基于三維熒光光譜的赤潮藻種類識別

基于三維熒光光譜的赤潮藻種類識別

1熒光峰的確定熒光溶解有機(jī)物是海洋溶解有機(jī)物的重要組成部分。它主要來自河流、海洋和降水等外源，以及生物活動和海上積累間隙的水釋放。鐘潤生等將三維熒光指紋光譜用于污染河流溶解性有機(jī)物來源示蹤研究。海洋浮游植物是熒光溶解有機(jī)物重要的生物來源,在赤潮發(fā)生過程中,曾發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的熒光。目前,關(guān)于微藻本體的熒光特性已有諸多研究,但對藻體生長過程所產(chǎn)生的熒光溶解有機(jī)物的研究比較少,趙衛(wèi)紅等發(fā)現(xiàn)微藻生長過程中的溶解有機(jī)物會產(chǎn)生類蛋白熒光和類腐殖質(zhì)熒光,藻種不同,所產(chǎn)生的光譜特征也不同;任保衛(wèi)等發(fā)現(xiàn)硅藻的FDOM在三維熒光光譜中顯示出較強(qiáng)的類腐殖質(zhì)熒光,而甲藻在指數(shù)增長期類蛋白熒光較強(qiáng),進(jìn)入消亡期后類蛋白熒光和類腐殖質(zhì)熒光強(qiáng)度迅速增大,對同屬微藻,光譜特征相似,但具體熒光峰的位置有所差別。對溶解有機(jī)物熒光的研究多采用手動挑選的方式確定熒光峰的位置,費(fèi)時費(fèi)力,且誤差較大。本研究采用平行因子分析對赤潮藻生長過程中濾液的三維熒光光譜進(jìn)行分解,直接獲得每種赤潮藻濾液熒光峰的個數(shù)及類型,即每種赤潮藻的特征光譜。在此基礎(chǔ)上可以方便地比較每種藻特征光譜的相似性和差異性,并分析赤潮藻生長過程中濾液的熒光峰強(qiáng)度和生長階段的關(guān)系,為基于赤潮藻濾液三維熒光光譜的赤潮藻種類識別測定技術(shù)提供依據(jù)。平行因子分析通過模型分析確定峰位置,可直接獲得每種赤潮藻濾液熒光峰的個數(shù)和類型以及每個樣品中熒光峰的熒光強(qiáng)度信息,無需在每個三維譜圖中手動挑選熒光峰。整個過程都可程序化,簡單快捷,在此類研究中有著很好的應(yīng)用前景。2平行因子分析平行因子(Parallelfactor,PARAFAC)分析被廣泛應(yīng)用于三維和高維數(shù)據(jù)的分析及應(yīng)用[10,11,12,13,14,15,16]。平行因子分析是基于三線性分解理論,采用交替最小二乘算法實(shí)現(xiàn)的一種數(shù)學(xué)模型,它將一個三維數(shù)據(jù)矩陣X分解為得分矩陣A,載矩陣B和C。分解模型可表示為:xijk=Σf=1Faifbjfckf,i=1,?,I;j=1,?,J;k=1,?,K(1)xijk=Σf=1Faifbjfckf,i=1,?,Ι;j=1,?,J;k=1,?,Κ(1)將平行因子分析模型應(yīng)用到溶解有機(jī)物三維熒光光譜中時,式(1)中xijk代表第i個樣品、發(fā)射波長j、激發(fā)波長k處的熒光強(qiáng)度值;F為載荷矩陣列數(shù),代表因子數(shù);εijk為殘差矩陣,表示變量不能被模型解釋的大小;aij、bjf、ckf分別為載荷矩陣A,B,C中的元素,分別代表了組分濃度、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜信息。與二維數(shù)據(jù)模型(如主成分分析)不同,平行因子分析的解是唯一的。理想情況下,平行因子模型的因子數(shù)應(yīng)該等于混合物中的組分?jǐn)?shù)。每個因子的載荷代表了一種純組分對混合物熒光的貢獻(xiàn)?，F(xiàn)實(shí)應(yīng)用中,由于某些組分化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似或者產(chǎn)生的熒光峰共變性很好,模型很難將這些物質(zhì)分離成各自相應(yīng)的組分。