酪氨酸酶的粗提取,分離純化、純度鑒定及活性測定

西安交通大學(xué)實驗報告西安交通大學(xué)實驗報告課程： 專業(yè)班級：組別姓名：學(xué)號同組者：成績實驗日期：2012年月日交報告日期：2102年月日報告退發(fā)：（訂正、重做）教師審批簽字：實驗名稱：酪氨酸酶的粗提取、分離純化、純度鑒定及活性測定實驗?zāi)康模鹤孕胁殚嗁Y料，選取原材料，設(shè)計合理的酪氨酸酶提取、分離、純化鑒定以及活性測定的方案；按照實驗方案，自主進(jìn)行實驗并對實驗方案進(jìn)行評價和改進(jìn)；通過酪氨酸酶的分離過程，了解并熟悉生物工程下游分離工程的一些常規(guī)操作；對實驗結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，分析和匯總展示，培養(yǎng)分析問題和自我展示的能力。實驗原理：酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。與生物體黑色素的合成直接相關(guān)。近年來，有學(xué)者已經(jīng)從各種植物中提取得到酪氨酸酶，如馬鈴薯，蘑菇，香蕉，蘋果，桑葉以及香樟等。相關(guān)資料顯示，L-多巴和鄰苯二酚測定體系都說明香蕉，馬鈴薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性較高。因此，本實驗選取香蕉為實驗原材料，通過簡單的提取分離以及純化，初步得到了酪氨酸酶的樣品（溶液），并用鄰苯二酚為底物對其活性做了定性鑒定。酪氨酸酶的粗提取包括研磨（勻漿），過濾，離心，鹽析和透析等過程。鹽析蛋白質(zhì)在高離子強度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象。隨著溶液中離子強度的增大，蛋白質(zhì)表面的雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。同時由于鹽的水化作用使蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)附近的水化層脫離蛋白質(zhì)，暴露出來，增大了蛋白質(zhì)表面的疏水相互作用，容易發(fā)生凝集，進(jìn)而沉淀。鹽析的方法有Ks鹽析法

和B鹽析法，前者是改變體系的離子強度，而后者的則通過改變溫度和pH實現(xiàn)。由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化十分敏感，所以常采用Ks鹽析法。常用的鹽有硫酸銨等。通過查閱資料，本實驗中采用飽和度為55%的硫酸銨進(jìn)行酪氨酸酶的鹽析沉淀。透析是一種膜分離的方法，利用的是濃度引起的自由擴散，在透析袋內(nèi)盛放鹽析后酪氨酸酶的溶解液，放入緩沖液內(nèi)透析，目的是除去鹽析過程帶入的離子。透析袋在使用前一般需要進(jìn)行預(yù)處理。通過以上操作可得到酪氨酸酶的粗酶液。粗酶液需要進(jìn)一步的分離純化。離子交換色譜法是一種利用離子交換劑作為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫色譜法。離子交換色譜法洗脫的方式有恒定洗脫，線性梯度洗脫和逐次洗脫的方式。使用離子交換色譜時，首先需要填充固定相，如果是干粉還需要溶脹，填充的色譜柱不能有氣泡，否則會影響分離結(jié)果。上樣前需要先用上樣緩沖液平衡，上樣后需要用有一定離子強度的洗脫液洗脫，獲得蛋白質(zhì)樣品。經(jīng)離子交換色譜柱純化后的樣品還可以繼續(xù)純化。由于實驗條件和時間的限制，本實驗的純化僅進(jìn)行到離子交換色譜一級。對于純化后的樣品，首先需要對其純度進(jìn)行鑒定，純度鑒定采用SDS（聚丙烯酰胺凝膠電泳）來驗證。由于鄰苯二酚在酶和氧的條件下轉(zhuǎn)變成鄰苯醍的速率很快，故可測定鄰苯二酚轉(zhuǎn)變成鄰苯醍的速率而測定酶的活性（可用411nm處的吸光度對時間作圖，從所得的直線斜率求酶的活性）。實驗設(shè)計的思路可以用如下流程圖表示：研厝"過濾離心研厝"過濾離心平衡上樣洗脫酪氨酸酶

