一基因家族中的單個

8、基因或同時沉默一個基因家族中的多個基因；（3）PTGS能確 定在敲除后發(fā)生發(fā)育早期死亡的基因功能；（4）PTGS具有系統(tǒng)性，可以通過植物 的維管系統(tǒng)傳遞到植物的其它部分；（5）PTGS易于用于大規(guī)模、高通量的系統(tǒng)研 究。人們通過構(gòu)建RNAi文庫已成功的對線蟲胚胎發(fā)育進行了研究，此項工作在 植物體系的研究中也正不斷取得進展。1.比同源重組法更加簡便，周期大大縮短。2.對于哺乳動物，如對于一些 敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用RNAi 技術(shù)研究它的功能。3.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研 究信號傳導(dǎo)通路的良好工具。4.R N Ai還被用來研究在發(fā)育過程

9、中起作用的 基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的 增殖和分化過程中起著關(guān)鍵作用。RNAi途徑主要存在于細胞漿中，與反義核酸、核酶相比，RNAi具有以 下特點。特異性。siRNA是嚴格按照堿基配對法則與靶mRNA結(jié)合的， 故只引起同源mRNA的降解。研究表明，在siRNA 21-23個堿基 中，錯配12個堿基就會大大降低干擾效應(yīng)。遺傳性。dsRNA分子 可擴散至生物體各個細胞，干擾效應(yīng)可遺傳給后代。研究表明，通過注射或浸泡 siRNA,在二代線蟲中仍可觀察到對靶基因的抑制作用12。但這種遺 傳效應(yīng)可持續(xù)幾代以及高等細胞中是否也存在上訴現(xiàn)象尚不明確。位置效應(yīng)。 研

10、究表明只有針對編碼區(qū)的dsRNA才產(chǎn)生干擾效應(yīng)，對內(nèi)含子區(qū)域的ds RNA不產(chǎn)生干擾效應(yīng)13Kesharwani等14根據(jù)人組 織因子(human tissue factor, hTF)的不同位置合成了 四組雙鏈RNA分別觀察其干擾效應(yīng)，結(jié)果顯示hTF167I和hTF37 2 1有8 5%90%的基因沉默效率，hTF 5 6 2 I只能抑制部分基因， hTF478I幾乎無干擾效應(yīng)。放大效應(yīng)。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，少量ds RNA就能夠使大量目的基因沉默，即使細胞增殖50100倍，這種沉默 現(xiàn)象仍然存在，表明RNAi存在擴增機制.4. 1高度特異性當(dāng)一段與基因同源的dsRNA注射入果蠅胚胎時，它可以

11、特異性 地在果蠅體內(nèi)干擾靶基因的表達。而其他即使是與靶基因同屬一個基因家族的基 因都不會受到干擾。4. 2高穿透性RNAi具有距注射點遠距離作用的能力。在線蟲中干擾效應(yīng)甚至可 通過生殖系統(tǒng)傳遞到后代個體。4. 3高效率性RNA干擾作用是在目的基因被轉(zhuǎn)錄后，通過對細胞質(zhì)中同源mRNA 的快速降解，最終由于該基因缺少mRNA而無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。果蠅的RNAi 實驗結(jié)果在23d即可以得到結(jié)果，這是其他傳統(tǒng)實驗技術(shù)所無法比擬的。4. 4高穩(wěn)定性以3端懸垂，ri堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定，無需像反義核酸那樣 進行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期。高特異性RNA選擇性地引起靶基因mKNA的降解具有 高度特異性,

12、有時一個堿基改變就會大大降低靶基 因封閉效果,如Bnimmelkairip等利用載體表達的 small hairpin RNA(shRNA)來封閉人 MCF-7 細胞的 CDIII基因，shRNA上僅一對堿基的突變，就不能抑 制CDH1基因的表達.高效率在細胞內(nèi)，RNAi途徑一旦被啟動，反應(yīng)信號就 可以被一定程度地擴增和放大.有人認為，最低每個 細胞一份拷貝的lsK51A就可以封閉基因的效果. 3.3高成功率RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析,研究 結(jié)果表明，其中50%80%序列選擇有效,12.9% 27%的基因封閉產(chǎn)生了明顯的異常表型(具體見卜 述RNAi的應(yīng)用).RNAi的特征RNAi

13、具有如下董要特征1a. RNAi是雙鏈 RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）機制，在 此情況下，啟動子是活躍的，外源基因也能被轉(zhuǎn) 錄，但不能正常枳鼠mRNA.當(dāng)轉(zhuǎn)基因細胞中存 在與外?；蛲吹膬?nèi)源基因時，不但外漉基因在 轉(zhuǎn)錄后水平上失活，也誘導(dǎo)與之同源的內(nèi)源基因沉 款：b.高穩(wěn)定性.以3,端懸垂TT堿基的雙鏈 RNA尤為稔定，無需像反義核數(shù)那樣進行廣泛的 化學(xué)修飾以提高半衰期口）c.高效率，能在低于 反義核酸幾個數(shù)貴級的濃度下.使目標(biāo)基因表達降 到極低水平甚至完全“剔除”，從而產(chǎn)生缺失突變 體表型：比基因敲除技術(shù)更快更簡單,可以僅僅在 一周時間內(nèi)關(guān)閉10個基因的表達，而且，那野在 胚胎中敲

14、除后導(dǎo)致死亡的基因,也可以利用RNAi 的方法在培養(yǎng)細胞中進行研究口。工人雙干涉系 % 哺乳動物細胞中存在兩條相互獨立的“干涉” 途徑，非特異性干涉反應(yīng)，由30 bp長序列雙鏈 RNA介導(dǎo)*可導(dǎo)致整個細胞非特異性蛋白合成抑 制及RNA降解：特異性干涉反應(yīng)，由2125足的 小干涉RNA介導(dǎo)，可逃避非特異性干涉系統(tǒng)的 .監(jiān)控，只降解與其序列相應(yīng)的單個基因的 iuRnN3：高特異性：小干涉RNA除正義鏈3 端的兩個域基在序列識別中不起主要作用外，其他 單個硬基改變就可能使RNAi失效，而針對同源基 因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因英同失點叫 f.高穿透靜葷播Ai具有強大的細胞穿透能力，可RNAi干

