大腦皮層中的神經(jīng)代謝耦合反映突觸活動多于峰電活動

大腦皮層中的神經(jīng)代謝耦合反映突觸活動多于峰電活動在非侵害性的神經(jīng)成像中，神經(jīng)活動由脫氧血紅蛋白的局部波動來推斷。功能性磁共振成像（fMRI）的根本問題是推斷的神經(jīng)活動主要是由突觸活動還是峰電活動來推動。答案對fMRI中血氧水平依賴性（BOLD）信號的解釋來說非常關(guān)鍵。本文中我們使用固定的視覺系統(tǒng)電路來產(chǎn)生一個刺激，以引發(fā)沒有刺波發(fā)放關(guān)聯(lián)的突觸活動。在貓初級視覺皮層的神經(jīng)和代謝活動記錄中，我們觀察到：沒有峰電時局部場電位（LFPs）和組織氧濃度改變間存在強(qiáng)耦合。這些結(jié)果顯示：BOLD信號與突觸活動耦合更緊密。BOLDfMRI已經(jīng)成為基礎(chǔ)和應(yīng)用神經(jīng)科學(xué)的中心工具，因?yàn)樗峁┝舜竽X中神經(jīng)激活的非侵害性圖像。然而，BOLD信號不能直接度量神經(jīng)活動，但它能度量脫氧血紅蛋白（dHb）聚集處的局部波動1-5。由于技術(shù)進(jìn)步改進(jìn)了fMRI的空間分辨率，fMRI在定量BOLD信號和其推斷的神經(jīng)活動間的相互關(guān)系方面日益重要6，7。特別地，BOLD信號主要反映神經(jīng)元輸入（突觸活動）還是神經(jīng)元輸出（放電活動）仍然是不清楚的。使用已知的視覺路徑的顯著性質(zhì)，我們能把這兩種量度分開來確定它們在組織氧含量改變中的相對作用。通過氧—血紅蛋白解離曲線和組織中的局部氧濃度梯度發(fā)現(xiàn)組織氧含量和dHb相關(guān)。另外，BOLD信號和組織氧含量同樣受腦血容量（CBV），腦血流量（CBF）和氧消耗（腦中氧氣的代謝率，CMRO2）改變的影響8-10。因此，組織氧含量改變暗示了BOLD信號中類似的改變的假設(shè)是合理的。我們以前已經(jīng)使用了一個二元顯微電極（UnisenseA/S）來對腦皮層的細(xì)胞外的相同區(qū)域進(jìn)行組織氧含量和神經(jīng)活動的同步測量11。這種技術(shù)允許我們在亞毫米水平上檢測神經(jīng)代謝耦合。Clark型極譜氧傳感器測量氧壓的改變，在測量范圍內(nèi)氧分壓與組織氧含量線性相關(guān)12。這些細(xì)胞外相同區(qū)域神經(jīng)元活動同步測量以多單位放電活動（MUA）和局部場電位（LFPs）的形式記錄，這些測量通常被認(rèn)為來測量突觸活動13-18。這種方法的一個優(yōu)點(diǎn)就是測量的分辨率高，這樣我們能用來觀察視覺刺激的細(xì)微處理對組織氧反應(yīng)的影響。結(jié)果組織氧含量和LFPs的時間頻率調(diào)諧我們先前的研究主要集中在視覺刺激的空間性能。現(xiàn)在的研究中，我們使用時間特性來分辨突觸和放電活動，如下所述。為了建立這種分辨方法的基礎(chǔ)，我們進(jìn)行了預(yù)備試驗(yàn)來驗(yàn)證組織氧反應(yīng)和LFP反應(yīng)中都存在時間頻率調(diào)諧。典型的貓初級視皮層到色質(zhì)中的組織氧，MUA和LFP以四個時間頻率在刺激（圖1）。組織氧反應(yīng)的正峰振幅從20Hz時變化13.33%到4Hz時變化22.97%。MUA反應(yīng)在500Hz和8Hz之間用帶通濾波器過濾，反應(yīng)強(qiáng)度通過記錄平均誘導(dǎo)放電頻率并扣除自發(fā)頻率來確定（平均放電頻率間隔時間在30-44s之間）。測定的MUA平均值從20Hz時每秒放電3.65次到4Hz時每秒放電26.05次。