第一章 色譜基礎(chǔ)理論課件

第一章

色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復(fù)使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達(dá)到分離。色譜技術(shù)在近三十多年中的飛速發(fā)展已形成一門專門的科學(xué)，稱為色譜學(xué)。廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。2025/5/261第一章色譜基礎(chǔ)理論色譜法的分類

按流動相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）超臨界流體色譜（SFC）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配2025/5/262第一章色譜基礎(chǔ)理論按色譜過程的分離機(jī)制分類

吸附色譜（adsorption~）利用吸附能力的差別；分配色譜（partition~）利用分配系數(shù)的差別；空間（分子）排阻色譜（stericexclusion~）或稱凝膠色譜法（gel~）利用被測物分子大小不同而導(dǎo)致的滲透系數(shù)差異。2025/5/263第一章色譜基礎(chǔ)理論離子交換色譜（ionexchange~）利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacidanalysis）離子色譜法（ionchromatography）親合色譜（affinity~）將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進(jìn)行分離(專用于蛋白質(zhì)等生化樣品）。2025/5/264第一章色譜基礎(chǔ)理論毛細(xì)管電色譜（capillaryelectro-~）依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數(shù)和電泳速度差別而分離。毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis）以高壓電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品組分的淌度和分配系數(shù)而分離。手性色譜（chiralchromatography）利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。2025/5/265第一章色譜基礎(chǔ)理論填充柱毛細(xì)管柱毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC

LCSFCCEC色譜法經(jīng)典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法2025/5/266第一章色譜基礎(chǔ)理論色譜法特點具有分離、分析功能，可排除組分間的相互干擾，將組分逐個進(jìn)行定性、定量。發(fā)展快，應(yīng)用廣。色譜法在藥物分析中應(yīng)用主要用于成分復(fù)雜的樣品，如：制劑分析、中成藥、天然藥物提取分離、合成化合物純度、有關(guān)雜質(zhì)分析、殘留有機(jī)溶劑分析、殘留農(nóng)藥分析、藥代動力學(xué)、生物利用度，治療藥濃監(jiān)測、生物制品藥物分析、臨床診斷、法醫(yī)鑒定等。2025/5/267第一章色譜基礎(chǔ)理論色譜法發(fā)展向自動化、聯(lián)用型、人工智能化方向發(fā)展：色譜-光譜聯(lián)用氣相色譜-付里葉變換紅外光譜高效液相-紫外吸收光譜氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）高效液相-質(zhì)譜（HPLC-MS）高效液相-付里葉變換紅外光譜超臨界流體色譜-質(zhì)譜薄層色譜-紫外吸收光譜毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜2025/5/268第一章色譜基礎(chǔ)理論色譜-色譜聯(lián)用指二種色譜方法的聯(lián)用，也稱二維色譜法。目的是用一種色譜法補充另一種色譜法分離效果上的不足。常見的有：氣相色譜-氣相色譜高效液相-氣相色譜高效液相-高效液相高效液相-薄層色譜二維薄層色譜色譜-色譜聯(lián)用法可提高分離效果，獲取更多的定性分析信息。2025/5/269第一章色譜基礎(chǔ)理論血漿中卡維地洛爾非手性/手性色譜分離實驗裝置第1閥（0～4.2min,實線位置；4.2～18min,虛線位置）；第2閥（0～3.7min,實線位置；3.7～18min,虛線位置）。廢液例2025/5/2610第一章色譜基礎(chǔ)理論2025/5/2611第一章色譜基礎(chǔ)理論熱力學(xué)理論——塔片理論是由平衡的觀點來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗理論，以塔片理論為代表。動力學(xué)理論——速率理論是從動力學(xué)觀點，即速度來研究各種動力學(xué)因素對柱效的影響，以VanDeemeter方程式為代表。色譜理論2025/5/2612第一章色譜基礎(chǔ)理論基本概念色譜峰（peak）——樣品產(chǎn)生的電信號強度對洗脫時間作圖。稱為流出曲線，濃度-時間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）t(min)C2025/5/2613第一章色譜基礎(chǔ)理論峰形參數(shù)：對稱因子（symmetryfactor，fs）

fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）來衡量

T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)2025/5/2614第一章色譜基礎(chǔ)理論T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的對稱性hABd1xW0.05h2025/5/2615第一章色譜基礎(chǔ)理論例1測得某一物質(zhì)的色譜峰高為2.55cm,

