微生物種群的鑒定方法選擇

譜圖、熒光原位雜交DNA標(biāo)記、單鏈考。PCR-DGGE(Polymerase Chain Reac-tion and Denaturing Gradient Electro-phoresis)DGGE原理FischerLerman1979年最先提出的，1993Muzyers等首次將DGGEDNADNADNADNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)DNADNA序列遷移到變性凝膠確實定位置，并到達其解鏈溫度時,即開頭局部解鏈，解鏈程度越大，遷移阻力大，DNADNA片段則停留于1DNA片段。PCR-DGGE在人工濕地爭論中的應(yīng)用微生物數(shù)量、豐度及多樣性Dong等用PCR-DGGE技術(shù)鑒別分析用來處理豬圈廢水的濕地基質(zhì)中微生物水中微生物的多樣性及豐度顯著降低，其優(yōu)勢種為Pseudomonassp.(假單胞菌),Arthrobac-tersp.節(jié)細菌屬),Bacillussp.桿狀菌)。通過系統(tǒng)發(fā)育分析說明一局部16SrRNA的基因序列與不行培植的反硝化細菌具有極大的相關(guān)性，而這些反硝YinDGGE技術(shù)分析處PCR對攜帶單加氧酶的基因序列進展擴增，得Guo等利用PCR-DGGE技術(shù)分析人工濕地處理二級廢水后混合水中的微生物群落的構(gòu)造，GorraPCR-DGGE技術(shù)鑒別處理污水的濕地基有很大的區(qū)分，其中沸石最有利于氨氧化細菌的活動。特定微生物功能群PCR15個位點鳥分支桿菌)有良好的去除作用，因而對鳥類肺結(jié)核具有有效的把握作用。Park(2023)通工濕地中脫氮菌和除硫菌的活動狀況。Ruiz-RuedaPCR-DGGE技術(shù)鑒別了濕地中闊葉香蒲和蘆葦根際的硝化反硝化菌的活動及其群落構(gòu)造，并推斷它與濕地中的植物種類的相關(guān)性。Huang等應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)調(diào)查處理富養(yǎng)分賞識水的復(fù)合垂直流人工濕地中氨氧化細菌的16SrDNA基因探針和功能PCRDGGE及核苷酸序列分析，以檢測用來處理高氮濃度的垃圾掩埋浸析液的人工濕地中硝化和反硝化作用及其相應(yīng)的菌群。LH-PCR(LengthHeterogeneityPCR)LH-PCR1998LH-PCR中，熒光Nancy等(2023)LH-PCR技術(shù)評估土壤微生物群的組成，并覺察LH-PCRAhnLH-PCR在不同濕地植物和磷負荷下采集人工并應(yīng)用主坐標(biāo)分析及相像性分析得出高磷負荷會使基質(zhì)微生物群落構(gòu)造發(fā)生顯著轉(zhuǎn)變且能降低其多樣性，克隆排序說明不同的磷含量產(chǎn)生不同的微生物群落。T-RFLP(Terminal-RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism)T-RFLP〔末端限制性酶切片段長度多態(tài)性〕PCRRFLP技PCR16SrRNA基的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元。相對于其它分子生物學(xué)分析技術(shù)如RFLP、DGGE等，它具有區(qū)分率高、易于實現(xiàn)自動化等特點。Nicorarat等利用T-RFLP技術(shù)對處理酸化煤礦水的人工濕地系統(tǒng)中微生物的多樣性進展分析將RFLP的結(jié)果與從前的有機體培育PCR-DGGE和FISH爭論結(jié)合起來說明白相對低的微生物多樣性及嗜溫硫桿菌在好氧濕地基質(zhì)中具有優(yōu)勢。Ishida等通過T-RFLP方法測定不同的水力負荷及水位波動對濕地底泥中微養(yǎng)分物的去除狀況確定濕地的性能Searcy等利用PCR擴增每個生物菌膜樣本上真核細菌的 16SrDNA及亞硝酸復(fù)原酶基因，用T-RFLP技術(shù)分析擴增產(chǎn)物推斷整個菌群及反硝化細菌群落的多樣性。