LFP反應(yīng)在0.7Hz到170Hz之間用低通濾波器過濾，頻帶定義如下：δ（0.7-4Hz），θ（4-8Hz），α（8-12Hz），β（12-25Hz），γL（25-90Hz），γH（90-170Hz）。這些頻帶的頻率根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)選定19，20。功率可調(diào)作為測定LFP反應(yīng)強(qiáng)度的一種方法?？烧{(diào)功率通過測定每個頻率的功率來計(jì)算，用平均基線功率劃分（刺激開始前1s），并計(jì)算頻帶的總和。γL頻帶總的可調(diào)功率從20Hz時67.32dB延伸到4Hz時77.11dB。圖1.組織氧，MUA和LFP反應(yīng)的時間頻率調(diào)諧。組織氧，MUA和LFP信號（6個點(diǎn)±1s.e.m處的平均值）跨越四個時間頻率（1，4，10和20Hz）的用最大響應(yīng)（實(shí)驗(yàn)的平均值）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。組織氧反應(yīng)（O2）以百分?jǐn)?shù)形式用平均正峰振幅來表示。MUA反應(yīng)以刺激存在時平均放電頻率減去平均自發(fā)頻率表示。LFP反應(yīng)表示所有頻帶（δ，θ，α，β，γL和γH）總和的可調(diào)頻率。組織氧反應(yīng)有兩部分（圖1）。初始負(fù)部分，或者是初始下降峰，被認(rèn)為與CMRO2的改變有關(guān)9，21，但是延遲的正部分，或者說正峰，表明CBF的變化9，13，15。在神經(jīng)，血管和代謝反應(yīng)的共同測量中必須要考慮的一個因素就是它們發(fā)生在完全不同的空間范圍內(nèi)。我們假定LFPs集中于2-3mm2范圍，MUA集中于300-800μm2（文獻(xiàn)22，23）。相應(yīng)地，CBF的增加被認(rèn)為是一個面積約2mm2的總和（文獻(xiàn)21），但是CMRO2的變化似乎位于一個面積約為200μm2的范圍（文獻(xiàn)11）。本文中，我們通過以百分?jǐn)?shù)形式計(jì)算正峰的振幅來確定組織氧反應(yīng)的數(shù)量。這是基于估計(jì)CBF和LFP空間范圍的測量方法。MUA，組織氧和所有的LFP頻帶對1-Hz時間頻率刺激的反應(yīng)（圖1）是強(qiáng)烈的。通過測量對4-Hz的刺激同樣強(qiáng)烈。反應(yīng)強(qiáng)度的一致性在更高時間頻率下開始減弱。在10Hz時，MUA輕微減小并且和組織氧反應(yīng)的強(qiáng)度的差異增加。本文中，在α到γH頻帶（8-170Hz）的反應(yīng)明顯比組織氧和MUA反應(yīng)的高（t檢驗(yàn)，P=0.025-0.0497；β反應(yīng)與組織氧沒有明顯不同，t檢驗(yàn)，P=0.0513）。差異在20Hz時變得更加顯著，當(dāng)MUA反應(yīng)強(qiáng)烈減弱時，就像低LFP頻帶的反應(yīng)一樣。然而，組織氧和γL頻帶反應(yīng)仍然很強(qiáng)。這和先前研究一致，先前研究主要研究了LFP時間頻率調(diào)諧24。對這些點(diǎn)，在組織氧和γ頻帶活動之間的耦合獨(dú)立于時間頻率，和組織氧與MUA之間的關(guān)系不同。放電活動和突觸活動的不相關(guān)已經(jīng)確定了在組織氧和LFP反應(yīng)中存在時間頻率調(diào)諧，我們進(jìn)行了使放電活動和突觸活動分離的實(shí)驗(yàn)。我們的方法基于穩(wěn)定的觀察，觀察發(fā)現(xiàn)早期視覺路徑的神經(jīng)（外側(cè)膝狀體，LGN）比位于視覺皮質(zhì)中的神經(jīng)被調(diào)節(jié)到更高時間頻率25。