核酸提取方法的技術(shù)要點和注意事項

核酸提取方法的技術(shù)要點和注意事項一、 核酸的基本概念核酸是脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的總稱，是由許多核苷酸單體聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。一個核苷酸分子是由一分子含氮的堿基、一分子五碳糖和一分子磷酸組成的。根據(jù)五碳糖的不同可以將核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩大類。核酸都是極性化合物，都溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑。在酸性溶液中易水解，在中性及弱堿性溶液中穩(wěn)定性稍高。二、 核酸提取前樣本采集、預處理和保存全血：抗凝劑EDTA或枸櫞酸鈉，不宜使用肝素（抑制Taq活性）；血清和血漿：主要用于檢測病毒、細菌和腫瘤細胞等釋放入血的游離核酸；分泌物：痰液是檢測呼吸道病原體核酸的主要樣本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前應先漱口，以避免混入大量口腔脫落的上皮細胞和唾液影響檢測結(jié)果。三、 核酸提取的基本步驟及使用試劑核酸的釋放；2.核酸的分離與純化；3.核酸的濃縮、沉淀與洗滌。核酸提取的常用組分成分名稱 原理及作用酚 蛋白質(zhì)的變性劑，可抑制DNase的降解作用

SDS（十二烷基磺親水基表面活性劑，可破壞細胞膜、核膜、并使組織蛋白酸鈉）與DNA分離溶解脂類蛋白TritonX-100非離子表面活性劑，有助于蛋白質(zhì)與DNA分離異硫氤酸胍 變性裂解細胞，強有力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導致細胞結(jié)4-羥乙基哌嗪一種重要的氫離子緩沖劑,能較長時間控制恒定磺酸（HEPES）異丙醇氯化鈉磺酸（HEPES）異丙醇氯化鈉DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因為DNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分氯化鈉溶液中DNA的溶解度最低，而蛋白質(zhì)高，可以去除蛋白；抑制核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞，維持核酸的穩(wěn)定等礦物油去除非核酸有機雜質(zhì)礦物油去除非核酸有機雜質(zhì)磁珠吸附核酸磁珠四、實驗室常用核酸提取技術(shù)酚/氯仿抽提法/醇沉淀法；2.層析柱法；3.煮沸裂解法；4.一步法；5.納米磁珠法。酚/氯仿抽提法/醇沉淀法：酚是蛋白質(zhì)的變性劑，同時抑制了DNase的降解作用，SDS（十二烷基磺酸鈉）將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)，核蛋白變性降解，使核酸釋放。核酸易溶于水，不溶于有機溶劑，蛋白質(zhì)本身帶有親水基團，但當有機溶劑存在時，蛋白質(zhì)變性沉淀。利用離心后有機溶劑位于底層（脂質(zhì)）核酸存在水相層，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間的原理分離核酸。層析柱法：提DNA時：通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化DNA。提RNA時：提取使用到的離心管壁多是聚丙烯的材料，管壁上有靜電，會吸附核酸。carrierRNA減少了目標核酸物質(zhì)的管壁吸附損失，進而提高微量的核酸純化柱上的結(jié)合和洗脫效率，同時降低了提取環(huán)境中的RNase降解微量RNA的概率。注意：可以進行核酸的純化核濃縮，不適用大批量樣本，對人員操作要求高。煮沸裂解法：加入Tris等使細胞膜破裂，在用高溫使細胞完全裂解，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與DNA變性，再使用有機溶劑抽提使核酸分離并進行沉淀。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，回收上清液中的目的DNA。注意：需要金屬浴，有爆蓋風險，不能用于RNA。一步法：首先核酸釋放劑快速裂解、釋放病毒核酸，然后加入待測樣本，與釋放劑充分混勻，靜置一段時間后，加入擴增試劑上機擴增。注意：要求試劑盒的抗干擾能力高。納米磁珠法：磁珠表面連接了可特異地與核酸發(fā)生作用的功能基團，具有可逆吸附核酸的特性，通常采用帶有氨基、巰基、環(huán)氧基等基團的活化試劑對磁珠表面包覆的高分子進行化學修飾。也可用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。磁珠能與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。在外加磁場的作用下，把血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的核酸分離出來。注意：可以進行核酸的純化核濃縮，可以適用大批量樣本，可以實現(xiàn)自動化。五、 提取核酸的質(zhì)量評價產(chǎn)率：⑴紫外分光光度計測量A260OD值；⑵提取核酸后進行定量PCR，比較Ct值；⑶通過內(nèi)標(InternalControl/Calibrator)評價。純度：檢測230nm、260nm、280nmOD值，常以260/280比值評價。完整性：核酸分子在pH8.0的電泳環(huán)境中，帶負電荷，在一定強度電場力的作用下，從負極向正極遷移。分子量大的核酸電泳過程中受到的阻力較大，泳動速率較慢；反之，分子量較小的核酸片段跑在前面。以電泳結(jié)果評價提取核酸的完整性。抑制物：常以擴增的目的曲線和內(nèi)標曲線進行評價。六、 提取核酸時的注意事項1.一定注意不同方法對核