因此,平行因子分析的組分?jǐn)?shù)是對混合物中實(shí)際熒光組分?jǐn)?shù)的估計(jì)。這種技術(shù)在純化學(xué)組分未知的復(fù)雜體系研究中是非常有用的。近年來,平行因子分析被成功地用于解析三維熒光光譜[10,11,12,13,14,15,16]。劉海龍等用平行因子分析對綠茶樣品的三維熒光光譜進(jìn)行分解,通過因子光譜特征分析確定了綠茶的三種主要成分;2003年,Stedmon等首先將平行因子分析用于解析天然水體中溶解有機(jī)物的三維熒光光譜,得到了5個組分,并根據(jù)各組分的組成分析了溶解有機(jī)物的來源;2005年,Stedmon等又用平行因子分析解析圍隔實(shí)驗(yàn)中不同營養(yǎng)鹽條件下浮游生物產(chǎn)生的溶解有機(jī)物的三維熒光光譜,得到了7個組分,并分析了各組分與浮游生物生長時期和營養(yǎng)鹽條件的關(guān)系。3實(shí)驗(yàn)部分3.1甲藻種的制備選用10種我國沿海常見的赤潮藻,如表1所示。甲藻來自中國科學(xué)院海洋研究所藻種室,硅藻來自中國海洋大學(xué)污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中所用玻璃儀器經(jīng)HCl(1∶9,V/V)浸泡,洗凈后高溫滅菌(160℃,1h)。海水經(jīng)孔徑0.45μm的濾膜過濾后蒸汽滅菌(121℃,0.56kg/cm,30min)。藻種在f/2營養(yǎng)介質(zhì)(甲藻采用不加硅的f/2營養(yǎng)鹽培養(yǎng))中培養(yǎng)。光照條件3000Lux;明暗周期12h∶12h;溫度(22±1)℃。每個藻種平行培養(yǎng)3份。3.2維熒光光譜定時取樣測定藻細(xì)胞密度,并每天或隔1天(指數(shù)期每天取樣,其它時期隔1天取樣)取20mL藻液,用GF/F(Whatman)玻璃纖維膜(450℃灼燒4h)過濾,濾液于棕色玻璃瓶(450℃灼燒4h)中避光冷凍保存,并盡快用HitachiF-4500型熒光分光光度計(jì)測定三維熒光光譜。激發(fā)波長200～400nm,發(fā)射波長290～530nm,激發(fā)與發(fā)射步長均為5nm;激發(fā)狹縫5nm,發(fā)射狹縫10nm,掃描速度12000nm/min,熒光強(qiáng)度是由儀器提供的熒光單位。4結(jié)果與討論4.1各三維數(shù)據(jù)矩陣的確定對實(shí)驗(yàn)中得到的赤潮藻濾液的三維熒光光譜數(shù)據(jù),先用扣除Milli-Q水空白三維熒光光譜的方法消除拉曼散射的影響,然后將出現(xiàn)瑞利散射的位置置零,以消除瑞利散射的影響。將去除散射影響的每種藻的三維熒光光譜數(shù)據(jù)按照樣品編號、發(fā)射波長和激發(fā)波長的順序組合成三維數(shù)據(jù)矩陣,共獲得10個三維數(shù)據(jù)矩陣。采用DOMfluor工具箱在Matlab7.0上對10個三維數(shù)據(jù)矩陣分別進(jìn)行PARAFAC模型分析。分別求出10個三維數(shù)據(jù)矩陣2～5組分平行因子模型的中心連續(xù)系數(shù),確定模型因子數(shù)范圍,再對數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值分析。結(jié)果顯示,原數(shù)據(jù)中沒有異常值,最后用一分為二法確定各三維數(shù)據(jù)平行因子模型所用因子數(shù),結(jié)果見表2。錐狀斯氏藻和微小亞歷山大藻為二因子平行因子模型,其它8種藻均為三因子平行因子模型。4.2熒光峰類型和峰位置圖1是用平行因子分析解析得到的赤潮藻各組分的等值線圖。錐狀斯氏藻和微小亞歷山大藻有2個特征光譜,其它8種藻有3個特征光譜。表3列出了本研究所用10種赤潮藻濾液中出現(xiàn)的主要熒光峰位置及峰型。熒光峰位置及代號均參照文獻(xiàn)。