的粗提取離子交換色

譜分離純化凝膠色譜

施化鹽析透析SDS電泳酪氨酸醇活

牲的測定酪氨酸酶純

度的簽定酪氨酸酶

的粗提取離子交換色

譜分離純化凝膠色譜

施化鹽析透析SDS電泳酪氨酸醇活

牲的測定酪氨酸酶純

度的簽定實驗器材及材料：冰箱，天平，勻漿器，紗布，燒杯100ml,250ml,500ml各1個）,試管20個，5810R離心機，精密pH試紙，透析袋（截留分子量8000-14000，寬20mm），鑷子，電泳槽，梳子，電泳儀，小型搖床，大培養(yǎng)皿，電爐，手套，口罩，50ml離心管，渦旋儀，1.5mlep管，量筒（10ml，100ml，500ml各一個），濾紙，移液槍（10|il，200|il，1000|il），槍頭（1000|ll，200|il，10|il），陰離子交換柱，離子交換色譜儀，Ultrospec2100pro紫外可見分光光度計，石英比色皿；實驗原材料：香蕉2.5kg；pH7.5Tris-HCl緩沖液（0.1mol/L）；硫酸銨（需要配成飽和溶液）；lmmoI/LEDTA-Na2,2%碳酸氫鈉；0.02mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）；30%凝膠儲液，1.5mol/LTris-HCL（pH8.8），1mol/LTris-HCL（pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，蒸餾水，2X樣品溶解液，5X電泳緩沖液，考馬斯亮藍(lán)染色液，脫色液，低分子蛋白marker，凡士林，鄰苯二酚，L-DOPA，pH7.2的磷酸鹽緩沖液：Na2HPO4，NaH2PO4。實驗內(nèi)容及步驟：（一）酪氨酸酶的粗提取將預(yù)先冷藏過的香蕉去皮，準(zhǔn)確稱量50g，加入50ml0.1mol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液，多次間歇性勻漿。勻漿后，倒出香蕉混合物，雙層紗布過濾，用0.1mol/LTris-HCl緩沖液沖洗紗布，收集濾液，棄殘渣物質(zhì)。將濾液分裝至50ml離心管內(nèi)，4r,4000r/min，離心10min，收集上清，棄沉淀和漂浮物。上清液分裝至50ml離心管內(nèi)，再次4r,4000r/min，離心10min，棄沉淀和漂浮物，收集上清液。在收集到的上清液內(nèi)加入飽和度為55%的硫酸銨，鹽析沉淀3h。用50ml離心管分裝，4r,4000r/min，離心10min，棄上清。每管內(nèi)各加入1000m0.02mol/L的Tris-HCI緩沖液（pH7.50），用移液槍槍頭慢慢吹打,使沉淀物充分溶解。取約10cm長的透析袋，浸沒于lmmoI/LEDTA溶液內(nèi)，煮沸3min，用鑷子取出，浸入2%碳酸氫鈉溶液中煮沸3min，再用鑷子取出，浸入蒸餾水中，煮沸3min，漂洗干凈。將處理過的透析袋的一端密封，加入上述各離心管內(nèi)的沉淀物溶解液，將另一端也密封后，置于0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液內(nèi)，使透析袋沒過液面。4c,透析48h，期間共換0.02mol/LTris-HCL緩沖液3次。透析除鹽后，即得粗酶液。在進(jìn)行下一步分離純化之前，需要進(jìn)行酶活性的定性鑒定。酶活性定性鑒定采用鄰苯二酚反應(yīng)體系進(jìn)行，即在一定物質(zhì)的量濃度的鄰苯二酚溶液內(nèi)加入少許粗酶液，振蕩片刻，同空白對照對比，看有無顯色。酪氨酸酶的分離純化(離子交換色譜)由于實驗前畢業(yè)生學(xué)長已經(jīng)裝好陰離子交換柱，所以實驗操作過程省去了裝柱的環(huán)節(jié)。啟動計算機，打開軟件PrimeView，開啟離子交換色譜儀。選擇手動模式(manual)。A、B進(jìn)液管均插入蒸餾水內(nèi)，設(shè)置A和B以1：1流入，流速4ml/min。待基線走平后，將A管插入0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液，B管插入含有0.5mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)，先設(shè)置B管流入，A管不流入，待鹽度曲線走平后，設(shè)置A管流入，B管不流入。待鹽度曲線下降并走平后，在load狀態(tài)下上樣，每次注入5ml，然后設(shè)置狀態(tài)為inj。期間流速一直保持4ml/min。上樣后在0.02molTris-HCl作用下，部分雜質(zhì)被洗下，在圖線上會出現(xiàn)吸收峰。待吸收曲線走平后，設(shè)置B管流入，A管不流入，用含0.5molNaCl的Tris-HCl進(jìn)行洗脫。隨著鹽度曲線的上升，蛋白質(zhì)吸收曲線也開始上升并出現(xiàn)吸收峰。