皮層4和6接受來自LGN的直接輸入。盡管在這些皮層中存在顱內(nèi)連接，我們假設(shè)LGN輸入處于主導(dǎo)地位26。這意味著總的胞外電位反映出對于時間頻率刺激突觸活動比放電活動普遍。對其他視覺因素的另一好處是皮質(zhì)圖譜。盡管方位和空間頻率圖譜已被識別27，28，但對時間頻率還沒發(fā)現(xiàn)沒有相同的結(jié)構(gòu)。這表明不同時間頻率的神經(jīng)激活范圍一致。對我們的實(shí)驗(yàn)來說，我們用完全反差的雙目全漂移（60°）正弦光柵作為刺激物。此光柵的空間頻率為0.2圈/度，用峰值MUA調(diào)諧確定首選方位。我們使用了三個測試條件：低時間頻率（2或4Hz依托于峰值MUA調(diào)諧），高時間頻率（30Hz，基于刺激存在檢測器的刷新率）和空值（無刺激）。在13個位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了顯著的組織氧反應(yīng)（t檢驗(yàn)，1.00×10-16≤P≤0.0028；26個值中的24個，P＜0.0005）。我們觀察神經(jīng)元放電，發(fā)現(xiàn)對4-Hz刺激的強(qiáng)MUA反應(yīng)和對30-Hz刺激沒反應(yīng)（圖2a）。相反地，對4-Hz刺激和30-Hz刺激都有明顯的組織氧反應(yīng)。和預(yù)想一樣，在空值條件下組織氧反應(yīng)和MUA反應(yīng)和基線信號一樣，或者噪音。圖2.對強(qiáng)（60°）刺激的反應(yīng)的樣品記錄點(diǎn)。（a）放電-時間柱狀圖（暗藍(lán)區(qū)域）和氧反應(yīng)是32次試驗(yàn)平均。氧反應(yīng)周圍實(shí)心灰線顯示±1s.e.m。（b）LFP光譜圖用所有實(shí)驗(yàn)平均信號調(diào)節(jié)功率來計(jì)算。圖示的為對4-Hz和30-Hz刺激及無刺激時的反應(yīng)。4s刺激期間用雙筒漂移正弦光柵刺激，如a圖中垂直灰線和a與b圖頂部的階梯函數(shù)。LFP光譜圖（圖2b）顯示可調(diào)的信號功率是頻率和時間的函數(shù)。在對4-Hz刺激的反應(yīng)頻帶上信號功率明顯增加，盡管反應(yīng)強(qiáng)度在刺激存在一秒后減弱了。在對30-Hz刺激的反應(yīng)中，開始信號強(qiáng)度的增加沒有4-Hz刺激時強(qiáng)，特別是在γL和γH頻帶。然而，盡管信號強(qiáng)度隨時間變化，但此條件下刺激過程中信號功率仍有明顯的增加，特別是在頻率低于50Hz時。組織氧和MUA反應(yīng)一樣，控制條件下的LFP光譜圖顯示的是基線噪音，刺激沒有產(chǎn)生影響。對弱刺激的反應(yīng)為了探索從18區(qū)到組織氧反應(yīng)LGN傳入和周期反饋的相對作用，我們用視覺刺激在較高空間頻率（0.5-0.7圈/度）檢驗(yàn)了另外4個記錄點(diǎn)。另外，我們在這些點(diǎn)使用較弱刺激來減少電極測定區(qū)域外MUA活動導(dǎo)致組織氧反應(yīng)的可能性（圖3）。與對較強(qiáng)刺激的反應(yīng)相似，對4-Hz刺激有強(qiáng)烈的MUA反應(yīng)，但是對30-Hz刺激和控制條件下沒有發(fā)現(xiàn)MUA增強(qiáng)。與早先研究預(yù)期的一樣，這些弱刺激引起的組織氧反應(yīng)與由強(qiáng)刺激引起的組織氧反應(yīng)不一樣20。對于4-Hz刺激，組織氧反應(yīng)特征主要是開始強(qiáng)烈的下降峰。對于30-Hz刺激，開始也有一個小的但顯著的（t檢驗(yàn)，P=8.09×10-8）下降峰。