SPE和HPLC對微生物降解體系中十溴聯(lián)苯醚含量的測定.doc

SPE和HPLC對微生物降解體系中十溴聯(lián)苯醚含量的測定 趙銀平，趙曉祥，王玥 （東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海） 摘要：采用固相萃取法提取菌降解體系中的十溴聯(lián)苯醚（），高效液相色譜法測定十溴聯(lián)苯醚的含量，并對各種試驗條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，固相萃取的最佳洗脫劑為正己烷二氯甲烷（，），最佳洗脫體積為（）；高效液相色譜法的最佳檢測條件：檢測波長為，柱溫箱溫度為，流動相為乙腈水（，），流動相流速為，在此條件下的出峰時間為；菌在內(nèi)能夠快速降解高濃度（），第天的降解率達到最高為。通過固相萃取法和高效液相色譜法能夠快速提取和檢測微生物降解體系中的十溴聯(lián)苯醚，該方法操作簡單，節(jié)省時間。 關(guān)鍵詞：十溴聯(lián)苯醚（）；固相萃取法（spe）；高效液相色譜法（hplc）；菌；降解率 ：A：0439114（15）051198-05 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.043 ： 基金項目：上海市基礎(chǔ)研究重點項目（） 作者簡介：趙銀平（），女，河南林州人，在讀碩士研究生，研究方向為環(huán)境微生物學，（電話）（電子信箱）； 通信作者，趙曉祥，研究員，碩士生導師，主要從事有機污染物的降解、監(jiān)測與分析等相關(guān)研究,（電子信箱）。 多溴聯(lián)苯醚（）是一類高效添加型溴系阻燃劑，被廣泛應(yīng)用于各種電子、電器、紡織、建材等產(chǎn)品中，。而這些產(chǎn)品在大量生產(chǎn)、使用和廢棄的過程中，均不同程度地使進入各種環(huán)境介質(zhì)當中，甚至在人的毛發(fā)和母乳中都能檢測到。據(jù)研究表明，具有致癌性及內(nèi)分泌干擾毒性，因此環(huán)境中的嚴重威脅人類健康及生態(tài)安全。 多溴聯(lián)苯醚中的十溴聯(lián)苯醚（）因其具有溴化程度高，阻燃性能好，價格低等優(yōu)點，所以是使用最多的一種，。目前，環(huán)境樣品和生物樣品中的提取方法主要有索氏提取、液液萃取、超聲波輔助萃取和固相萃?。ǎ┑确椒?。相比于其他方法，固相萃取具有耗時短、消耗溶劑少、操作簡便等優(yōu)點，可以高效提取樣品中的。的檢測方法主要有高效液相色譜法（）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（），其中的離子源多采用源，而采用源的不能檢測高溴代聯(lián)苯醚，例如。 本研究采用微生物法對進行降解，并采用固相萃取法（固相萃取小柱）和法對降解體系中的進行提取和檢測。試驗過程中對的檢測條件進行了優(yōu)化，同時考察了不同溶劑對的萃取效率，為水相中高濃度的提取和檢測提供一定的理論依據(jù)及基礎(chǔ)。 材料與方法 試驗材料 試劑二甲亞砜（級），二氯甲烷（級），正己烷（級），四氫呋喃（級），甲醇（級），乙腈（級），均購自上海凌峰化學試劑有限公司；（純度，百靈威科技有限公司）。儲備液：以二甲亞砜為溶劑配成濃度為的儲備液。標準溶液：以二甲亞砜為溶劑將儲備液稀釋成濃度為的標準溶液。將無水硫酸鈉置于馬弗爐中于下烘以上，稍冷后放入干燥器中冷卻，密封保存，備用。 培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、去離子水，。固體培養(yǎng)基：向液體培養(yǎng)基中加入的瓊脂即可。無機鹽培養(yǎng)基（）：、微量元素；去離子水，。