生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件

第9章生物大分子進(jìn)化第9章生物大分子進(jìn)化內(nèi)容自然界生物大分子進(jìn)化1生物大分子進(jìn)化方法2生物大分子進(jìn)化的概念和思路3分子多樣性的建立4內(nèi)容自然界生物大分子進(jìn)化1生物大分子進(jìn)化方法2生物大分子進(jìn)化

分子庫(kù)的放大5標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子6挑選和篩選7應(yīng)用實(shí)例8分子庫(kù)的放大5標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子6挑選和篩選7應(yīng)用實(shí)例89.1自然界的生物大分子進(jìn)化達(dá)爾文(1809～1882)

出生于英國(guó)西部一個(gè)世代為醫(yī)的家庭。乘貝格爾號(hào)艦作了歷時(shí)5年的環(huán)球航行，對(duì)動(dòng)植物和地質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了大量的觀察和采集。

9.1自然界的生物大分子進(jìn)化達(dá)爾文(1809～1882)

19世紀(jì)中期，達(dá)爾文，在物種起源書(shū)中提到了進(jìn)化論。物種進(jìn)化的兩個(gè)因素：遺傳突變自然選擇19世紀(jì)中期，達(dá)爾文，在物種起源遺傳突變自然選擇：

環(huán)境條件對(duì)于生物的變異進(jìn)行選擇而導(dǎo)致適者生存、不適者被淘汰的過(guò)程。

自然選擇：

突變不被淘汰突變不被淘汰遺傳信息儲(chǔ)存在基因組中；基因組序列在自然情況下存在隨機(jī)突變概率；突變可遺傳給子代；增加種群的基因多樣性。遺傳信息儲(chǔ)存在基因組中；優(yōu)勢(shì)基因頻率增加進(jìn)化

自然選擇優(yōu)勢(shì)基因頻率增加進(jìn)化自然選擇生物大分子進(jìn)化DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的功能從無(wú)到有從簡(jiǎn)單到復(fù)雜從低級(jí)到高級(jí)生物大分子進(jìn)化DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的功能自然界的生物大分子多樣性和RNA世界假說(shuō)自然界的生物大分子多樣性和RNA世界假說(shuō)生物大分子的進(jìn)化基因數(shù)量龐大RNA剪切，表達(dá)產(chǎn)生不同的蛋白蛋白質(zhì)剪切酶將蛋白質(zhì)連接在一起；翻譯后修飾；多樣性生物大分子的進(jìn)化基因數(shù)量龐大多樣性RNA世界假說(shuō)

DNARNA蛋白質(zhì)RNA世界假說(shuō)DNARNA蛋白質(zhì)

1981年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者吉爾伯特（W.Gilbert）提出了“RNA世界”的假說(shuō)。指的是“在生命起源的某個(gè)時(shí)期，生命體僅由RNA組成。遺傳信息的傳遞建立于RNA的復(fù)制，其復(fù)制機(jī)理與當(dāng)今DNA復(fù)制機(jī)理相似，作為生物催化的、由基因編碼的蛋白質(zhì)還不存在”。

1981年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者吉爾伯特（W.容易發(fā)生突變，因此在攜帶遺傳信息的能力方面，RNA不如DNA；RNA又由于組成沒(méi)有蛋白質(zhì)復(fù)雜，不可能形成如蛋白質(zhì)那么多樣的結(jié)構(gòu)，因此在功能分子的作用方面，RNA又不如蛋白質(zhì)。容易發(fā)生突變，因此在攜帶遺傳信息的能力方面，RNA不如DNA

RNA可自我復(fù)制RNA具有催化功能RNA可自我復(fù)制當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)功能完善后RNA分子才被取代當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)功能完善后喬伊斯，ScrippsResearchInstitute所長(zhǎng)

發(fā)現(xiàn)了一對(duì)短小但功能強(qiáng)大的RNA序列，把它們和一堆結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單的RNA“原料”混在一起.結(jié)果：數(shù)量會(huì)不斷倍增，幾小時(shí)內(nèi)就能擴(kuò)增至原來(lái)的10倍，而且只要有充足的原料和空間，這種擴(kuò)增過(guò)程就不會(huì)停止。