15、涉的特點1、干涉導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默注射靶mRNA的內(nèi)含子序列不會產(chǎn)生干涉效應(yīng)，而且Die等RNAi 過程的美犍酣在細胞胞漿中的發(fā)現(xiàn)驗證了這一觀點.2,干涉特異性較高.單個堿基的改變即可導(dǎo)致RNAi的失效.可降解相對應(yīng)單個的mRNA,即便是同一家 族的其他基因也不會受到影響巴同時也可特異性抑制同源基因的表達.3、干涉效果明顯.微量的dsRNA就可以導(dǎo)致RNAi.而且效果十分明顯,每個細胞僅需要幾個dsRNA就 可產(chǎn)生個體水平的RNAi效應(yīng).mRNA降解速度很快，可以在幾個小時內(nèi)通過觀察干涉的靶mRNA峰度來 驗證試驗結(jié)果.4、干涉途徑廣泛簡單生物可通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入dsRNA,而多細胞生物或胚

16、胎可通過注射而達到目的.例 如:線蟲可通過注射.展食叫浸泡達到目的.而在植物中可通過韌皮舒切割、也可在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為雙鏈RNA 的DNA嵌合結(jié)構(gòu)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而達到目的.同時基因槍法、電穿孔法四等也具有成藥的報道,也有人利 用質(zhì)粒攜帶模板DNA進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成dsRNA來得成功.5、不能稔定遺傳，只可將干涉效果影響至下一代，6、RNA可跨越細胞間界限.在線蟲實驗中，出RNA干涉可穿速細胞間界限.將dsRNA注射人頭腔或尾， 靖祟可在遠電離的組織甚至是后代的的血液中產(chǎn)生特異，有效的F涉現(xiàn)象,在植物中也有證實：在可自 植物切皮部而遍及擴散至整個植株叫將一個表面吸附有500bp基因片段灼金屬片恬入楨

17、物.在侵入點周困萬方數(shù)據(jù)第3期 王志偉等：RNA干涉的研究一展 129組織細電發(fā)生了同源基因表達的抑制,x 也就是說在植物中，共抑制效應(yīng)可以由轉(zhuǎn)染部位傳遞到其他細胞也 可以通過維管組縱長電離傳遞到整個植物體-當(dāng)植株局部被病毒感染或嫁接后，RNA沉默信號可以被系統(tǒng) 的傳遞給整個植株叫siRNA的結(jié)構(gòu)和功能之間存在相關(guān)性一LRNA 經(jīng)過切割形成20 25nt的siRNA,它們具有5末端 的磷酸基3末端的羥基和2個突出的單鏈核苦酸。 這種結(jié)構(gòu)對于RNAi是十分必要的。Nvkanen等的 研究表明平末端的&RNA或失去5,磷酸基團的 siRNA不具有RNAi的功能。所以，siRNA的三大 結(jié)構(gòu)特征是：

18、長度為21 23、雙鏈兩端各有兩個突 出的3,堿基、5,端有磷酸基團。這些特征使得siRNA 有別于其它的ckRNA,這也是細胞能夠區(qū)分出 真正的siRNA和其它dsRNA的分子基礎(chǔ)?；?RNAi的這一特性，細胞可以自行監(jiān)控異常的mR- NA,并封閉該基因的表達。RNAi的特異性。眾多實驗結(jié)果表明：導(dǎo)人生物 體的siRNA只能引起同源基因表達的抑制，而無關(guān) 基因不受影響&而且，在siRNA序列中配對的19. 21m中如果只改變一個核昔酸，就可以使該siRNA 序列不對靶inRNA起作用，證明RNAi有明顯的特 異性?？茖W(xué)家可以通過制備外源性的siRNA并導(dǎo) 入細胞內(nèi)，特異性地抑制某些基因的過

19、度表達和抑 制突變基因的表達，研究基因的功能。RNAi的高效性。ckRNA在DICER作用形成 siRNA,siRNA解鏈與RISC形成復(fù)合物，這些RISC 可專一性地與靶向的mRNA特異性結(jié)合。siRNA也 有可能不與RISC結(jié)合，而是通過解鏈直接靶向結(jié) 合inRNA不域然ISC結(jié)合位點或單鏈siRNA結(jié)合f立點在RdRP作用卜U形成疑的dsRMA,后為被 加CER特異識別而將tkRMA切斷,形成新的點RWA 而再循環(huán)作用于靶向iiiRMA 切斷后的mRNA或 被核酸外切酶所降解或可能成為異常RMA,在 R/RP作用卜又形成&RNA,再次被D1CER設(shè)別并 切斷,形成新的日正NA進一步作用于

20、靶向,RNA. 這種不斷放大的深布式作用形成大量新的回RNA、 使RN而作用在短時間內(nèi)達到迅速并有效地抑制 hlRWA翻譯形成蛋白質(zhì)或親肽.從而有效地抑制了 靶向基因蛋臼質(zhì)或多肽的合成口，每個細胭只需 少量人RNA即能完全關(guān)冏相應(yīng)基因表達，可見、 RNAi過程具有生物催化反應(yīng)的基本特征“RNAi的可擴散性；R電等觀察到將冊RNA注 射于線蟲體內(nèi),這些八RNA可以從注射處的細跑獷 散到體內(nèi)其他細胞，引起其他細胞的基因沉默川匚RNAi的可遺傳性初期的實驗觀察到.在華麗 新小桿線蟲,果施和小鼠的實驗可以看到，細胞增殖 50 KX）倍仍M保持RNAi演應(yīng)這說明RNAi有 放大的效應(yīng),或者有高效的催化機