其中微量元素溶液組成為：、（）、去離子水。 菌株試驗中所用的長野雷夫松氏菌（，簡稱菌）系趙曉祥課題組篩選獲得的能夠降解高濃度的純菌，其最佳生長條件為，搖床轉(zhuǎn)速。 加標樣品以濃度為的無機鹽培養(yǎng)基作為固相萃取的加標樣品，無機鹽培養(yǎng)基中接入滅活的菌。 儀器型高效液相色譜儀（日本島津公司），配色譜柱（，日本島津公司）；型固相萃取儀（上?？茖W儀器有限公司），固相萃取小柱柱（，上海科學儀器有限公司）；-型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；型立式雙層搖床（上海世平儀器設(shè)備有限公司）；型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。 試驗方法 菌種的活化及菌懸液的制備取環(huán)保藏于甘油中的菌并直接在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后挑取單菌落再一次劃線培養(yǎng)，一共活化次。最后挑取單菌落于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此時菌處于對數(shù)期，然后取適量菌液于離心，收集菌體并用生理鹽水洗滌菌體次，以等體積的生理鹽水重懸，即得菌懸液。 高效液相色譜條件優(yōu)化采用法對（以四氫呋喃為溶劑）的檢測條件進行優(yōu)化，手動進樣，進樣量為。檢測波長的選擇。通過對進行紫外掃描，確定的檢測波長；流動相比例及流速的選擇。依次選用甲醇去離子水、乙腈去離子水為流動相，比較兩種洗脫劑在不同配比的情況下的色譜行為；選擇好流動相后，改變流速以確定的出峰時間。 固相萃取條件優(yōu)化洗脫劑種類的選擇。介于非極性和極性之間，根據(jù)相似相溶原理，選擇從非極性到極性種不同的洗脫劑，即正己烷、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、二氯甲烷。的固相萃取過程為：先用二氯甲烷預(yù)洗固相萃取小柱，于負壓下抽干溶劑，再依次用甲醇和去離子水活化，活化過程要保持小柱床體材料濕潤；然后將加標樣品進行上樣，之后用去離子水淋洗以去除吸附在床體的雜質(zhì)，并于負壓下抽真空，直至小柱床體材料完全干燥；最后采用、（共）不同極性的洗脫劑依次對目標化合物進行洗脫，收集洗脫液。最終洗脫液過無水硫酸鈉去除水，經(jīng)有機濾膜過濾后進樣檢測。每種洗脫劑進行次平行試驗，重復(fù)次。洗脫劑體積的選擇。分別用、正己烷二氯甲烷（，）對進行次洗脫，并分別收集洗脫液，依次編號，分別計算各洗脫液的絕對回收率及洗脫率。進行次平行試驗。 菌對的降解于錐形瓶中加入標準儲備液，使得體系中的濃度為。待二甲亞砜揮發(fā)后，加入無機鹽培養(yǎng)基，下高壓滅菌。待培養(yǎng)基冷卻到室溫，接入菌懸液，接種量為。、搖床避光降解培養(yǎng)，每天各取樣1次，每次取樣，用二氯甲烷正己烷（，）對培養(yǎng)基中殘余的進行洗脫，合并洗脫液后立即進行檢測。以接入滅活的菌懸液的無機鹽培養(yǎng)基為空白對照，每一處理設(shè)個平行，重復(fù)次。 結(jié)果與分析 高效液相色譜條件優(yōu)化 檢測波長的選擇的紫外掃描光譜曲線如圖所示。從圖中可以看出，在內(nèi)，對紫外光都有較好的吸收。據(jù)研究，的的檢測波長多選擇和，本研究最終確定其檢測波長為。 柱溫的選擇色譜柱的溫度直接影響樣品的分離效果，由于的紫外吸收較強，且較易洗脫，所以對溫度的要求不太苛刻，因此本研究控制色譜柱的溫度為。 流動相的選擇當采用以乙腈水（，）為流動相，流速為時，在出現(xiàn)明顯的色譜峰，但保留時間較長。