4-Hz和30-Hz的組織氧反應(yīng)都與空值條件下的不同（t檢驗(yàn)，P=6.58×10-8和P=2.64×10-12，分別地）。這些發(fā)現(xiàn)與預(yù)想的弱刺激引起強(qiáng)烈的神經(jīng)和代謝活動的局部變化一致。我們先前已經(jīng)說明開始的下降峰在所有產(chǎn)生強(qiáng)烈神經(jīng)反應(yīng)的點(diǎn)中是最大的11。本文中，沒有MUA的存在表明開始的下降與LFP功率的同時增加是有聯(lián)系的。對4-Hz和30-Hz刺激開始都有強(qiáng)烈的LFP反應(yīng)（圖3b）。開始刺激后500ms對4-Hz的反應(yīng)強(qiáng)度減弱，但是整個刺激期間不同頻帶的功率保持強(qiáng)烈的增加。對30-Hz的反應(yīng)也是在開始刺激后500ms強(qiáng)度減弱，但是減弱程度比4-Hz條件下嚴(yán)重，并且在刺激期間的其他部分發(fā)現(xiàn)25到60Hz間功率增加非常微弱。圖3.在高空間頻率處對弱刺激的反應(yīng)。（a）放電-時間柱狀圖（暗藍(lán)區(qū)域）和氧反應(yīng)（實(shí)心藍(lán)線）是48次試驗(yàn)平均。（b）LFP光譜圖的計(jì)算和圖2中的一樣。刺激物與圖2中的一樣，除了刺激物處于視覺區(qū)域的10°之上（集中于峰值MUA活動確定的感受區(qū)上），空間頻率為0.7圈/度。頻帶的LFP反應(yīng)我們分析了所有17個記錄點(diǎn)的LFP反應(yīng)，通過計(jì)算每個頻帶刺激持續(xù)期間可調(diào)LFP功率之和來確定總的LFP功率（圖4）。如上面看到的（圖2和圖3），對30-Hz刺激的LFP反應(yīng)比對較低時間頻率（2或4Hz）刺激的LFP反應(yīng)弱。然而，對這兩種類型刺激的反應(yīng)在以下方面相似，就是頻率在25和60Hz之間有一個強(qiáng)反應(yīng)（γ帶的較低頻率部分）。這些發(fā)現(xiàn)與早期報道的γ頻帶活動與BOLD信號之間相關(guān)性很強(qiáng)相一致14，18，20，23，29。60Hz以上的γ頻帶的信號強(qiáng)度的相對減弱驗(yàn)證了較低和較高γ頻帶之間存在區(qū)別的理論。近期關(guān)于初級視皮層的研究也表明伽馬頻帶的較低頻率部分（30-50Hz）有較強(qiáng)的反應(yīng)29?？紤]到γ頻帶定義有較大的可變性，這是值得注意的14，18，20，23，29。我們的結(jié)果表明γ頻帶的較低頻率部分（25-60Hz）與突觸活動的關(guān)系比較高LFP頻率與突觸活動的關(guān)系更密切。圖4.總體數(shù)據(jù)：所有點(diǎn)的平均LFP反應(yīng)。LFP反應(yīng)（n=17）數(shù)量通過計(jì)算每個頻帶的可調(diào)功率的和來確定。實(shí)心黑線描述的是對低時間頻率條件（2或4Hz依托于峰值放電調(diào)諧）位點(diǎn)的平均反應(yīng)減去平均空值反應(yīng)。實(shí)心灰線描述的是對高時間頻率條件（30Hz）的平均反應(yīng)減去平均空值反應(yīng)。誤差棒表示所有位點(diǎn)±1s.e.m。討論先前對處理是否BOLD信號與放電或突觸活動關(guān)系很緊密的問題的嘗試靠的的是通過相關(guān)系數(shù)的比較17，18。這些分析已經(jīng)得到了對神經(jīng)變化（就是，MUA對BOLD和LFPs對BOLD）相似的關(guān)系值。因?yàn)镸UA和LFPs之間有很高的相關(guān)性，所有這些結(jié)果很難解釋。我們通過使這兩種神經(jīng)活動分離來避免這個問題。