則其0.05h=0.6275cm,量?。篧0.05h=0.575cm，量?。篈=0.285cm計算T或fs，根據(jù)T=W0.05h/2d1fs=(A+B)/2AhABd1xW0.05hT=0.575cm/（2×0.285）cm=1.009x=0.05h2025/5/2616第一章色譜基礎(chǔ)理論一個色譜峰，可用三項參數(shù)來描述：峰高或峰面積——定量峰位（保留值）——定性峰寬——

衡量柱效峰面積(A)峰高(h)tRtR2025/5/2617第一章色譜基礎(chǔ)理論基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流動相通過時的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時間的變化。噪音（noise，N）——各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移2025/5/2618第一章色譜基礎(chǔ)理論定性參數(shù)保留值保留時間，保留體積相對保留值保留指數(shù)2025/5/2619第一章色譜基礎(chǔ)理論保留值保留時間（retentiontime，tR）——進(jìn)樣開始到組分色譜峰頂點時間間隔。死時間（deadtime，t0或tM）——流動相通過色譜系統(tǒng)的時間。t0或tM的測定：GC——用空氣峰（熱導(dǎo)檢測）或甲烷峰（FID）測定HPLC——溶劑峰前沿出現(xiàn)的時間，或用不被固定相吸附或溶解的組分，如NaNO3（210nm測定）的保留時間。2025/5/2620第一章色譜基礎(chǔ)理論調(diào)整保留時間（adjustedretentiontime，t

R）也稱為校正保留時間——某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間，即：t

R=tR

－t0，在實驗條件一定（溫度、固定相），t

R決定組分的性質(zhì)，故t

R是定性的基本參數(shù)。2025/5/2621第一章色譜基礎(chǔ)理論t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)樣2025/5/2622第一章色譜基礎(chǔ)理論

保留體積（retentionvolume，VR），又稱洗脫體積——流動相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時，通過色譜柱的流動相體積。對于對稱峰，VR為樣品組分被流動相帶出色譜柱1/2量時所需流動相體積：

VR=tR

·FcFc為流速（ml/min），F(xiàn)c一定時，VR與tR成正比。Fc大時tR就短，VR與流速無關(guān)。2025/5/2623第一章色譜基礎(chǔ)理論相對保留值（

1,2)

——指組分（1）與參照物（2）兩者調(diào)整保留值的比值。

1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K為分配系數(shù)）保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)）

——是把組分的保留行為換算成相當(dāng)于含有幾個碳的正構(gòu)烷烴的保留行為來描述。2025/5/2624第一章色譜基礎(chǔ)理論以正構(gòu)烷烴系列作為量度被測物相對保留值的標(biāo)準(zhǔn)物。方法如下：用兩個保留時間緊鄰待測組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來標(biāo)定待測物的保留指數(shù)（Ix）

Ix=100[Z＋n]z與z+n代表含有z與z+n個碳原子的正構(gòu)烷烴，n可為1、2，通常n=1。lgt’R(x)－lgt’R(z)

lgt’R(z+n)－lgt’R(z)2025/5/2625第一章色譜基礎(chǔ)理論例：乙酸正丁酯I值的測定，在一定色譜條件下（固定相，柱溫），用正庚烷及正辛烷標(biāo)定。t0n-c7n-c8乙酸正丁酯2025/5/2626第一章色譜基礎(chǔ)理論n-C7：t’R=174

n-C8：t’R=373.4

乙酸正丁酯：t’R=310

z=7，z+n=8，n=1Ix=100[7＋1]=775.6說明乙酸正丁酯在該色譜條件下的保留行為相當(dāng)于含有7.756個碳的正構(gòu)烷烴的保留行為。lg373.4