由圖1和表3可見,類蛋白熒光峰主要出現(xiàn)類色氨酸T峰,S峰以次峰的形式存在,強(qiáng)度小于T峰;類腐殖質(zhì)熒光峰主要出現(xiàn)M峰和C峰,A峰主要以次峰的形式存在。不同藻種特征光譜存在差異,5種硅藻中的中肋骨條藻、旋鏈角毛藻和柔弱角毛藻類腐殖質(zhì)熒光光譜相似性較高;而雙突角毛藻與三角褐指藻的類腐殖質(zhì)熒光光譜較相似,與前3種硅藻無論從光譜形狀還是峰位置均有明顯差異,5種硅藻的類蛋白熒光光譜的峰位置和形狀均有所差異。5種甲藻中微小亞歷山大藻和錐狀斯氏藻類蛋白熒光光譜很相似,類腐殖質(zhì)熒光峰形狀有所差別,其它3種甲藻特征光譜熒光峰類型和形狀都很相似。同屬的旋鏈角毛藻和柔弱角毛藻熒光峰位置一致,且光譜形狀也很相似,而和同屬于角毛藻屬的雙突角毛藻差異較大;同屬的海洋原甲藻和東海原甲藻出現(xiàn)的熒光峰類型相同,峰位置略有差別;塔瑪亞歷山大藻與微小亞歷山大藻相比,塔瑪亞歷山大藻能夠產(chǎn)生更多種類的類腐殖質(zhì)熒光物質(zhì)。4.3吸光度和檢測微量元素特征圖2為赤潮藻各組分最大熒光峰強(qiáng)度和生長階段的關(guān)系。類蛋白和類腐殖質(zhì)熒光峰強(qiáng)度在培養(yǎng)過程中均有一定程度的增大,類色氨酸T峰熒光強(qiáng)度大于類腐殖質(zhì)熒光峰強(qiáng)度,且變化較大。在指數(shù)生長期,錐狀斯氏藻、塔瑪亞歷山大藻及微小亞歷山大藻T峰和C峰熒光強(qiáng)度隨藻密度增加而增大,呈明顯的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為:T峰:rSct=0.9715,p<0.0001,n=12;rAlt=0.9643,p<0.0001,n=17;rAlm=0.9391,p<0.0001,n=16;C峰:rSct=0.9872,p<0.0001,n=12;rAlt=0.9466,p<0.0001,n=17;rAlm=0.9515,p<0.0001,n=16,表明這幾種藻在生長過程水體中類色氨酸和類腐殖質(zhì)熒光物質(zhì)在不斷積累。海洋原甲藻、東海原甲藻和5種硅藻在指數(shù)生長期內(nèi)類色氨酸熒光強(qiáng)度變化很小,到了穩(wěn)定期均大量增加。海洋原甲藻、東海原甲藻和中肋骨條藻類腐殖質(zhì)熒光峰強(qiáng)度在指數(shù)生長期增加緩慢,到了穩(wěn)定期快速增加,說明衰老和死亡細(xì)胞的破碎釋放,以及細(xì)菌降解作用是水體中類色氨酸和類腐殖質(zhì)熒光物質(zhì)增加的重要來源。除中肋骨條藻外的其它4種硅藻類腐殖質(zhì)熒光強(qiáng)度變化不大。本實(shí)驗(yàn)室曾對幾種微藻生長過程中藻濾液三維熒光光譜的變化進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以前得到的結(jié)果一致,說明平行因子分析可以有效的提取赤潮藻熒光特征,并考察赤潮藻熒光強(qiáng)度和生長階段的關(guān)系。4.4結(jié)果圖1將每種藻各組分?jǐn)?shù)據(jù)矩陣相加,就得到每種藻的總特征光譜。對10個矩陣用matlab軟件進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖3。從圖3可見,旋鏈角毛藻和柔弱角毛藻、微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻、中肋骨條藻和三角褐指藻首先聚為一類,表明同屬的藻特征比較接近,且同為硅藻的中肋骨條藻和三角褐指藻特征也很相似。當(dāng)距離為0.06時,10種藻被分成兩類。第一類包括4種甲藻,2種硅藻;第二類包括1種甲藻,3種硅藻。5赤潮藻組性生物量和組內(nèi)分析本研究采用平行因子分析對赤潮藻生長過程藻濾液的三維熒光光譜進(jìn)行分析,得到了各種赤潮藻濾液中溶解有機(jī)物熒光的特征光譜。不同赤潮藻的特征光