21、制口然而，雖然 RNA1的效應(yīng)是長效的,甚至在受注射的華麗新小桿 線蟲的子一代的整個生活周期里都能持續(xù).但是由 于它并不能產(chǎn)生DNA的修飾,隨著細胞的不斷分 裂，小RN八逐漸被稀釋，最終不能存續(xù)地遺傳卜.去. 為了解決基因沉默的穩(wěn)定性遺傳問題小檔rineideH 和THMmitimk值等發(fā)現(xiàn)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的RNA時以在果 蠅體內(nèi)誘導(dǎo)穩(wěn)定遺傳的RNAi.用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反 式重叟的外源基閑導(dǎo)入果蠅體內(nèi)，所表達的具有發(fā) 夾樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也熊實現(xiàn)基因沉默的槎定遺 傳*RNAi有以下6個重要特性：高特異性。特異性地抑制目的基因。RNAi能夠非常 特異地只降解與其序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNA。靶序列的選

22、擇性。RNAi 的靶序列需要慎重選擇，外顯子序列的dsRNA能產(chǎn)生特異高效的基因抑制作用， 而只具內(nèi)含子序列的dsRNA則無此效應(yīng)。高效性。RNAi抑制基因表達具有很高 的效率，可以達到缺失突變表型的程度，而且相對很少量的dsRNA就能完全抑 制相應(yīng)基因的表達?？蓚鞑ズ涂蛇z傳性。RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以在不同 細胞間長距離傳送和維持。在線蟲中干涉效應(yīng)可以傳遞給子代。較強的穩(wěn)定性。 siRNA分子3端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在34天， 半衰期遠長于反義寡聚核甘酸.ATP依賴性。去除樣品中的ATP, RNAi現(xiàn)象降低 或消失，顯示RNAi是一個依賴ATP的過程，可能與D

23、icer和RISC的酶切反應(yīng)必 須由ATP提供能量有關(guān).1. 2特征。RNAi在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達，對染色體DNA序列的復(fù)制和 轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響。高度特異性：這是RNAi最大的特點，導(dǎo)入細胞的 dsRNA只特異性的抑制與RNAi同源的靶基因序列，siRNA中只要有任何一個堿基 與靶序列錯配，也會明顯減弱干擾效應(yīng)口。高效性：相對較少的dsRNA就可 以達到明顯的抑制基因表達的效果，引起該基因的表型缺失突變。濃度、時間 依賴性：RNAi效應(yīng)存在時間、濃度雙重依賴性，干擾效應(yīng)常出現(xiàn)在注射dsRNA 后6h,在注入dsRNA的23 d后作用最強，可持續(xù)效應(yīng)72 h以上，而其干擾 強度則隨著

24、濃度的增高而增強。傳遞性和遺傳性：將dsRNA注射于線蟲體內(nèi) 后發(fā)現(xiàn)，dsRNA可以突破細胞界限，在不同細胞甚至生物體間長距離傳遞和維持， 并引起其他細胞的基因沉默，表明了 RNAi作用的可傳遞性。同時也發(fā)現(xiàn)，siRNA 介導(dǎo)的RNAi具有一定的可遺傳性。將dsRNA注入秀麗新線蟲的性腺后，在其子 代中也誘導(dǎo)出了同樣的基因抑制現(xiàn)象，即證明了它的遺傳性。高序列特異性RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，19 nt的dsRNA幾乎 可以完全抑制基因的表達，而將其中的1nt突變掉后，它對基因的抑制作用就消 失了，這種高度的序列特異性能夠使dsRNA能夠非常特異地誘導(dǎo)與之序列同源 的

25、mRNA降解，避免降解與目的mRNA同家族的其他mRNA,從而實現(xiàn)對目的基 因的精確沉默。因此，RNAi具有重大的醫(yī)學(xué)價值。高效性RNAi存在級聯(lián)放大效應(yīng)，由于Dicer酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA 的結(jié)合并降解后者，產(chǎn)生新的siRNA ；新產(chǎn)生的siRNA可再次與Dicer酶形成RISC 復(fù)合體，介導(dǎo)新一輪的同源mRNA降解的多次利用，如此循環(huán)，使相對很少量 的dsRNA分子（數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量）就能產(chǎn)生強烈的RNAi效應(yīng)（每 個細胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應(yīng)），并可達到缺失突變體表型的程度。 相比普通的siRNA,具有短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA （ short

26、hairpin RNA, shRNA）產(chǎn)生的 RNAi效應(yīng)更強。RNAi抑制作用迅速RNAi基因的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，通過細胞質(zhì)中同源mRNA 的快速降解，最終使該基因缺少mRNA而無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RNAi作用的靶基因位點有選擇性外源性dsRNA的轉(zhuǎn)入只對成熟mRNA的產(chǎn) 生作用，對mRNA前體沒有或很少具有影響，以內(nèi)含子或啟動子序列構(gòu)成的外源 dsRNA無法引起RNAi效應(yīng)。具有高穩(wěn)定性與反義寡核甘酸不同，siRNA是3端懸掛TT堿基的雙鏈RNA, 所以化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，無須象反義核甘酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期。 3.6可傳播性和可遺傳性RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以越過細胞界限，

27、在不同 的細胞間長距離傳遞和維持。在線蟲中干涉效應(yīng)可以傳遞到子代，但這種遺傳只 限于子一代，子二代往往又恢復(fù)到野生型。3.7 RNAi效應(yīng)的依賴性只有連續(xù)輸入 dsRNA,沉默效應(yīng)才能持續(xù)下去，否則將產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)，而且這種效應(yīng)的 強度與初始dsRNA的濃度有關(guān)。2. RNAi的特點高度特異性：有時siRNA 一 個堿基改變就會大大降低封閉靶基因的效果口 Brum- melkamp等上利用載體表達的小發(fā)夾RNA ( small haupm RNA, shRNA)來過閉入 MCF-7細胞的 CDH1基因，shRNA上僅一對堿基的突變就不能抑制 CDH1基因的表達。其中.siRNA的中央位置堿