盡管我們的結(jié)果顯示較低頻率γ頻帶（25-60Hz）的活動與組織氧反應(yīng)的關(guān)系最緊密，但我們也發(fā)現(xiàn)在其它頻帶的刺激依賴性反應(yīng)。這兩種類型的刺激（低和高時間頻率）在α和β頻帶也引起強(qiáng)烈的反應(yīng)。β活動與γ頻帶的活動關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)24，盡管其函數(shù)關(guān)系還不清楚。在α頻帶也發(fā)現(xiàn)了對高反差視覺刺激的高LFP功率20。因?yàn)榇碳の锓旁谕耆床钐?，我們在α頻帶也發(fā)現(xiàn)高LFP功率就不足為奇了。也發(fā)現(xiàn)了對30-Hz反應(yīng)的α帶的相對強(qiáng)度。近期研究發(fā)現(xiàn)α帶活動與自上而下的抑制過程有關(guān)30，31。這與來自LGN的高時間頻率的信息受初級視皮層的顱內(nèi)抑制的理論相一致25，32，并能解釋高時間頻率刺激時α帶活動的普遍性。本文中，我們證明了視覺皮層中記錄點(diǎn)處放電反應(yīng)對刺激引起的組織氧變化是不必要的。我們也發(fā)現(xiàn)了在γ頻帶較低頻率部分這些表現(xiàn)出這種行為的點(diǎn)處有強(qiáng)的LFP反應(yīng)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明組織氧的變化與LFPs的聯(lián)系比其與神經(jīng)元放電行為的聯(lián)系要緊密。通過推斷，我們的結(jié)果表明BLODfMRI信號主要反映的是突觸活動而不是放電活動。方法準(zhǔn)備動物。動物處理遵從美國國家衛(wèi)生研究院頒布的實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。成年貓先用1.5-3%的異氟醚氣體進(jìn)行麻醉。中心體溫保持在38℃。接著進(jìn)行前蹄股靜脈插管術(shù)，中斷異氟醚用連續(xù)的靜脈內(nèi)注射芬太尼（10μg/kg體重）和硫噴妥鈉（6mg/kg﹒h-1）保持麻醉。然后進(jìn)行氣管切開術(shù)，動物用含25%氧氣和75%氮?dú)獾幕旌蠚怏w進(jìn)行人工呼吸。實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測腦電圖，心電圖，中心體溫，氣管內(nèi)壓力和呼出的CO2。17區(qū)的開顱術(shù)使用P4L2霍斯里-克拉克(Horsley-Clarke)立體定向儀進(jìn)行，為了插入電極將硬腦膜去除。用泮庫溴銨（0.2mg/kg﹒h-1）誘導(dǎo)麻痹。記錄期間，呼吸調(diào)節(jié)呼吸次數(shù)在每分鐘14到23次之間來保持呼出的CO2水平在33到39mmHg。記錄位點(diǎn)。所有記錄都用UnisenseA/S3000APOX探頭來做。我們不能通過組織學(xué)來確定皮層深度，因?yàn)榇搜b置不能產(chǎn)生傷口。因此，所有深度的測量都以微電極推進(jìn)器的讀數(shù)為準(zhǔn)。電極首先置于17區(qū)皮層表面下500μm處，然后在此點(diǎn)測定一個強(qiáng)的神經(jīng)放電活動（＞每秒放電8次）。數(shù)據(jù)分析不包括不是由適當(dāng)視覺驅(qū)動產(chǎn)生放電頻率的位點(diǎn)。一個位點(diǎn)的所有重復(fù)刺激完成后，將電極移至另一200μm處，搜索位點(diǎn)的過程以100μm的增量重復(fù)進(jìn)行。視覺刺激。視覺刺激用全視野正弦波光柵，它以0.2圈/度的空間頻率顯示于陰極射線管（CRT）監(jiān)測器（平局亮度50cdm