喬伊斯，ScrippsResearchInstitut問(wèn)題RNA又是怎么產(chǎn)生的？問(wèn)題RNA又是怎么產(chǎn)生的？9.2化學(xué)生物學(xué)中的生物大分子進(jìn)化方法自然界進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)：生物多樣性豐富，種群巨大；生物本身調(diào)控系統(tǒng)精密；缺點(diǎn)：不能定向突變；突變概率低；周期長(zhǎng)。9.2化學(xué)生物學(xué)中的生物大分子進(jìn)化方法自然界進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)：分子庫(kù)擴(kuò)增9.3生物大分子進(jìn)化的基本概念和思路多樣化分子進(jìn)化目標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)篩選分子庫(kù)擴(kuò)增9.3生物大分子進(jìn)化的基本概念和思路多樣化分子自然界生物大分子放大文庫(kù)分子篩選目標(biāo)分子自然界生物大分子放大文庫(kù)分子篩選目標(biāo)分子9.4分子多樣性的建立分子多樣性的建立是生物大分子進(jìn)化的基礎(chǔ)。DNA穩(wěn)定性好；易操作；通過(guò)改變條件和模板就能得到不同序列和結(jié)構(gòu)的DNA；可以轉(zhuǎn)錄和翻譯變成RNA和蛋白質(zhì)。9.4分子多樣性的建立分子多樣性的建立是生物大分子進(jìn)化DNA文庫(kù)的突變方法基因組隨機(jī)突變易錯(cuò)PCR定點(diǎn)突變DNA改組法DNA文庫(kù)的突變方法9.4.1基因組的隨機(jī)突變法方法：天然隨機(jī)突變物理化學(xué)誘變化學(xué)：羥胺、溴乙錠、烷基化試劑、強(qiáng)氧化劑等。物理：放射性誘變（紫外線）。9.4.1基因組的隨機(jī)突變法方法：天然隨機(jī)突變紫外線突變頻率10～10天然突變頻率10～10-4-9-9-10基因組的隨機(jī)突變法缺點(diǎn)不能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的突變紫外線突變頻率10～10-4-9-9-10基因組的隨機(jī)關(guān)鍵突變頻率的選擇突變頻率太高會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔?，無(wú)法篩選到有益突變;突變頻率太低則會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)中全是野生型群體。關(guān)鍵突變頻率的選擇9.4.2易錯(cuò)PCR

采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，來(lái)改變擴(kuò)增過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。9.4.2易錯(cuò)PCR采用DNA聚合酶生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件條件

高鹽和添加劑存在的條件下，聚合酶的PCR的反應(yīng)錯(cuò)誤率可達(dá)0.7%。具體方法如提高鎂離子濃度、加入錳離子；改變體系中四種的dNTPs濃度；運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等。條件9.4.3定點(diǎn)誘變

在體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一個(gè)特定堿基的技術(shù)。分類(lèi)：定點(diǎn)突變、盒式定點(diǎn)突變、PCR突變。9.4.3定點(diǎn)誘變?cè)隗w外特異性地取代定點(diǎn)突變ＡＡＧＣＧ定點(diǎn)突變ＡＡＧＣＧ盒式定點(diǎn)誘變文庫(kù)分子盒式定點(diǎn)誘變文庫(kù)分子

定點(diǎn)突變文庫(kù)篩選定9.4.4DNA改組DNAShuffling是運(yùn)用隨機(jī)突變技術(shù)，對(duì)某種感興趣的蛋門(mén)質(zhì)或核酸進(jìn)行快速的改造，并定向選擇所需性質(zhì)的生物分子。

9.4.4DNA改組DNAShuffling原理單個(gè)基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片段。無(wú)引物PCR，具有互補(bǔ)3’末端的片段互為引物，各為模板，通過(guò)不斷的PCR循環(huán)在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合并進(jìn)一步延伸。最后利用基因兩端序列為引物合成全長(zhǎng)的重排產(chǎn)物，這些重排產(chǎn)物的集合被稱(chēng)為突變文庫(kù)。對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體進(jìn)行下一輪shuffling循環(huán)，重復(fù)多次重排和篩選，直到最終獲得性狀比較理想的突變體。原理單個(gè)基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片進(jìn)行定向進(jìn)化的生物活性分子可以是那些由于毒性太大而無(wú)法大劑量使用的蛋白質(zhì)藥物;可以是基因治療載體和基因藥物等核酸分子。進(jìn)行定向進(jìn)化的生物活性分子示意圖示意圖FamilyshufflingFamilyshufflingDNA改組成功與否取決于三個(gè)因素：相關(guān)基因組中基因的相似程度;酶切產(chǎn)生的DNA片段小大;退火溫度。

DNA改組成功與否取決于三個(gè)因素：優(yōu)點(diǎn)人工理性設(shè)計(jì)DNAShuffling隨機(jī)性優(yōu)點(diǎn)人工理性設(shè)計(jì)DNAShuffling隨機(jī)性同序比對(duì)同序比對(duì)9.5分子庫(kù)的放大構(gòu)建出的文庫(kù)分子的拷貝數(shù)不高需要放大一鍋法

DNA：PCRRNA：RT-PCR9.5分子庫(kù)的放大構(gòu)建出的文庫(kù)分子的拷貝數(shù)不高PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNART-PCRRNA9.6標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子