－lg174

lg310－lg174

2025/5/2627第一章色譜基礎(chǔ)理論在HPLC中應(yīng)用的參照標(biāo)準(zhǔn)為系列烷酮：脂肪族甲基酮系列烷芳基酮系列1－硝基烷烴系列例：應(yīng)用脂肪族甲基酮系列（丙、丁、戊、己、庚酮）對含黃酮類中藥的指紋圖譜進(jìn)行定性，考察了柱溫、流動相、色譜柱、HPLC儀等條件的微小變化對指紋圖譜的影響，比較共有峰的保留時間、相對保留值和保留指數(shù)的RSD，結(jié)果保留指數(shù)的RSD是最小的。2025/5/2628第一章色譜基礎(chǔ)理論樣品樣品+3~7個碳烷酮2025/5/2629第一章色譜基礎(chǔ)理論三種定性參數(shù)比較保留值受色譜條件的影響大，通用性較差。相對保留值減少了色譜條件的影響，但對多組分的復(fù)雜樣品，保留值差別較大，只選一種參照物誤差較大。保留指數(shù)是國際公認(rèn)的色譜定性指標(biāo)。有很好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性?？衫梦墨I(xiàn)的保留指數(shù)進(jìn)行定性，而不需純品對照。2025/5/2630第一章色譜基礎(chǔ)理論此外保留指數(shù)還與溫度、分子結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系：與溫度有線性關(guān)系——由此可求出不同柱溫下的保留指數(shù)（GC法）。例：某物的保留指數(shù)在100℃是654，150℃是688，則可求出125℃時的保留指數(shù)應(yīng)為671。與分子結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系——可通過分子結(jié)構(gòu)來預(yù)測保留指數(shù)或反之。2025/5/2631第一章色譜基礎(chǔ)理論柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋?biāo)準(zhǔn)差（，standarddeviation)半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peakwidth，W或Y）2025/5/2632第一章色譜基礎(chǔ)理論標(biāo)準(zhǔn)差——在正態(tài)分布曲線中，將x=±1處（拐點）的峰寬之半稱為標(biāo)準(zhǔn)偏差。在實際工作中,標(biāo)準(zhǔn)差為峰高0.607h處的峰寬之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607h

xx=0時，曲線的高度為峰高h(yuǎn)2025/5/2633第一章色譜基礎(chǔ)理論半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355

，W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/22025/5/2634第一章色譜基礎(chǔ)理論峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側(cè)作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以：W=4W

2025/5/2635第一章色譜基礎(chǔ)理論

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355

，W=4=1.699W1/22025/5/2636第一章色譜基礎(chǔ)理論差速遷移（differentialmigration）色譜過程是物質(zhì)在相對運動著的兩相間，分布平衡的過程。若混合物中二個組分的分配系數(shù)或吸附平衡常數(shù)不等，則被流動相攜帶移動的速度不等。因差速遷移——而被分離。2025/5/2637第一章色譜基礎(chǔ)理論分配系數(shù)（partitioncoefficient，K）

在一定條件下，達(dá)到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃度（Cs）樣品組分在流動相中的濃度（Cm）

K=Cs/Cm

=K2025/5/2638第一章色譜基礎(chǔ)理論K與保留時間（tR

）的關(guān)系：tR=t0

（1+K·Vs/Vm）t’R=t0

·

K·Vs/VmVs為色譜柱中固定相體積，Vm為色譜柱中流動相體積，即固定相間隙體積。分配系數(shù)大——柱上停留時間長物質(zhì)的性質(zhì)及色譜條件

K

tR2025/5/2639第一章色譜基礎(chǔ)理論容量因子（capacityfactor，k’）

（保留因子retentionfactor，分配比partitionratio）k’表示平衡后組分在兩相中的質(zhì)量比。k’=K·（Vs/Vm），（K=Cs/Cm

）k’=（Cs·

Vs）/（Cm·

Vm）=Ws/Wm又根據(jù)t’R=t0

·

K·Vs/Vm，則有：k’=t’R/t0=tR/t0

-1tR=t0（k’+1）2025/5/2640第一章色譜基礎(chǔ)理論色譜法最佳k’值范圍可用k’值范圍HPLC2～51～10GC～20.2～20TLC0.4～40.1～9色譜法中最佳分離條件與可用范圍的k’值如表所示：根據(jù)tR=t0（k’+1），有：k’=0，tR=t0k’=1，tR=2t0