Sleytr等利用T-RFLP技術(shù)分析比較蘆葦濕地和芒竹濕地植物根區(qū)的微生物群落構(gòu)造覺察不同的濕地在相像的條件下運行具有相像的菌群構(gòu)造。PCR-SSCP〔SingleStrandConforma-tionalPolymorphism〕PCR-SSCP根本原理單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(簡寫為SSCP)是隨著人類基因組的爭論而進展起來用PCR方法相結(jié)合，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后，將DNA置于非變性的聚丙烯酰胺凝膠上進展電泳，空間DNA會因其遷移率不同而得到分別，最終依據(jù)電泳條帶所顯示的亮度、豐度、條帶位置和清楚度等根本信息進展SSCP圖譜分析，確定不同菌PCR-SSCP技術(shù)被認為是環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)爭論中，繼變性梯度凝膠電泳(DGGE)和末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)之后的又一技術(shù)。PCR-SSCP在人工濕地中的應(yīng)用謝冰等(2023)PCR-SSCP技術(shù)對上海夢清園蘆葦人工濕地的底泥微生物群落構(gòu)造進展了爭論，覺察濕地中微生物優(yōu)勢種主要是七種芽孢桿菌。XIEB等(2023)PCR-SSCP圖譜分析上海夢清園蘆葦人工濕地進出口微生物能群的分布與濕地中不同養(yǎng)分水平有關(guān)。Vacca等(2023)PCR-SSCP圖譜分不同的微生物群落的存在與基質(zhì)類型有關(guān)。ARDRA(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis)限制性酶切片段分析法(ARDRA)PCRrDNA片段(如16SrDNA23SrDNA16S-23SrDNA片rDNA片段進展限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)。該方法的步驟是：rDNA片段擴增出來；3)選擇多種有四對堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進展限制性酶切；4)用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分別酶50%96.3%的硝酸鹽DNA的群落圖譜以測定濕地基質(zhì)中、植物根區(qū)及水中主要的微生物組成，并建立菌克隆文庫，其中300多個克隆體用ARDRA分析并整合到運算分類單位中，得出濕地基質(zhì)中、植物根區(qū)及水中35、31、3650%100%的要高。土壤微生物群落和數(shù)量鑒定的方法“分解者”反響，擔(dān)負著地球C、N、P、S等物質(zhì)循環(huán)的“調(diào)整器”土壤養(yǎng)分植物有效性的“轉(zhuǎn)化器和污染環(huán)境的”凈化器”等多方面生態(tài)功能［P］。土壤微生物是氣候和〔基因〕多樣性、生態(tài)特征多樣性和功能多樣性。目前，對污染土壤微環(huán)境的高度異質(zhì)性，時間和空間上的小環(huán)境隨時發(fā)生變化［R］。另外，棲息在括生物化學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)［S］，將它們的原理、優(yōu)缺點、有用性及其進展動態(tài)作一闡述，以利于今后的爭論。污染土壤微生物群落構(gòu)造多樣性的測定方法傳統(tǒng)微生物平板培育方法傳統(tǒng)的微生物平板培育法就是依據(jù)目標(biāo)微生物選擇相應(yīng)的專性固體培育基［T］。平板計數(shù)法照舊是一個評價污染效應(yīng)的有效方法。Busse等用平板計數(shù)法爭論了草甘膦除草劑對造林土壤中微生物群落構(gòu)造及高除草劑含量，降低了培育基中存活細菌的生長速率和代謝多樣性。時滿足全部微生物對溫度、pH以及通氣狀況等條件的要求，從而用某一種特定中表現(xiàn)出一種”存活但不能培育”息，只能獲得一小局部土壤微生物群落。