蛋白質(zhì)是生物體功能實(shí)現(xiàn)的載體，蛋白質(zhì)分子不能直接放大。

需要對(duì)其標(biāo)記和區(qū)分放大9.6標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)是生物體功能方法

目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因與特殊的表達(dá)生物體結(jié)合，通過(guò)表達(dá)將蛋白質(zhì)展示出來(lái)。方法目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因與特殊的表達(dá)生物體結(jié)合，通

細(xì)胞展示噬菌體展示

具體方法核糖體展示

mRNA展示

細(xì)胞展示噬菌體展示具體核糖體展示mRNA展示9.6.1細(xì)胞展示將含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中；挑選單克??；誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；通過(guò)特定的選擇系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇。9.6.1細(xì)胞展示將含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件缺點(diǎn)：文庫(kù)的量很小；不能精確控制；缺點(diǎn)：9.6.2噬菌體展示

將目標(biāo)蛋白的基因與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達(dá)在噬菌體表面的方法。9.6.2噬菌體展示將目標(biāo)蛋白的基因與噬菌體外殼噬菌體感染細(xì)菌的病毒。噬菌體顆粒感染一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后可迅速生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒，每個(gè)子代顆粒又可感染細(xì)菌細(xì)胞，再生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒。如此重復(fù)只需4次，一個(gè)噬菌體顆粒便可使幾十億個(gè)細(xì)菌感染而死亡。

噬菌體生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件9.6.3核糖體展示

蛋白及其mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白展示在核糖體表面，將基因型和表型聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)含有mRNA的標(biāo)簽可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行放大。9.6.3核糖體展示蛋白及其mRNA同時(shí)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件

mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物文庫(kù)方便的對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行選擇處理，通過(guò)親和篩選的方法富集含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的復(fù)合物，后對(duì)其進(jìn)行放大操作。缺點(diǎn)：不是很穩(wěn)定mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物文庫(kù)ribosomedisplayribosomedisplay9.6.4mRNA展示

mRNA展示技術(shù)一種新興的體外多肽篩選技術(shù)?？梢赃\(yùn)用于生物分子配體的發(fā)現(xiàn)和相互作用的分析。

9.6.4mRNA展示原理

嘌呤霉素是一種分子質(zhì)量小、化學(xué)性質(zhì)為穩(wěn)定的氨酰tRNA類(lèi)似物。當(dāng)3‘端帶有嘌呤霉素連接子的mRNA在體外翻譯系統(tǒng)中完成翻譯時(shí)，嘌呤霉素模擬tRNA末端的氨?；Y(jié)構(gòu)，進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)，抑制了蛋白質(zhì)的翻譯，在新生肽鏈和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之間形成穩(wěn)定的酰胺鍵，使mRNA的3’端與多肽的羧基端共價(jià)結(jié)合起來(lái)。

原理嘌呤霉素是一種分子質(zhì)量小、化學(xué)性質(zhì)為穩(wěn)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件9.7挑選和篩選分類(lèi)：體內(nèi)Invivo、體外Invitro篩選：對(duì)文庫(kù)的每一個(gè)分子都進(jìn)行嘗試，找出目標(biāo)。挑選：不需對(duì)文庫(kù)的每一個(gè)分子都進(jìn)行嘗試，只需要設(shè)定一個(gè)條件，符合條件的分子將被挑選出。9.7挑選和篩選分類(lèi)：體內(nèi)Invivo、體挑選和篩選的比較體內(nèi)體外篩選比較樣品的顏色、熒光等物理化學(xué)性質(zhì)讓細(xì)胞產(chǎn)生各種顏色、熒光或具有放射性等挑選如共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合在某固定相表面只表達(dá)了特異蛋白的細(xì)胞才能存活挑選和篩選的比較體內(nèi)體外篩選比較樣品的顏色、熒光等物理化學(xué)性10文庫(kù)大小篩選：10挑選：10～10515挑選流程10文庫(kù)大小515挑選流程篩選挑選優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單快速缺點(diǎn)耗時(shí)需建立體系篩選挑選Conclusion定向進(jìn)化=突變

+

篩選

ConclusionGene/genescodingforenzymesofinteresting突變Poolofmutantgenes轉(zhuǎn)化宿主菌篩選單一突變基因的克隆好的突變進(jìn)行下一輪突變突變的優(yōu)良基因酶的生產(chǎn)和性質(zhì)改進(jìn)重復(fù)定向進(jìn)化Gene/genescodingforenzymes9.8生物大分子進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例9.8.1自然改進(jìn)型分子進(jìn)化