28、基位 點和3,末端倒數(shù)第2個堿基起了特別重要的作用小 (2)高效率口;：在細胞內(nèi)RNAi途徑一旦被啟動，反應(yīng) 信號就被放大.在低等動物中靶基因表達抑制效率大于90%,甚至有人認為每個細胞一份拷貝的 心R- NA就可以達到封閉基因的效果。(3)高成功率： RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析.其中有 50%80%序列選擇有效，12. 9%27%的基因封閉 產(chǎn)生了明顯的異常表型.例)種屬時效性rie等k發(fā) 現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺 乳動物細胞中只能維持一段時間，一般注入dsRNA 后的23d,RNAi的作用最明顯，而后12d內(nèi)，靶 mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射RNAi之

29、前的水平， 這可能是由于RNA依賴的核首脫氨防脫氨基活性的 逐步增高，導(dǎo)致siRNA的生成減少而受到抑制。(5) lMRNA的長度限制性：Dic能與200-500m范圍內(nèi) 的dsRNA結(jié)合，底物片段越短，Die*酶的活性也就 越弱，提示RNAi具有dsRNA片段長度限制性。(6) RNAi的遺傳性：目前已有大量的資料證實,在低等生 物中RNAi可以傳代，線蟲中的RNAl遺傳性需要 Rde-1和Rde-2來后動C7)傳播性：RNAi效應(yīng)可 以在細胞間擴散，最近Van等研究發(fā)現(xiàn)，sid 1基因可 編碼一種能跨膜11次的蛋白可能與此現(xiàn)象有關(guān). (8)ATP依賴性：在去除ATP的樣品中，RNAi現(xiàn)象

30、降低或消失，顯示RNAi是一個ATP依賴的過程,可 能與Dicer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能 量有關(guān).(9)模板選擇性：RNAi只有效作用于外顯 子，而對內(nèi)含子無影響中ikRNA序列是某個基因的 啟動子序列時也沒有明顯的效應(yīng).另外，RNAi對穩(wěn) 定且豐富表達的靶基因抑制效率也不高.RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制。注射該基因的內(nèi)含子或啟動子序列的dsRNA 都沒有干涉效應(yīng)。翻譯抑制劑對RNAi不產(chǎn)生影響。RNAi具有較高的特異性。起 初人們認為RNAi和siRNA的產(chǎn)生可能是序列非特異性的因為Fire和Mell發(fā)現(xiàn)將 化學(xué)合成的dsRNA注入線蟲體內(nèi)，只要當(dāng)dsRNA大于26bp

31、時就會發(fā)生RNAi， 而dsRNA阻斷基因表達的效能與其長度呈正相關(guān)，并且不包含腺嘌吟，尿喘啶， 或胞喀啶的dsl磯A也可誘發(fā)RNAi。但實際上dsRNA發(fā)揮干擾作用時對序列相 關(guān)性要求還是有較高要求的，序列不同的dsRNA與目標(biāo)基因mRNA要求它們相 同的連續(xù)序列長度大于30. 35nt,目標(biāo)基因方可被抑制，而當(dāng)該長度為1423nt 時抑制效率是非常低的，這些結(jié)果顯示，使用長的dsRNA或是兩相關(guān)序列90% 同源時基因抑制將會發(fā)生。而另一方面，slRNA若不與mRNA結(jié)合其自身又是不 穩(wěn)定的，易于降解。這一穩(wěn)定性提供了快速的特異性篩選，即不論何種來源的 dsRNA若細胞內(nèi)沒有與其互補的可供抑

32、制的mRNA序列與之結(jié)合，由于它的不穩(wěn) 定性，接下來的反應(yīng)不能繼續(xù)進行，反應(yīng)被終止。而若是有可結(jié)合的互補mRNA 反應(yīng)則繼續(xù)進行。這些均說明siRNA抑制基因表達是具有序列特異性的。RNAi抑制基因表達具有高效性。極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基閃的表達， RNAi是通過自身放大機制來發(fā)揮作用【l弓I，但dsRNA需要一個最小的長度才能 產(chǎn)生有效的干擾效果。dsRNA小片斷如果小于21. 23nt,特異性將明顯降低，不 能保證不與細胞內(nèi)非靶向基因相互作用，如遠遠大于21. 23nt,互補序列可能 延伸，超出抑制范圍。RN加有濃度，時間雙重依賴性。干擾效應(yīng)通常出現(xiàn)在注 射dsRNA6小時后，

33、可持續(xù)72小時以上。RNAi基因表達的效應(yīng)可以突破細胞界限，在不同細胞甚至生物體間長距離傳遞 和維持，并可傳遞給子一代。RNAi是生物基因組削弱或抵抗外來遺傳訊息入侵的保護性機制，已成為近年來 研究基因功能、腫瘤治療的新方法，該技術(shù)具有以下重要特征：高效性和濃度 依賴性(Schneider et al, 2005),只需要少量的siRNA就可以引發(fā)RNAi現(xiàn)象。這是 因為整個過程中存在倍增放大機制。Martens等在網(wǎng)狀原蟲的RNAi試驗中敲除 RrpA(RdRP的同源體)后則無法檢測到siRNA,但在體外系統(tǒng)中仍可檢測到，且量 非常少(Martens etal, 2002)；高特異性，siR

34、NA具有高度特異性，只針對某一 目的RNA或是其同源序列發(fā)揮作用。而對其他基因或是相關(guān)基因序列并沒有沉 默作用，這也是RNAi最大的優(yōu)點，針對性強。此外與基因敲除相比，根據(jù)目標(biāo) 基因設(shè)計合成的siRNA具有高度特異性，不同siRNA對同一基因的沉默效果不同， 從而可以模擬數(shù)量遺傳性狀；可遺傳性，將siRNA植入生物體內(nèi)，從根本上改 變了這種生物的基因組成。因此具有遺傳性。Fire等(1998)做過相關(guān)試驗。將針 對某基因的siRNA注入線蟲的性腺后在其子代中同樣檢測不到該基因的表達。通過對植物擬南芥）、動物（線蟲和靈蠅）等 的RNAl現(xiàn)象的研究,不難發(fā)現(xiàn)RNAi作用具有以 下重要特點,首先,R

