雜交瘤細(xì)胞的純化_第1頁
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文檔簡介

雜交瘤細(xì)胞的純化原理與方法雜交瘤細(xì)胞的篩選未融合的免疫細(xì)胞在培養(yǎng)6~10天后會(huì)自行死亡；異型多核細(xì)胞分裂不正常，培養(yǎng)過程中也會(huì)死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞因其生長快不利于雜交瘤細(xì)胞生長，所以要將雜交瘤細(xì)胞篩選出。脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長期存活不能長期存活雜交瘤細(xì)胞的篩選HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選原理細(xì)胞DNA合成有兩條途徑：從頭合成途徑補(bǔ)救合成途徑

從頭合成途徑即利用糖和氨基酸這些可從培養(yǎng)液中攝取的簡單的含碳、含氮復(fù)合物來合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。這一過程需四氫葉酸參與供甲基及甲酰基，因此該途徑可被葉酸拮抗物氨基喋呤（A）阻斷。補(bǔ)救合成途徑細(xì)胞可通過次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），將核苷酸前體合成核苷酸以供DNA合成的原料。DNA的生物合成途徑與HAT選擇培養(yǎng)基ATHIMPDNA核苷酸

糖和氨基酸TMPHGPRTTK核苷酸前體H—hypoxanthine（次黃嘌呤）

A—aminopterin（氨基喋呤）

T—thymidine（胸腺嘧啶核苷）實(shí)驗(yàn)所用骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT缺陷（HGPRT-）和TK缺陷（TK-）細(xì)胞，不能利用培養(yǎng)基中的H和T，且未融合骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，所以未融合骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中生長。未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長期存活而死亡。脾細(xì)胞和脾細(xì)胞自身融合的細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基上正常生活,但不能增殖,所以經(jīng)過數(shù)代后,HAT培養(yǎng)基上沒有脾細(xì)胞和脾細(xì)胞自身融合的細(xì)胞。只有雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。骨髓瘤細(xì)胞：HGPRTˉ或TKˉ

死亡脾細(xì)胞：HGPRT+，TK+

存活但短命雜交瘤細(xì)胞：HGPRT+，TK+

存活篩選方法

骨髓瘤細(xì)胞死亡

融合后的混合物HAT培養(yǎng)基未融合的

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