（1）綠色熒光蛋白2008年諾貝爾獎(jiǎng)錢(qián)永健9.8生物大分子進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例9.8.1自然改進(jìn)型分子進(jìn)下村修下村修錢(qián)永健

1994年，開(kāi)始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。世界上用的大多數(shù)是錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的黃色、藍(lán)色，有的可激活、可變色。錢(qián)永健1994年，開(kāi)始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件綠色熒光蛋白分子進(jìn)化DNA改組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞展示體外篩選綠色熒光蛋白分子進(jìn)化DNA改組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)改進(jìn)后效果發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)45倍；激發(fā)光和發(fā)射光單色性有改善；進(jìn)化出了黃色、紅色等蛋白。改進(jìn)后效果發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)45倍；生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件雙內(nèi)含肽系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)原理內(nèi)含肽1:SynechocystisspDnaBintein內(nèi)含肽2:MycobacteriumxenopiGyrAintein

雙內(nèi)含肽系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)原理內(nèi)含肽1:Synechocys23℃pH7.0GFPmut3*雙內(nèi)含肽蛋白純化過(guò)程

DTT上柱剪切洗脫15℃+IPTG

4℃幾丁質(zhì)柱剪切23℃pH7.0GFPmut3*雙內(nèi)含肽蛋白純化過(guò)程D含cGFPmut3*表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場(chǎng)熒光疊加

優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)溫度：15℃含cGFPmut3*表達(dá)的E.coli激光共聚焦照片含GFPmut3*內(nèi)含肽融合前體表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場(chǎng)熒光疊加含GFPmut3*內(nèi)含肽融合前體表達(dá)的E.coli激光共親和純化得到的GFPmut3*SDS電泳圖Lane1:蛋白MarkerLane4:Lane3上清液通過(guò)幾丁質(zhì)柱液后的溶液Lane2:誘導(dǎo)前的細(xì)胞粗提液Lane5:柱上洗脫的目的蛋白Lane3:IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞破碎

Yield：2.41mg\LPurity：>95%

親和純化得到的GFPmut3*SDS電泳圖純化的GFPmut3*的光譜學(xué)特性

GFPmut3*的熒光光譜Ex=502nmEm=511nmGFPmut3*的紫外吸收光譜

純化的GFPmut3*的光譜學(xué)特性GFPmut3GFP的結(jié)構(gòu)示意圖

GFPmut3*的圓二色性光譜GFP的結(jié)構(gòu)示意圖GFPmut3*的圓二色性光譜用途生物分子示蹤金屬離子、小分子的傳感器研究分子成像用途生物分子示蹤

（2）非天然氨基酸的定點(diǎn)插入定向進(jìn)化tRNA和氨酰tRNA合成酶只能識(shí)別20種氨基酸識(shí)別非天然氨基酸進(jìn)化（2）非天然氨基酸的定點(diǎn)插入定向進(jìn)化tRNA和氨酰tRNA非天然氨基酸定點(diǎn)插入非天然氨基酸定點(diǎn)插入具體步驟確定目標(biāo)tRNA建立氨酰tRNA合成酶文庫(kù)轉(zhuǎn)入細(xì)胞利用TAG作為非天然氨基酸的插入位點(diǎn)挑選具體步驟確定目標(biāo)tRNA非天然氨基酸優(yōu)點(diǎn)小巧，不會(huì)干擾蛋白質(zhì)的正常功能；不需報(bào)告基因是蛋白質(zhì)自身具有熒光功能；可識(shí)別金屬離子；對(duì)pH值環(huán)境有特別響應(yīng)。非天然氨基酸優(yōu)點(diǎn)小巧，不會(huì)干擾蛋白質(zhì)的正常功能；9.8.2新功能分子進(jìn)化生長(zhǎng)激素的重塑腺垂體細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要因子。

9.8.2新功能分子進(jìn)化生長(zhǎng)激素的重塑受體與激素結(jié)合，傳遞信號(hào)激素受體與激素結(jié)合，傳遞信號(hào)激素生物大分子進(jìn)化重塑生長(zhǎng)激素和受體的相互作用

受體的SerAla進(jìn)化生物大分子進(jìn)化重塑生長(zhǎng)激素和受體的相互作用受體的Ser具體方法突變方法構(gòu)建分子庫(kù)導(dǎo)入噬菌體噬菌體展示放大體外挑選富集含目標(biāo)的噬菌體具體方法突變方法構(gòu)建分子庫(kù)導(dǎo)入噬菌體噬菌體展示放大體外結(jié)果得到5個(gè)氨基酸突變的生長(zhǎng)激素，受體和激素之間的相互作用提高了1000倍。改變蛋白質(zhì)之間的相互作用結(jié)果促紅細(xì)胞生成素