對吸收峰以及附近的洗脫液進(jìn)行分管收集，按每管3ml進(jìn)行收集。對收集到的樣品液進(jìn)行酶活性的篩選，獲得有酶活性的試管?；旌蟨H6.0磷酸緩沖液1.4ml及0.1mol/L鄰苯二酚溶液1.0ml，再加入0.1ml各管收集到的酶液，記錄開始變色時間，將各管反應(yīng)半個小時以上，測最終吸光度值并記錄。離子交換色譜柱在使用過程中，要及時排盡進(jìn)液管A和B中的氣泡，否則會影響分離效果。酪氨酸酶純度的鑒定(SDS電泳)部分試劑的配制(稱量配制過程中要戴口罩，戴手套)：30%丙烯酰胺：稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加熱溶解于去離子水，定容至100ml，放入棕色試劑瓶內(nèi)，4C保存避光。1mol/LTris-HCl(pH6.8):稱取Tris12.11g，充分溶解于70ml去離子水，用稀HCl調(diào)節(jié)pH至6.8，定容至100ml，室溫保存。1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）:稱取Tris18.17g,充分溶解于70ml去離子水，用稀HCl調(diào)節(jié)pH至8.8，定容至100ml，室溫保存。10%SDS：稱取1.0gSDS，溶解于去離子水，定容至10ml，室溫保存。10%過硫酸銨（AP）:稱取過硫酸銨1.0g，溶解于去離子水，定容至10ml，分裝于Ep管中，-20°C冷凍保存。2x樣品溶解緩沖液:依次取12.5ml1mol/LTris-HCl（pH6.8），10ml甘油，2gSDS，1ml0-巰基乙醇，1mg漠酚藍(lán)，混合，用去離子水定容至50ml，分裝于Ep管中，-20C冷凍保存。5x電泳緩沖液：稱取Tris7.55g，甘氨酸36g，SDS2.5g，用ddH2O定容至500ml，室溫保存。考馬斯亮藍(lán)染液（R-250）:稱取0.5考馬斯亮藍(lán)R-250，先溶于60ml乙醇，再加入20ml乙酸，用ddH2O定容至200ml，室溫保存。脫色液：取60ml乙醇，20ml乙酸，混合后用ddH2O定容至200ml，室溫保存。組裝制膠裝置，安裝玻璃膠板（配制較低的電泳槽需要涂抹凡士林密封膠室），固定于電泳槽，插梳子，在梳子下緣約1cm處做標(biāo)記線，取下梳子。各試劑按照下列表格用量，先配制12%分離膠，10%AP與TEMED最后加入。加入TEMED后，迅速渦旋，用1000叫槍頭迅速灌入膠室內(nèi)，至標(biāo)記線處。加入約0.5cm厚的水層。等待分離膠凝固。試劑12%分離膠（ml）5%濃縮膠（ml）20ml體系5ml體系ddH2O6.63.430%聚丙烯酰胺8.00.831.5MTirs-HCl(pH8.8)5.0/1.0MTirs-HCl(pH6.8)/0.6310%SDS0.40.0510%AP0.40.05TEMED0.0080.0054.分離膠凝固后，倒去上層水，在分離膠面上加濃縮膠，充滿膠室，插入梳子。濃縮膠凝固后，在電泳槽上下兩端注滿1x電泳緩沖液（上槽加5x電泳緩沖液可加快電泳速度，節(jié)省電泳時間），然后小心緩慢取下梳子，用槍頭小心撥去膠板上緣多余的膠，小心調(diào)整彎曲的膠孔。處理樣品：用移液槍吸取各個酪氨酸酶樣10叫于小ep管內(nèi)，加入10叫2x樣品溶解緩沖液，混勻后沸水浴5min，低分子蛋白marker不沸水浴，不加2x樣品溶解緩沖液，用10B移液槍小心將各個樣品加入上樣孔內(nèi)。連接導(dǎo)線，80V電壓電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，上調(diào)電壓使電流不超過40mA為宜，當(dāng)指示劑到達(dá)距膠下緣時，停止電泳。用撬膠板小心撬開玻璃板，沿分離膠與濃縮膠界面，以及兩側(cè)與玻璃板的邊界切下，在膠面面對上樣的方向的右下角切下小角，保證識別方向?？捡R斯亮藍(lán)染液加入大培養(yǎng)皿。置于小型搖床上，調(diào)整轉(zhuǎn)速，染色過夜?；厥杖旧?，將染色后的膠片置于加入脫色液的大培養(yǎng)皿內(nèi)，置于搖床上，洗掉多余的染液，沒3h換一次脫色液，待膠片上多余的染液洗脫干凈后，將膠片取出，觀察電泳條帶。（四）酪氨酸酶活性的鑒定在石英比色皿內(nèi)加入pH6.0磷酸緩沖液1.4ml及0.2mol/L鄰苯二酚溶液1.0ml，混勻。將石英比色皿放入Ultrospec2100pro紫外可見分光光度計內(nèi)，迅速加入0.1ml所得酪氨酸酶液，在411nm處，每隔一分鐘測定一次，繪出吸光度對時間的變化曲線。從曲線斜率求酶的活性。實驗結(jié)果及分析：（一）粗酶液活性的定性測定結(jié)果在一定物質(zhì)的量濃度的鄰苯二酚溶液內(nèi)加入少許粗酶液，振蕩片刻，同空白對照對比，呈現(xiàn)深黃色，顏色變化明顯，說明粗酶液有活性，可以使用離子交換色譜法分離純化。圖1.粗酶液有活性