35、NAi具看高度的特異性.只 引起與小RNA同源的mRNA降解口 RNAi技術(shù) 中siRNA序列選擇余地大，21可3個核甘酸中只 要改變一個核甘酸，就可以使該臺iRNA序列不對 靶向mRXA起作川+因此RNAi可用來抑|制單個 核甘酸突變基因的表達，其次,RNAi抑制基因表 達具有很高的效率,僅需少量的dsRNA就能有效 抑制陽基因表達. V-mX.研究發(fā)現(xiàn)要達到相同 的抑制J連環(huán)單門基因的目的應(yīng)義穿核背酸技 術(shù)所需濃度為2 RmM/L,而aiRNA則僅需要2。 nmol/L（ Aoki 爪）叫 此外,RNAi具有系統(tǒng)性 （或可傳播性人即siRNA燈以在RNA依賴性 RNA橐合醉的作用下進行大量

36、擴增，并轉(zhuǎn)運出期 胞,使RNAi擴散到整個機體并可以傳代二?1正因 為如此，TAl技術(shù)迅速發(fā)展成為- -種功能強大 的研究哺乳動物中選擇性抑制特異性靈因表達和 研究基因功能的重零方法,加快功能基因組學(xué)領(lǐng) 域的研究步伐國二2 RNAi的作用特點(1)高度將異性:有時期&NA一個麒基改變就會大大降低封閉靶基因的效果口高效率: 在闈胞內(nèi)RNAi途徑一旦被啟動,反應(yīng)信號就被放大.在低等動物士肥基因會塵抑制效率大于 為沏甚至有人認為每個細泡一倍拷貝的小KNA就可以達到封閉基囚的效果，(3)高成功 率:RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析淇中有50%典%序列選擇有效,12?%27%的 基因封閉產(chǎn)生了明顯

37、的異常表型.(4)種屬時效性:1加等網(wǎng)發(fā)現(xiàn),在低等生物中RNMH持續(xù) 存在，但RNAi在哺乳動物鈿胞中只能維持一段時間股注入心RNA后的d3d ,K5A用作用 最明顯，而后12d內(nèi).靶mRNA的豐度就鴕吸復(fù)到注射RMM之前的水平.這可能是由于RNA 依梭的核俘脫敏酸脫氮基活性的逐牛增蒞導(dǎo)致siKNA的生成減少而受到抑制L (習(xí)由&NA的 長度限制性;Die叮能與加。范用內(nèi)的出RNA結(jié)合,底物片段雄矩,Dictr雷的芯性也就越 弱次-示RNAi具西歐RNA片段長度限制性，RNAi的遺作性后前已有大墩的資料證實，在巴 等生物中時聞工以傳代，線蟲中的RNAi遺作性需要艮加-1和Rde-2米啟動，(7

38、)噸播性：RNAi 效應(yīng)可以在綱跑間擴散渴近Van等研究發(fā)7L證/基囚圮綢葩一種能蔣膜I1次的蛋宜可能與 此現(xiàn)象有關(guān).患)ATP依賴性;在去除ATF的樣品中,RNAU見象降低或消失，顯示RHAi是一個 ATP依賴的過程;可能與口族稱RI&C的醇切反庖必須由ATF提供能量有關(guān)。模板選擇性: RNA；只有效作用于外顯子，而對內(nèi)含子元建前.dsRWA序列是某個甚因的點動子序列時七 沒有明顯的效應(yīng).另外，處AIM穩(wěn)定且豐富表達的和延因抑制效率也不高.2 KNAi的生物學(xué)特點韓異柱RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制,有高度的序列特異性，這使dsRNA能夠非常特異地誘導(dǎo)與之 序列同源的mRNA降解.避免降

39、解與目的mRNA同 家族的其它mRNA,從而實現(xiàn)對目的基因的精確 沉默.口2-2 選擇感外源性擊RNA的轉(zhuǎn)入只對成熟mRNA產(chǎn)生作用，對mRNA前體沒有或很少具有影響，以內(nèi)含子 或啟動子序列構(gòu)成的外源dsRNA無法引起RNAi救應(yīng)MsRNA的長度對RNM的效率有影響。高效性只需少量壺RNA的引入便可抑制濃度是幾倍 甚至幾十佛的閨RNA的降解木、可能的原因： RNAi存在級聯(lián)放大效應(yīng)。相比普通的siRNA, shRNA產(chǎn)生的RNAi效應(yīng)更強;可能與RdflP的 作用有關(guān)，即在R&RP的作用下，曲RNA得以復(fù)制，從而產(chǎn)生更多的矗RNA導(dǎo)致mRNA降解， 2.4 可傳輯性和可遺傳性RNAi抑制基因表

40、達的效應(yīng)可以越過細胞界限， 在不同的細胞間長距囂傳遞和維持口值得注意的 是，大于30 nt的也RNA在哺乳動物細胞中可產(chǎn)生 非特異的基因抑制效應(yīng)，其可誘發(fā)細胞內(nèi)的干擾素 系統(tǒng)，激活RNA依賴蛋白激幅PKR,使翻譯起始因 子2的亞基（EIF2h）被磷酸化，導(dǎo)致翻譯過程被阻 斷，同時激活RNA防配體（RN配乩），語導(dǎo)干擾素的 產(chǎn)生，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細胞闔亡河口 然而，在胚胎干細胞或畸胎癌細胞系中不存在這種 干擾素效應(yīng)，長的點RN仍可引起基因特異性的 RNAL抑制作用迅速RNAi基因的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后通過細胞質(zhì)中 同源mRNA的快速降解，最終使該基因缺少mRNA 而無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物口穩(wěn)定