一種糖蛋白細(xì)胞因子，可以增加人體血液中紅細(xì)胞數(shù)量、提高血液含氧量的激素。適應(yīng)癥為腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血等。2003年全世界EPO的年銷(xiāo)售額超過(guò)50億美元。促紅細(xì)胞生成素一種糖蛋白細(xì)胞因子，可以增加人模擬蛋白質(zhì)藥物天然EPO不易得到，使用生物大分子進(jìn)化出新的蛋白質(zhì)，可與EPO受體互作。模擬蛋白質(zhì)藥物天然EPO不易得到，使用（2）抗水解多肽思路：D型多肽不容易被天然的水解酶水解。過(guò)程：先合成L型水解酶，建立多肽文庫(kù)；進(jìn)化得到目標(biāo)多肽；與D型水解酶作用，驗(yàn)證效果。（2）抗水解多肽思路：D型多肽不容易被天然的水解酶水解。9.8.3核酸適配體的應(yīng)用核酸適配體由單鏈DNA或RNA組成，形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以特異識(shí)別某種分子。適體庫(kù)能識(shí)別分子，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、細(xì)胞、小分子。9.8.3核酸適配體的應(yīng)用核酸適配體由單鏈DNA或RNA組體外挑選方法尋找核酸適配體1.合成寡聚核苷酸2.建立適體庫(kù)3.固定蛋白將能與之結(jié)合的核酸適配體收集4.測(cè)序得到需要的核酸適配體步驟體外挑選方法尋找核酸適配體步驟湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

以納米和分子水平上的生化分析、化學(xué)與生物傳感技術(shù)、生命科學(xué)中的新分析技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)等為主要研究方向。

湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以納王柯敏教授課題組在核酸適配體的腫瘤活體熒光分子成像研究一種針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白的發(fā)夾型激活式核酸適配體探針，顯著提高腫瘤細(xì)胞成像反差、縮短檢測(cè)時(shí)間，成功用于裸鼠腫瘤活體實(shí)時(shí)熒光成像。王柯敏教授課題組在核酸適配體的腫瘤活體熒光分子成像研究本章重點(diǎn)

DNA文庫(kù)的突變方法定點(diǎn)誘變DNAShuffling原理綠色熒光蛋白分子進(jìn)化過(guò)程體外挑選方法尋找核酸適配體步驟本章重點(diǎn)DNA文庫(kù)的突變方法謝謝!謝謝!第9章生物大分子進(jìn)化第9章生物大分子進(jìn)化內(nèi)容自然界生物大分子進(jìn)化1生物大分子進(jìn)化方法2生物大分子進(jìn)化的概念和思路3分子多樣性的建立4內(nèi)容自然界生物大分子進(jìn)化1生物大分子進(jìn)化方法2生物大分子進(jìn)化

分子庫(kù)的放大5標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子6挑選和篩選7應(yīng)用實(shí)例8分子庫(kù)的放大5標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子6挑選和篩選7應(yīng)用實(shí)例89.1自然界的生物大分子進(jìn)化達(dá)爾文(1809～1882)

出生于英國(guó)西部一個(gè)世代為醫(yī)的家庭。乘貝格爾號(hào)艦作了歷時(shí)5年的環(huán)球航行，對(duì)動(dòng)植物和地質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了大量的觀察和采集。

9.1自然界的生物大分子進(jìn)化達(dá)爾文(1809～1882)

19世紀(jì)中期，達(dá)爾文，在物種起源書(shū)中提到了進(jìn)化論。物種進(jìn)化的兩個(gè)因素：遺傳突變自然選擇19世紀(jì)中期，達(dá)爾文，在物種起源遺傳突變自然選擇：

環(huán)境條件對(duì)于生物的變異進(jìn)行選擇而導(dǎo)致適者生存、不適者被淘汰的過(guò)程。

自然選擇：

突變不被淘汰突變不被淘汰遺傳信息儲(chǔ)存在基因組中；基因組序列在自然情況下存在隨機(jī)突變概率；突變可遺傳給子代；增加種群的基因多樣性。遺傳信息儲(chǔ)存在基因組中；優(yōu)勢(shì)基因頻率增加進(jìn)化

自然選擇優(yōu)勢(shì)基因頻率增加進(jìn)化自然選擇生物大分子進(jìn)化DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的功能從無(wú)到有從簡(jiǎn)單到復(fù)雜從低級(jí)到高級(jí)生物大分子進(jìn)化DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的功能自然界的生物大分子多樣性和RNA世界假說(shuō)自然界的生物大分子多樣性和RNA世界假說(shuō)生物大分子的進(jìn)化基因數(shù)量龐大RNA剪切，表達(dá)產(chǎn)生不同的蛋白蛋白質(zhì)剪切酶將蛋白質(zhì)連接在一起；翻譯后修飾；多樣性生物大分子的進(jìn)化基因數(shù)量龐大多樣性RNA世界假說(shuō)