（二）酪氨酸酶的分離純化結(jié)果離子交換色譜分離過程中，蛋白質(zhì)紫外吸收吸收曲線如圖2所示，可以看出，雜蛋白吸收峰很低，說明雜蛋白含量很低。而酪氨酸酶吸收峰也不是十分可觀，說明所得酪氨酸酶濃度偏低。n ijvrTiAucond p-i PressureTe140120-^.1il-T"I:FSO-:::100n ijvrTiAucond p-i PressureTe140120-^.1il-T"I:FSO-:::10060-一尊一員一苗墨El-B-r—L離戔-?9-08ZM營T一：*!■■.“..?磚一Hg巨展..:務(wù)-J'llLA?.■..:*?-J'llLsmg-?.■..一：l::=?;..L悟里二&s§、E_”』?，.： UEE^1479ir-iinFlow40iril/miriminPeuwQ。孫00&二"P中I51中國標(biāo)推時間（MesI]44SflminFlowCl0ml.i'min4484minMongol5etCcncemlrcrtlDnEd:汨_4萼4mmConijnije2000-6-7..17:-45:05中國標(biāo)？時間（MonuBd]4司8。ininFlow40iril/miri MNaw?kd-i [UtankHadN：ptiri.449BminPbuw0Xi20CO^7.V^51? MNaw?kd-i [UtankHadN：ptiri.ForHdp,pibibrI. 4P->.l>=-Ham圖2.離子交換色譜蛋白質(zhì)紫外吸收吸收曲線（圖中藍(lán)線）按照吸收峰，初步判斷13-25號管內(nèi)含有酪氨酸酶，將其分裝并冷凍保存。混合pH6.0磷酸緩沖液1.4ml及0.1mol/L鄰苯二酚溶液1.0ml，再加入0.1ml各管收集到的酶液，記錄開始變色時間，將各管反應(yīng)半個小時以上，測最終吸光度值并記錄如表一。按照開始變色時間及最終吸光度的值，可以判斷13、14、21-25號管基本無酶活性。17號管內(nèi)的酶活性最強，18、19號管次之。管號151617181920開始變色時間/min553344.5吸光光度值（411nm）0.2260.2780.4230.3230.3280.180表一.以鄰苯二酚為底物反應(yīng)篩選有酶活性的試管

通過多次SDS電泳，沒有得到蛋白質(zhì)電泳條帶（隱隱約約，依稀可見。分析原因可能為所的樣品中酪氨酸酶雖然活性較高，但濃度較低所致。三次蛋白電泳條帶結(jié)果如圖4。由于每次SDS同其他一起進(jìn)行并共用膠片，操作條件一致，所以排除操作因素引起的誤差。圖4.三次蛋白電泳條帶圖（圖中空白皆為我組結(jié)果）（四）酪氨酸酶活性的鑒定結(jié)果根據(jù)實驗所得吸光度隨時間的變化曲線可知，17號管，即經(jīng)過純化的酶液的活性較高，且高于粗酶液。其中，17號管吸光度隨時間變化曲線斜率為0.033,粗酶液為0.02。時間/min0.51.52.53.54.55.56.57.58.59.510.517號管od4110.2830.3910.4750.5390.5850.6170.6370.6490.6540.6530.648粗酶液od4110.2300.4990.6300.6930.7150.7130.6960.6700.6410.6090.580表二.酪氨酸酶活性鑒定數(shù)據(jù)記錄

圖5.粗酶液和鄰苯二酚反應(yīng)體系吸光度值隨時間的變化曲線圖6.17號管酪氨酸酶和鄰苯二酚反應(yīng)體系吸光度隨時間變化曲線（五）實驗思考和改進(jìn)鹽析的過程僅僅以文獻(xiàn)查得數(shù)據(jù)進(jìn)行，設(shè)計過于簡單，致使實驗粗糙，提取得到的酪氨酸酶酶濃度過低，應(yīng)該在實驗中設(shè)對照實驗，選取最佳鹽濃度，并采用分級沉淀，達(dá)到更好的鹽析效果。由