41、性較強siRNA分子式3,端有突出的非配對堿基的雙犍 分子,在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3 -4d,半衰期遠長于反 義寡聚核昔酸。2r7操作簡單較之傳統(tǒng)的技術(shù)難度高、費用高.試驗周期長的 探針雜交、基因敲除等方法，RNA干擾技術(shù)操作相 對簡單，效果明顯凸另外，RNAi還有對靶mRNA的 切割位點確定性和高穿透性等特點口2.2 RNAi的特點 RNAi較反義寡核苜酸核酣，基因敲除等技術(shù)有著無可比擬的特點和優(yōu)勢:（I）高效性:少量的URNA可以顯著抑制目的基因的表達，具有催化放大效應(yīng)：（2 ）高特異性：RNA1只降解同源mR、A,而其他mRA的表達則不受影響；（3 ）傳播,住二RAi具有強大的細胞穿透力,抑

42、制效應(yīng)可以穿過|細胞界限，干擾效應(yīng)可遺傳給后代；G）ATP依賴性二RNAi的發(fā)生依賴于ATP的參與.因為在Dicer的將 dsRNA切割成siRXA過程及RISC過程均需要ATP 的參與事3. 1高效性注入細胞內(nèi)的siRNA的量比細胞內(nèi)的mRNA量要少得多。但因為其自身的循環(huán)放 大機制仍可對目的基因產(chǎn)生有效的阻斷。3. 2高特異性由dsRNA降解成的小的干擾RNA,除其正義鏈3 7端的兩個堿基在序列識別中不 起主要作用以外，其余堿基在序列識別中都是必需的。單個堿基的改變即可以使 RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA,針對同源基因共有序列的RNAi則可使同 源基因全部失活。3. 3共抑制性

43、RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，它的啟動子相當(dāng)活躍，外源基 因可以轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA。RNAi作用不僅使外源基因在轉(zhuǎn)錄后水平上 失活，同時誘導(dǎo)與其同源的內(nèi)源基因沉默。3. 4種屬時效性Irie等發(fā)現(xiàn)在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細胞中只能維持 一段時間，一般注入dsRNA后的23 d, RNAi的作用最明顯，而后12 d內(nèi)， 靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射dsRNA之前的水平。這可能是由于RNA依賴的 核甘脫氨酶脫氨基活性的逐步增高，導(dǎo)致siRNA的生成減少而受到抑制。3. 5 dsRNA的長度限制性Dicer酶能與200500 bp范圍內(nèi)的ds

44、RNA結(jié)合，底物片段越短，Dicer酶的活性 也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片段長度限制性。Z R YAi的作用旃點RN&技術(shù)與以往其他基因于猶技術(shù)楣比有如下將 點口.工口通可加是#RMA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 TTG於機制. (與高穩(wěn)定性，以/端突HI TT戚基的#RNA 尤為穩(wěn)定，無需象反義核酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高半 套期力高度專-拄，即#RNA具有高度的特異性，它只能 引起與亞RNA同源的基因表達活性大幅度降低，即RM/Vi有 同源基因依賴性，：SiRNA除正義鏈3端的3個堿基在序列譚 別中不起主要作用外,其他單個喊基改變就可能使RNAi失 效，.而針對同源基因共有序列

45、的RNAi則導(dǎo)致同譙基因共同失 活, 高皴性，RNAi機制中存在催化或放大的步驟少曼的 次RNA分子就能完全捫制相府基因的表達，能任低于反義核 苜酸兒個數(shù)昆皺的液度卜研究目桃基因。比基因微除更簡單， 更快捷而且，邨些在胚胎中敲除后導(dǎo)致死亡的基因,也可以 利吊RMAi的方法任培養(yǎng)細胞中進行研究.(5)雙干擾系統(tǒng), 啃扎動物細胞中存在兩條相互獨立的干擾”途徑；非特異性干 擾反應(yīng)和特舁性干擾反應(yīng)。非特異件干擾反同由薊bp序列 的親RNA介導(dǎo)，可導(dǎo)取整個細胞非特異蛋白合成抑制及RNA 降解三特異性干擾反應(yīng)是由幻-23nt的由心A介導(dǎo)可逃避 非特異性干擾流統(tǒng)的監(jiān)控，只能降解與其序列相應(yīng)的單基因的 eRM

46、A高穿透性“RM%抑制基因表達的效應(yīng)可以穿過 細胞界限，任不同鈿胞間上距離傳逸和維持。在皤里中干擾效 應(yīng)甚至可以傳到后代去。C)RNAi過程中需要ATP參與功 弗，f的RNAi作用的靶整因位點有選擇性.許多寞騏研完結(jié) 嘉顯示RNAi作用對靶位點有選擇件 一般認為對內(nèi)含子和啟 動不序列無靴“有時即使是外思不的某些位點也不理想，對此 目前還不充全清楚.RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物基因組抵抗病毒或轉(zhuǎn)座子之類 的外來遺傳元件入侵的一種保護性機制，RNAi具有4個重要特征11： (1)高 效性：少量的雙鏈RNA (dsRNA)就可以使相應(yīng)的基因表達受到抑制，即其發(fā) 生

47、過程中有正反饋的信號放大效應(yīng)；(2)高特異性：雙鏈RNA (dsRNA)可以 特異地降解與之序列相對應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNA,無關(guān)基因不受影響；(3)可 遺傳性及遠距離效應(yīng)：RNAi基因表達的效應(yīng)不僅能夠傳遞給子一代，而且可以 在同一個生物體的不同細胞甚至生物體間進行長距離的傳遞和維持；(4)ATP依 賴性:RISC的形成和Dicer酶切割d sRNA的過程中都需要ATP的參與；因此， RNA干擾想要發(fā)生效應(yīng)則必須要依賴ATP的參與。3. 1高序列特異性RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性， 19 nt的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的1 nt突變后，它對基

48、 因的抑制作用就消失了，這種高度的序列特異性能夠使dsRNA非常特異地誘導(dǎo) 與之序列同源的mRNA降解，避免降解與目的mRNA同家族的其他mRNA,從而 實現(xiàn)對目的基因的精確沉默。因此，RNAi具有重大的醫(yī)學(xué)價值。3. 2高效性RNAi存在級聯(lián)放大效應(yīng)，由于Dicer酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA 的結(jié)合并降解后者，產(chǎn)生新的siRNA；新產(chǎn)生的siRNA可再次與Dicer酶形成RISC 復(fù)合體，介導(dǎo)新一輪的同mRNA降解的多次利用，如此循環(huán)，使得相對很少量的 dsRNA分子（數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量）就能產(chǎn)生強烈的RNAi效應(yīng)，并可達 到缺失突變體表型的程度。3. 3 RNAi抑制作