DNARNA蛋白質(zhì)RNA世界假說(shuō)DNARNA蛋白質(zhì)

1981年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者吉爾伯特（W.Gilbert）提出了“RNA世界”的假說(shuō)。指的是“在生命起源的某個(gè)時(shí)期，生命體僅由RNA組成。遺傳信息的傳遞建立于RNA的復(fù)制，其復(fù)制機(jī)理與當(dāng)今DNA復(fù)制機(jī)理相似，作為生物催化的、由基因編碼的蛋白質(zhì)還不存在”。

1981年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者吉爾伯特（W.容易發(fā)生突變，因此在攜帶遺傳信息的能力方面，RNA不如DNA；RNA又由于組成沒(méi)有蛋白質(zhì)復(fù)雜，不可能形成如蛋白質(zhì)那么多樣的結(jié)構(gòu)，因此在功能分子的作用方面，RNA又不如蛋白質(zhì)。容易發(fā)生突變，因此在攜帶遺傳信息的能力方面，RNA不如DNA

RNA可自我復(fù)制RNA具有催化功能RNA可自我復(fù)制當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)功能完善后RNA分子才被取代當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)功能完善后喬伊斯，ScrippsResearchInstitute所長(zhǎng)

發(fā)現(xiàn)了一對(duì)短小但功能強(qiáng)大的RNA序列，把它們和一堆結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單的RNA“原料”混在一起.結(jié)果：數(shù)量會(huì)不斷倍增，幾小時(shí)內(nèi)就能擴(kuò)增至原來(lái)的10倍，而且只要有充足的原料和空間，這種擴(kuò)增過(guò)程就不會(huì)停止。

喬伊斯，ScrippsResearchInstitut問(wèn)題RNA又是怎么產(chǎn)生的？問(wèn)題RNA又是怎么產(chǎn)生的？9.2化學(xué)生物學(xué)中的生物大分子進(jìn)化方法自然界進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)：生物多樣性豐富，種群巨大；生物本身調(diào)控系統(tǒng)精密；缺點(diǎn)：不能定向突變；突變概率低；周期長(zhǎng)。9.2化學(xué)生物學(xué)中的生物大分子進(jìn)化方法自然界進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)：分子庫(kù)擴(kuò)增9.3生物大分子進(jìn)化的基本概念和思路多樣化分子進(jìn)化目標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)篩選分子庫(kù)擴(kuò)增9.3生物大分子進(jìn)化的基本概念和思路多樣化分子自然界生物大分子放大文庫(kù)分子篩選目標(biāo)分子自然界生物大分子放大文庫(kù)分子篩選目標(biāo)分子9.4分子多樣性的建立分子多樣性的建立是生物大分子進(jìn)化的基礎(chǔ)。DNA穩(wěn)定性好；易操作；通過(guò)改變條件和模板就能得到不同序列和結(jié)構(gòu)的DNA；可以轉(zhuǎn)錄和翻譯變成RNA和蛋白質(zhì)。9.4分子多樣性的建立分子多樣性的建立是生物大分子進(jìn)化DNA文庫(kù)的突變方法基因組隨機(jī)突變易錯(cuò)PCR定點(diǎn)突變DNA改組法DNA文庫(kù)的突變方法9.4.1基因組的隨機(jī)突變法方法：天然隨機(jī)突變物理化學(xué)誘變化學(xué)：羥胺、溴乙錠、烷基化試劑、強(qiáng)氧化劑等。物理：放射性誘變（紫外線）。9.4.1基因組的隨機(jī)突變法方法：天然隨機(jī)突變紫外線突變頻率10～10天然突變頻率10～10-4-9-9-10基因組的隨機(jī)突變法缺點(diǎn)不能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的突變紫外線突變頻率10～10-4-9-9-10基因組的隨機(jī)關(guān)鍵突變頻率的選擇突變頻率太高會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯瑹o(wú)法篩選到有益突變;突變頻率太低則會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)中全是野生型群體。關(guān)鍵突變頻率的選擇9.4.2易錯(cuò)PCR

采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，來(lái)改變擴(kuò)增過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。9.4.2易錯(cuò)PCR采用DNA聚合酶生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件條件

高鹽和添加劑存在的條件下，聚合酶的PCR的反應(yīng)錯(cuò)誤率可達(dá)0.7%。具體方法如提高鎂離子濃度、加入錳離子；改變體系中四種的dNTPs濃度；運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等。條件9.4.3定點(diǎn)誘變