迄今為止，只有不到1%的土壤微生物生物群落構(gòu)造的真實信息。FLFA譜圖分析法磷脂脂肪酸〔PhospholipidFattyAcid，F(xiàn)LFA〕是構(gòu)成活體細胞膜的重要組途徑形成不同的FLFA，局部FLFA總是消滅在同一類群的微生物中，而在其它類群的微生物中很少消滅，細胞死亡后數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)細胞膜水解和釋放磷脂，F(xiàn)LFA被降解，可以代表微生物群落中”存活”的那局部群體。不同菌群的微生物生物量群落組成各不一樣，每種樣品具有獨特的FLFA譜圖〔包括FLFA總量、組成〕，F(xiàn)LFA譜FLFA分析法是用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液〔1:2:0.8〕提取土樣的脂類，用柱層析法分別得到磷酸酯脂肪酸，然后經(jīng)甲酯化后用氣相色譜分析各種脂肪酸〔C5-C20〕的含量。該方法在污染土壤的微生物群落組成和種群變化方面爭論得到越來越廣泛方法爭論它們對林地土壤殖質(zhì)土壤和農(nóng)業(yè)耕地，然后檢測其FLFA組成，對這兩種土壤微生物群落的磷脂比生物量和活性的變化要小。用FLFA方法覺察Zn污染土壤中指示菌根真菌和放相對含量下降，微生物群落構(gòu)造發(fā)生了變化。Suhadolc等用FLFA分用磷灰石處理降低重金屬有效性和補充重金屬來提高其有效性兩種方式均轉(zhuǎn)變了土壤微生物群落構(gòu)造。：〔1〕溫度波層相，進而影響細胞膜的滲透性。FLFA成分發(fā)生適應(yīng)性變化以轉(zhuǎn)變膜的流淌性變化是生物體內(nèi)消退這些影響的機制之一。〔2〕饑餓，養(yǎng)分狀況的變化也有可標(biāo)記性水平上區(qū)分微生物。基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)擴增核糖體DNA限制性分析法〔AEDRA〕DNA限制性分析法是一種DNA:PCR擴增16srRNA基因，所得片段用限制性內(nèi)切酶消化，并用瓊脂糖凝膠電泳分別。此方法物群落構(gòu)造及其多樣性的爭論。Smit等用擴增的核糖體DNA:限制性分析法爭論只代表了總的細菌種群的一小局部；同時說明擴增的核糖體DNA:限制性分析法Zn對自養(yǎng)型細菌的影響，結(jié)果顯示隨著Zn濃度的增加，各土樣中細菌的代謝多樣性隨之削減。Moffett等用擴增核糖體DNA限制性分析法比較了Zn污染土壤與非污染土Zn毒害脅迫明〔分類群中可得到幾個片段，造成區(qū)分率較低。限制性片段長度多態(tài)性分析法〔RFLP〕PCR限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)，是將PCR引物中的一條加以熒光標(biāo)記，反響后用適宜的限制生物種群的變化。Sandaa等用PCR-RFLP方法評價了重金屬污染對土壤中可培育性，同時證明白可培育細菌種群只代表了土壤細菌群落的一局部。末端限制性片段長度多態(tài)性分析法〔T-RFLP〕末端限制性片段長度多態(tài)性分析法是對AEDRA技術(shù)的改進土壤細菌的16S核糖體DNA和真菌核糖體DNA的ITS區(qū)域都是爭論土壤微生物多樣性格外重要的目標(biāo)區(qū)域T-RFLP就是依據(jù)樣品中的這些目標(biāo)區(qū)域DNA序列的不同或變化，進展PCR擴增后得到目標(biāo)DNA片段酶切后將會產(chǎn)生不同長度的限制性片段依據(jù)這些特異片段的數(shù)量可以推斷區(qū)系的多樣性還可依據(jù)序列鑒定到種通過比較不同樣品間的異同，該方法能為評估土壤微生物多樣性供給更敏感的數(shù)量化根底。 Turpeinen等用T-RFLP方法爭論了As、Cr、Cu污染土壤的微生物群落構(gòu)造，結(jié)果提示了微生物能對土壤重金屬污染產(chǎn)生響應(yīng)作用并通過轉(zhuǎn)變微生物群落構(gòu)造和產(chǎn)生耐性的方式來維持其代謝活性。結(jié)果的關(guān)鍵因素；〔3〕隨著片段長度的增加，測序儀檢測區(qū)分率降低等。