無保留2025/5/2641第一章色譜基礎(chǔ)理論分離參數(shù)分離參數(shù)用于衡量分離條件的優(yōu)劣，常用分離度，表示。分離度（resolution，R）R=即相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬[(W1+W2)/2]的幾倍。R大,分離效果好。2（tR2-tR1）W1+W22025/5/2642第一章色譜基礎(chǔ)理論R=0.5tR2-tR1=2

，稱為2

分離。分離后各峰露出的面積≥68.3%R=1.0稱為4

（峰頂間距為4

），兩峰峰基略有重疊，裸露峰面積≥95.4%R=1.5tR2-tR1=6

，稱為6

分離（峰頂間距為6

），分離后各峰露出的面積≥99.7%R﹥1.5R﹥1.5，稱為完全分離2025/5/2643第一章色譜基礎(chǔ)理論例：混合物中兩組分A和B在25cm長的色譜柱上的tR分別為16.40min和17.63min，而兩個峰寬分別為0.555cm和0.605cm，紙速0.5cm/min,求分離度。2(tR2-tR1)W1+W2R==2（1.23）/2.32=1.06首先換算峰寬單位：

0.555cm/0.5cm=1.11min0.605cm/0.5cm=1.21min2025/5/2644第一章色譜基礎(chǔ)理論影響分離度的因素分配系數(shù)比（

）容量因子（k’）柱效（n）

R=(4)·(-1

k2+1)k2)·(從三者對分離度R關(guān)系的公式看，

≠1是分離的前提。要將各組分分離，必須選擇適宜的固定相、流動相流速、柱溫等。2025/5/2645第一章色譜基礎(chǔ)理論a為柱效項，b為柱選擇性項，c為容量因子項。

=K2/K1=tR2’/tR1’=k2’/k1’,

在K1K2的前提下，柱效項與容量因子項越大，分離度越大。

abcR=(4)·(-1

k2’+1)k’2)·(2025/5/2646第一章色譜基礎(chǔ)理論1.01.0011.011.1

1.21.52.0(-1)/00.0010.010.091

0.1670.330.501.01→1.1（9%↑），R（↑9倍）

1.5→2.0（33%↑），R(↑1.5倍)上表說明在1附近變化，對分離度R改善非常有效。2025/5/2647第一章色譜基礎(chǔ)理論在＞1的前提下，柱容量k’值越大，R也越大。但當(dāng)k超過20時，k’再增加，k

/（1+k

）增加不明顯。一般k’不超過20。kk/（1+k）kk/（1+k）0.10.331.00.503.00.755.00.838.00.89100.91200.95300.97500.982025/5/2648第一章色譜基礎(chǔ)理論假定n=50002025/5/2649第一章色譜基礎(chǔ)理論假定k’=32025/5/2650第一章色譜基礎(chǔ)理論假定a=1.12025/5/2651第一章色譜基礎(chǔ)理論塔板理論把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達(dá)到分配平衡，經(jīng)多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分（揮發(fā)性大的組分）先到達(dá)塔頂（先流出色譜柱）。由于色譜柱的塔板相當(dāng)多，因此分配系數(shù)的微小差別就可獲得很好的分離效果。在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)（相當(dāng)于一個分餾塔），組分可以很快在兩相間達(dá)到平衡，H稱為理論塔板高度。2025/5/2652第一章色譜基礎(chǔ)理論理論板數(shù)（n）與理論板高度（H）

n=（tR/

）2n=5.54（tR/w1/2）2n=16(tR/w)2n越大，柱效越高。如果用t’R計算理論板數(shù)，所得值為有效理論板數(shù)n有效2025/5/2653第一章色譜基礎(chǔ)理論理論板數(shù)取決于：固定相種類、性質(zhì)、填充狀況、柱長；流動相及其流速；被測物性質(zhì)等。理論板高

(H)H=L/nL為色譜柱長度，當(dāng)L一定時，H與n呈反比，即H越小，柱效越高。2025/5/2654第一章色譜基礎(chǔ)理論例：測得某一物質(zhì)的保留時間為1.5min，半峰寬為0.2cm，柱長2m，記錄紙速為2.0cm/mi