在體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一個(gè)特定堿基的技術(shù)。分類(lèi)：定點(diǎn)突變、盒式定點(diǎn)突變、PCR突變。9.4.3定點(diǎn)誘變?cè)隗w外特異性地取代定點(diǎn)突變ＡＡＧＣＧ定點(diǎn)突變ＡＡＧＣＧ盒式定點(diǎn)誘變文庫(kù)分子盒式定點(diǎn)誘變文庫(kù)分子

定點(diǎn)突變文庫(kù)篩選定9.4.4DNA改組DNAShuffling是運(yùn)用隨機(jī)突變技術(shù)，對(duì)某種感興趣的蛋門(mén)質(zhì)或核酸進(jìn)行快速的改造，并定向選擇所需性質(zhì)的生物分子。

9.4.4DNA改組DNAShuffling原理單個(gè)基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片段。無(wú)引物PCR，具有互補(bǔ)3’末端的片段互為引物，各為模板，通過(guò)不斷的PCR循環(huán)在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合并進(jìn)一步延伸。最后利用基因兩端序列為引物合成全長(zhǎng)的重排產(chǎn)物，這些重排產(chǎn)物的集合被稱(chēng)為突變文庫(kù)。對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體進(jìn)行下一輪shuffling循環(huán)，重復(fù)多次重排和篩選，直到最終獲得性狀比較理想的突變體。原理單個(gè)基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片進(jìn)行定向進(jìn)化的生物活性分子可以是那些由于毒性太大而無(wú)法大劑量使用的蛋白質(zhì)藥物;可以是基因治療載體和基因藥物等核酸分子。進(jìn)行定向進(jìn)化的生物活性分子示意圖示意圖FamilyshufflingFamilyshufflingDNA改組成功與否取決于三個(gè)因素：相關(guān)基因組中基因的相似程度;酶切產(chǎn)生的DNA片段小大;退火溫度。

DNA改組成功與否取決于三個(gè)因素：優(yōu)點(diǎn)人工理性設(shè)計(jì)DNAShuffling隨機(jī)性優(yōu)點(diǎn)人工理性設(shè)計(jì)DNAShuffling隨機(jī)性同序比對(duì)同序比對(duì)9.5分子庫(kù)的放大構(gòu)建出的文庫(kù)分子的拷貝數(shù)不高需要放大一鍋法

DNA：PCRRNA：RT-PCR9.5分子庫(kù)的放大構(gòu)建出的文庫(kù)分子的拷貝數(shù)不高PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNART-PCRRNA9.6標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子

蛋白質(zhì)是生物體功能實(shí)現(xiàn)的載體，蛋白質(zhì)分子不能直接放大。

需要對(duì)其標(biāo)記和區(qū)分放大9.6標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)是生物體功能方法

目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因與特殊的表達(dá)生物體結(jié)合，通過(guò)表達(dá)將蛋白質(zhì)展示出來(lái)。方法目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因與特殊的表達(dá)生物體結(jié)合，通

細(xì)胞展示噬菌體展示

具體方法核糖體展示

mRNA展示

細(xì)胞展示噬菌體展示具體核糖體展示mRNA展示9.6.1細(xì)胞展示將含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中；挑選單克隆；誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；通過(guò)特定的選擇系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇。9.6.1細(xì)胞展示將含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件缺點(diǎn)：文庫(kù)的量很小；不能精確控制；缺點(diǎn)：9.6.2噬菌體展示

將目標(biāo)蛋白的基因與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達(dá)在噬菌體表面的方法。9.6.2噬菌體展示將目標(biāo)蛋白的基因與噬菌體外殼噬菌體感染細(xì)菌的病毒。噬菌體顆粒感染一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后可迅速生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒，每個(gè)子代顆粒又可感染細(xì)菌細(xì)胞，再生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒。如此重復(fù)只需4次，一個(gè)噬菌體顆粒便可使幾十億個(gè)細(xì)菌感染而死亡。

噬菌體生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件9.6.3核糖體展示

蛋白及其mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白展示在核糖體表面，將基因型和表型聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)含有mRNA的標(biāo)簽可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行放大。9.6.3核糖體展示蛋白及其mRNA同時(shí)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件

mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物文庫(kù)方便的對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行選擇處理，通過(guò)親和篩選的方法富集含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的復(fù)合物，后對(duì)其進(jìn)行放大操作。缺點(diǎn)：不是很穩(wěn)定mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物文庫(kù)ribosomedisplayribosomedisplay9.6.4mRNA展示

mRNA展示技術(shù)一種新興的體外多肽篩選技術(shù)?？梢赃\(yùn)用于生物分子配體的發(fā)現(xiàn)和相互作用的分析。

9.6.4mRNA展示原理

嘌呤霉素是一種分子質(zhì)量小、化學(xué)性質(zhì)為穩(wěn)定的氨酰tRNA類(lèi)似物。當(dāng)3‘端帶有嘌呤霉素連接子的mRNA在體外翻譯系統(tǒng)中完成翻譯時(shí)，嘌呤霉素模擬tRNA末端的氨?；Y(jié)構(gòu)，進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)，抑制了蛋白質(zhì)的翻譯，在新生肽鏈和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之間形成穩(wěn)定的酰胺鍵，使mRNA的3’端與多肽的羧基端共價(jià)結(jié)合起來(lái)。