2.3.4核糖體基因間隔區(qū)分析法〔RISA〕核糖體基因間隔區(qū)分析方法是利用細菌群落概覽圖譜間的相像度對生態(tài)系統(tǒng)的空間異質(zhì)程度進展定量分析。RISA以RISA概覽圖譜Ranjard等用PCR-RISA分析法爭論了Hg對細菌群落構(gòu)造的影響，覺察在Hg污染脅迫下，優(yōu)勢細菌種群的組成發(fā)生了變化，耐Hg細菌變多，細菌群落多樣性削減。該方法的一些缺乏之處也是不能無視的。如一般只能分別大小相差十幾個BP的DNA片段，對于差異小到幾個甚至一個bp的DNA片段則很難區(qū)分。因此該方法在精度上受到確定限制。2.3.2變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù)〔DGGE或TEEG〕同樣大小的DNA,序列由于含有的堿基不同，各片段的Tm也就不同，甚至一個堿基對的不同，都會引起Tm很大的差異。變性梯度凝膠電泳〔DGGE〕技術(shù)是通過不同序列的DNA片段PCR擴增DNA膠電泳〔TGGE〕技術(shù)的根本原理與DGGE技術(shù)相像，含有高濃度甲醛和尿素的PCRR產(chǎn)物及目的少，可以分析土壤樣品中微生物的多樣性。該技術(shù)最先由Muyzer等人引入爭論土壤微生物基因多樣性，現(xiàn)已被證明能。Kozdroj等用PCR-DGGE結(jié)合傳統(tǒng)培育方法爭論了根系分泌物對受不同程度Kehella等用PCR-DGGE方法爭論了Cd污染對土壤微生物群落構(gòu)造的影響，在高濃度Cd污染下，細菌群落也只發(fā)生了微小的變化，是由于有效Cd濃度過低，說明高濃度但低有效態(tài)Cd污染主要誘導(dǎo)微等用PCR-DGGE說明，PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE檢測后得到的電泳條帶清楚且分別效果好，可以明顯反構(gòu)造多樣性發(fā)生變化。Brim等用PCR-TGGE方法爭論了Zn污染土壤的細菌群落，指出TGGE方法所顯示的細菌群落多樣性要高于用培育方法所獲得的多樣性。而且花費時間較多、費用昂貴，還有代表性不強等。3污染土壤微生物功能多樣性的測定方法由于微生物群落在污染土壤的有機質(zhì)分解、N、C物質(zhì)循環(huán)以及生物修復(fù)等方功能多樣性的爭論主要承受基于碳素利用的BIOLOG微平板分析方法。BIOLOG微平板分析方法是由美國BIOLOG公司于1989應(yīng)用于純種微生物鑒定。1991年，Garland和Mills開頭將這種方法應(yīng)用于土壤微生物群落的爭論，并認為BIOLOG碳素利用法是一種較為先進的爭論不同環(huán)境下的土壤微生物群落構(gòu)造95種碳源的利用力氣及其代謝差BIOLOG微平板是一種多底物的酶〔僅有指示劑〕95個反響孔組成，每個反響孔裝有光值來指示微生物對95能代謝力氣差異狀況。Engelrn等用BIOLOG爭論了除草劑對能多樣性的變化。Banerjee等用BIOLOG分析了澆灌污水污泥對土壤微生物群落的土壤微生物量和N的礦化速率并沒有變化或增加。楊永華等利用BIOLOG方法用BIOLOG草劑在使用濃度較高時〔10mg/kg〕明顯降低土壤微生物多樣性，并且這種抑制BIOLOG方法爭論了鉛鋅銀尾礦區(qū)土壤微生物其土壤微生物群落構(gòu)造發(fā)生了相應(yīng)變化，尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝剖面〔AWCD〕屬污染引起了土壤微生物群落功能多樣性的下降。BIOLOG方法不僅靈敏度高，區(qū)分力強，測定簡便，而且無需分別培育純種BIOLOG方法中所使用的微平板具有確定的選擇性，比方BIOLOGGNBIOLOGGP微平板只適用于革蘭物群落構(gòu)造與功能及其相互關(guān)系，從而獲得更全面的結(jié)果。結(jié)合方法生物化學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)都能很好地描述污染土壤微生物群落構(gòu)造面的信息，必將成為今后爭論的有力工具。MullerPCR-DGGE以及BIOLOG方法爭論了Hg污染對土壤微生物群落，特別