49、用迅速RNAi發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，通過細胞質(zhì)中同源mRNA的快速降 解，最終使該基因缺少mRNA而無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。3. 4 RNAi作用的靶基因位點有選擇性外源性dsRNA的轉(zhuǎn)入只對成熟mRNA產(chǎn)生 作用，對mRNA前體沒有或很少有影響，以內(nèi)含子或啟動子序列構(gòu)成的外源 dsRNA無法引起RNAi效應(yīng)。3. 5具有高穩(wěn)定性與反義寡核甘酸不同，siRNA是37端懸掛rI-I.堿基的雙鏈 RNA,所以化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，無須像反義核甘酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高 半衰期。3 RNA干抗的特點3A 靶向速擇性根據(jù)目的基 因結(jié)構(gòu)設(shè)計的不同川RNA所產(chǎn) 生的效應(yīng)存在顯著差異，這種作 用僅針對靶向基因的外顯子序

50、 歹IJ,而對啟動子或內(nèi)含子序列沒 有效應(yīng)心3.2件異性玳RNA只能引起 同源基因表達的抑制，而無關(guān)基 因不受影響口而且在siRNA序 到中，配對的19-21nt中如果只 改變一個核昔酸.就可以使該 siRNA序列不對靶mRNA起作 用，證明RNAi有明顯的特異 性口33 高蚊性在mRNA的降解 過程中，不斷形成大量的新 siRNA, RNAi作用在短時間內(nèi) 迅速有效地抑制mRNA翻譯形 成蛋白質(zhì)或多肽,從而有效地抑 制靶向基因蛋白質(zhì)或肽的合成， 每個細胞只需少量d麗NA就能 完全關(guān)閉相應(yīng)基因的表達口可 見，RNAi過程具有生物催化的 高效性。高超定性 siRNA作為 RNA干擾過程中關(guān)鍵的效

51、應(yīng)分 子，是由正義鏈和反義鏈組成的 長約21-23m的特殊dsRNA分 子,正義鏈序列與所作用的靶向 mRNA具有同源性,正義鏈和反 義靛末端均為5,端礴酸和余端 兵基，而且均有23個突出的非 配對堿基,在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在遺傳性雖然RN加的效 應(yīng)是長效的，但是由于它并不能 產(chǎn)生DNA的修飾隨著細胞的 不斷分裂,dgRNA逐漸被稀釋， 最終不能持續(xù)地遺傳下去a而 KsncnlM等發(fā)現(xiàn)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的 RNA可以在果蠅體內(nèi)誘導(dǎo)穩(wěn)定 遺傳的RNA干擾口用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)將反式重復(fù)的外源基因?qū)?果蠅體內(nèi),所表達的具宥發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也能實現(xiàn)基因 沉默的穩(wěn)定遺傳口3,6長度和浪度依麓性大量 資料顯示，蒙的

52、小RNA比短的 dsftNA介導(dǎo)的RNAi更有效， 但是這種活性作用與曲RNA 長度的增加之間沒有嚴格的正 比關(guān)系臺同樣的，RNA干擾效應(yīng) 隨siRNA濃度的增高而增高, 但達到一定濃度后效應(yīng)不再增 加3.7嗡乳動物體內(nèi)的RNAi具 有獨特性與果蠅、線蟲，植物 不同，哺費動物體內(nèi)的占iRNA 不具有擴增效應(yīng)而且圍RNA 長度的改變可以引起不同機制 的干涉效應(yīng)口大于30nf的 dsRNA所引起的非特異反應(yīng)，可 導(dǎo)致整個細胞非特異性蛋白合 成抑制和RNA降解”而21-23 的短雙鞋RNA則只降解同源基 團的inRNAp3特異性RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，這使出RNA能幡

53、非常特異地誘導(dǎo)與 之耳列同源的mRNA降解，避免降解馬口的而tNA同家族的凡它mRNA,從而實現(xiàn)對Fl的基因的精 確沉默町12選擇性外源性dsRNA的轉(zhuǎn)入只對成熟mRNA產(chǎn)生作用，對mRNA前怵沒有或很少具有影響，以內(nèi)含 子或啟動子序列構(gòu)成的外海d爾NA無法目I超RNAi效國dsRNA的長度時RNAi的效率有影響.3.3高效性R需少量本心的的引入便可抑制濃度是幾倍甚至幾十倍的mRNA的降解限6。叮能的原因卜RN Ai存在級聯(lián)放大效應(yīng)L相比普通的5IRMA.占hRKA產(chǎn)生的ENAi效應(yīng)更強；可能與RdRP的作用 有關(guān)，即在RdRP的作用下，d蛆NA得以良制.從而產(chǎn)生更多的dsRNA導(dǎo)致iliRk

54、a降解3可傳播性和可遺傳性RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以越過細胞界限，在不同的細胞間長距離傳遞和維持.值得注意的 是，大千前肩的的RNA在哺乳動物邳胞中可產(chǎn)生非特異的基因抑制效應(yīng)，其可隘發(fā)班胞內(nèi)的干擾素 系統(tǒng).搬活RNH依賴蛋白微MPKR,使翻洋起始因子7的3亞基（EIF上。被璘酸化，導(dǎo)致翻譯過程 被阻斷，可時激活RNA酶配體LRN居立上誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，跳而抑制重白質(zhì)的合成，導(dǎo)致珈胞調(diào) 亡3L然而，在胚胎干細胞城畸胎癌細胞系中不存在這種干擾素妓應(yīng)，長的dsRNA仍可引起基因特 異性的RNLAi,*5抑制作用迅速皿Ai基因的友這發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后.通過細胞質(zhì)中同蕭mRNA的快速降解.最絳使液基因缺少