原理嘌呤霉素是一種分子質(zhì)量小、化學(xué)性質(zhì)為穩(wěn)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件9.7挑選和篩選分類(lèi)：體內(nèi)Invivo、體外Invitro篩選：對(duì)文庫(kù)的每一個(gè)分子都進(jìn)行嘗試，找出目標(biāo)。挑選：不需對(duì)文庫(kù)的每一個(gè)分子都進(jìn)行嘗試，只需要設(shè)定一個(gè)條件，符合條件的分子將被挑選出。9.7挑選和篩選分類(lèi)：體內(nèi)Invivo、體挑選和篩選的比較體內(nèi)體外篩選比較樣品的顏色、熒光等物理化學(xué)性質(zhì)讓細(xì)胞產(chǎn)生各種顏色、熒光或具有放射性等挑選如共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合在某固定相表面只表達(dá)了特異蛋白的細(xì)胞才能存活挑選和篩選的比較體內(nèi)體外篩選比較樣品的顏色、熒光等物理化學(xué)性10文庫(kù)大小篩選：10挑選：10～10515挑選流程10文庫(kù)大小515挑選流程篩選挑選優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單快速缺點(diǎn)耗時(shí)需建立體系篩選挑選Conclusion定向進(jìn)化=突變

+

篩選

ConclusionGene/genescodingforenzymesofinteresting突變Poolofmutantgenes轉(zhuǎn)化宿主菌篩選單一突變基因的克隆好的突變進(jìn)行下一輪突變突變的優(yōu)良基因酶的生產(chǎn)和性質(zhì)改進(jìn)重復(fù)定向進(jìn)化Gene/genescodingforenzymes9.8生物大分子進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例9.8.1自然改進(jìn)型分子進(jìn)化

（1）綠色熒光蛋白2008年諾貝爾獎(jiǎng)錢(qián)永健9.8生物大分子進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例9.8.1自然改進(jìn)型分子進(jìn)下村修下村修錢(qián)永健

1994年，開(kāi)始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。世界上用的大多數(shù)是錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的黃色、藍(lán)色，有的可激活、可變色。錢(qián)永健1994年，開(kāi)始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件綠色熒光蛋白分子進(jìn)化DNA改組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞展示體外篩選綠色熒光蛋白分子進(jìn)化DNA改組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)改進(jìn)后效果發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)45倍；激發(fā)光和發(fā)射光單色性有改善；進(jìn)化出了黃色、紅色等蛋白。改進(jìn)后效果發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)45倍；生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件生物大分子進(jìn)化總結(jié)課件雙內(nèi)含肽系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)原理內(nèi)含肽1:SynechocystisspDnaBintein內(nèi)含肽2:MycobacteriumxenopiGyrAintein

雙內(nèi)含肽系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)原理內(nèi)含肽1:Synechocys23℃pH7.0GFPmut3*雙內(nèi)含肽蛋白純化過(guò)程

DTT上柱剪切洗脫15℃+IPTG

4℃幾丁質(zhì)柱剪切23℃pH7.0GFPmut3*雙內(nèi)含肽蛋白純化過(guò)程D含cGFPmut3*表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場(chǎng)熒光疊加

優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)溫度：15℃含cGFPmut3*表達(dá)的E.coli激光共聚焦照片含GFPmut3*內(nèi)含肽融合前體表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場(chǎng)熒光疊加含GFPmut3*內(nèi)含肽融合前體表達(dá)的E.coli激光共親和純化得到的GFPmut3*SDS電泳圖Lane1:蛋白MarkerLane4:Lane3上清液通過(guò)幾丁質(zhì)柱液后的溶液Lane2:誘導(dǎo)前的細(xì)胞粗提液Lane5:柱上洗脫的目的蛋白Lane3:IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞破碎

Yield：2.41mg\LPurity：>95%

親和純化得到的GFPmut3*SDS電泳圖純化的GFPmut3*的光譜學(xué)特性

GFPmut3*的熒光光譜Ex=502nmEm=511nmGFPmut3*的紫外吸收光譜

純化的GFPmut3*的光譜學(xué)特性GFPmut3GFP的結(jié)構(gòu)示意圖