55、ink NA而一無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。3再穩(wěn)定性較強siRN在分子式9端有突出的非配對堿基的雙薛分子，在郛胞內(nèi)可穩(wěn)定存在於阻，半我期遠長于反 義宴聚核甘酸.茶7操作簡單較之傳統(tǒng)的技術(shù)雄度高、費用高、試蠟周期性的探針雜交、基因敲除等方法，艮NA干擾技術(shù)操作 相對簡單，效果明顯口另外，R因Ai還有對靶uiRKA的切割位點確定性和高穿透性等特點。3. 1序列上的高度特異性：siRNA與靶基因的mRNA在序列上嚴格遵循堿基配對 原則，這樣就能特異性地干擾靶基因表達，而和靶基因同屬一個基因家族的其他 基因則不會受到影響。3. 2抑制基因表達的高效性：RNAi對基因表達的抑制率 可達90%以上，而且僅需極少

56、量的dsRNA就能產(chǎn)生強烈的RNAi,這種極高的抑 制效率是傳統(tǒng)實驗技術(shù)所無法媲美的。3. 3化學(xué)性質(zhì)的高度穩(wěn)定性：由于siRNA是在3端帶有2個TT堿基的dsRNA, 所以化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，不需要通過廣泛的化學(xué)修飾來提高半衰期。3. 4 RNAi抑制作用的迅速性：RNAi能快速降解胞質(zhì)中的靶mRNA,從而使靶基 因無法產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物，達到沉默靶基因的目的。3. 5 RNAi效應(yīng)的依賴性舊J：沉默效應(yīng)只有連續(xù)輸入dsRNA才能持續(xù)下去，而 且dsRNA的初始濃度影響RNAi效應(yīng)的強度。3. 6 RNAi效應(yīng)的可遺傳性和高穿 透性：dsRNA可通過質(zhì)膜、細胞間隙和細胞屏障而轉(zhuǎn)運，并能在不同細胞或

57、生物 間長距離傳遞和維持，甚至可傳給子代（線蟲）。2.4 RNA干擾的遺傳穩(wěn)定性 向已等巴觀察到注射下線蟲 體內(nèi)的也RN八可以從注射處的細胞擴散到體內(nèi)其他細胞，引 起尺他細胞.的基因沉默。雖然RNAi是長效的，其至在受注 射線蟲子一代的整個生活周期里都能持續(xù)，但是由于它并不 能產(chǎn)生DN4的修飾，隨著細胞的不斷分裂，也HXA逐漸被稀 釋,最終不能持續(xù)地遺傳下去,為了解決基因沉默的穩(wěn)定性 遺傳問題,利用轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列產(chǎn)生由RWA發(fā)卡，這 種發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)可以啟動FTCS效應(yīng)，從而抑制轉(zhuǎn)座酶量白的 產(chǎn)生和轉(zhuǎn)座子的移動，有利于遺傳穩(wěn)定，防止遺傳損害.用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反式重復(fù)的外源基因?qū)牍夡w內(nèi)，所

58、表達的 具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也能實現(xiàn)基因沉默的穩(wěn)定 遺傳小飛3. 1 RNAi是轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默只有針對mRNA的基因沉默才是有效的。以內(nèi) 含子為靶向的RNAi無干擾效果。3. 2高特異性RNAi是以siRNA為導(dǎo)向，對與siRNA互補的mRNA發(fā)揮干擾作用 的。siRNA通常只有2125bp,外源導(dǎo)入的siRNA最長有報道29bp的。只有在 siRNA與靶基因完全互補配對的情況下，RISC才能發(fā)揮作用，一個堿基的突變都 可能導(dǎo)致干擾失效。又由于并非所有的mRNA位點都可以被siRNA干擾阻斷，受 體結(jié)合位點和二級結(jié)構(gòu)都會影響RNAi效果，不當(dāng)?shù)慕Y(jié)合位點常常導(dǎo)致干擾無效 24, 25。通

59、常一段siRNA只能干擾一種或一類基因，因此具有高特異性。3. 3高效性通過對RNAi的機制的了解可以看出，一個起始siRNA在與靶基因結(jié) 合后即可以在RISC作用下把靶基因降解成大量新的RNA片段，自身又可以在RDR 的作用下復(fù)制擴增，形成干擾回路，使干擾效果成指數(shù)倍增長。3. 4系統(tǒng)性在植物中，RNAi信號可以通過胞問連絲和篩管進行細胞間短距離和 長距離的傳遞，從而是干擾擴散到整個組織或植株。動物細胞中RNAi信號可以 在相關(guān)跨膜蛋白介導(dǎo)下形成跨膜通道，達到擴散效果。線蟲中發(fā)現(xiàn)的由sidl 基因編碼SID. 1蛋白即是一種與沉默信號相關(guān)的跨膜蛋白26。哺乳動物中也發(fā) 現(xiàn)有SID. 1蛋白同

60、源物15。病毒引起的外源RNAi甚至是可以遺傳的。RNAi 引導(dǎo)和控制的組蛋白修飾及異染色質(zhì)狀態(tài)也被認為可以遺傳。3. 5顯效快對哺乳動物細胞注入siRNA,在數(shù)分鐘內(nèi)即可發(fā)現(xiàn)干擾現(xiàn)象，在2. 3h 是效果最為顯著。通常在1-2d后干擾現(xiàn)象完全消失。通過病毒載體介導(dǎo)RNAi, 可以使干擾效果持續(xù)lm。3。l RNAi現(xiàn)象具有種族特異性Barstead等16在dsRNA轉(zhuǎn)染實驗中發(fā)現(xiàn)，未分 化胚胎干細胞RNAi現(xiàn)象明顯，而分化胚胎細胞中則不明顯或僅能檢測到微弱的 效應(yīng)。Miyagishi等111利用u6啟動子合成3末端4個尿甘酸突出的siRNA基 因沉默，實驗證實siR. NA效應(yīng)依賴于靶序列，