增加有機相比例，即乙腈水（，），流速為時，的出峰時間提前到0。在相同流速下，流動相改為甲醇水（）時，出峰時間延遲到。繼續(xù)增加有機相比例，即乙腈水（，）為，流速保持為時，的出峰時間提前到0，但是峰的前段發(fā)生傾斜，且整個峰型不對稱。當有機相比例保持在乙腈：水（，）流速提高到時，的出峰時間提前到，而且峰型沒有發(fā)生變化。試驗結(jié)果表明，與甲醇水體系相比，采用乙腈水體系作為流動相，可以縮短的出峰時間；流速從升高到，不僅可以縮短出峰時間，而且還可以保證色譜峰的峰型。本研究最終選擇乙腈水（，）體系作為流動相，且乙腈水流速為，可以保證樣品中的各成分有效分離，且色譜峰的峰型也較好，的保留時間為，的色譜圖如圖所示。 標準曲線 采用外標法定量。準確量取一定量的標準溶液，用二甲基亞砜配制成濃度為、的溶液。采用法分別測定各個濃度的溶液，將測得的各濃度溶液相對應(yīng)的峰面積（）隨濃度（）作圖，建立校準曲線，如圖所示。從圖中可以看出，在內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為。標準曲線方程為。 固相萃取條件優(yōu)化 洗脫劑種類的選擇經(jīng)過正己烷、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、正己烷二氯甲烷（，）、二氯甲烷這種不同極性的洗脫劑對進行洗脫，其洗脫效果見表，從表中可看出，正己烷對的洗脫效果最差，而其余種洗脫劑均能較好地洗脫，其中正己烷二氯甲烷（，）對的洗脫其回收率為，基本能夠完全洗脫，選擇正己烷二氯甲烷（，）作為的洗脫劑。 洗脫劑體積的選擇依次用、正己烷二氯甲烷（，）對吸附在固相萃取柱中的進行洗脫，其洗脫效果見圖。由圖可見，目標化合物主要隨第一個洗脫液流出，的被洗脫掉，而洗脫液中僅含有微量的，洗脫液中已無目標化合物的流出。因此體積為的洗脫液已能將全部洗脫。 菌對的降解 經(jīng)過d的降解，在上述優(yōu)化后的條件和固相萃取條件下，對微生物體系中的殘留量進行測定，結(jié)果見圖。從圖中可看出試驗的前培養(yǎng)液中的被菌快速降解消耗；第天培養(yǎng)液中的濃度為，降解率比較低，這主要是因為第天微生物處在一個適應(yīng)環(huán)境的狀態(tài)；第天和第天培養(yǎng)液中的濃度迅速降低，并且在第天時培養(yǎng)液中的濃度最低，為，此時的降解率達到最高，為；第天和第天，培養(yǎng)液中的的濃度略微有些升高，可能是部分菌死亡使得體內(nèi)未被分解的釋放到培養(yǎng)液中導致的。因此，采用法和固相萃取法，能夠高效檢測微生物體系中的含量，同時可知菌在內(nèi)能夠快速降解。 小結(jié)與討論 高效液相色譜條件優(yōu)化結(jié)果 的高效液相色譜檢測條件為：根據(jù)的紫外掃描光譜曲線，確定的檢測波長為；的紫外吸收較強，并且比較容易從色譜柱上洗脫下來，因此溫度對的檢測影響不大，選擇作為的檢測溫度；流動相種類、比例和流速均能影響的出峰時間和峰形，當流動相為乙腈水（，）以及流速為時，不僅能夠提前出峰，而且峰形也比較好，其出峰時間為。 固相萃取條件優(yōu)化結(jié)果 是一種介于中等極性的有機物，因此與極性相似的洗脫劑能夠完全將其從固相萃取柱中洗脫出來，的最佳洗脫劑為正己烷二氯甲烷（，），最佳洗脫體積為（），洗脫回收率為，為。 菌對的降解效果 菌是一種能夠有效降解高濃度的微生物，經(jīng)過d的培養(yǎng)，被菌降解。采用固相萃取和高效液相色譜法對該降解體系中的進行提取和檢測，第天降解體系中的殘留濃度最低，降解率為；第天和第天菌部分死亡使得菌體內(nèi)未被分解的釋放到培養(yǎng)液中，導致體系中的濃度略有上升。通過固相萃取和高效液相色譜法能夠快速提取和檢測微生物降解體系中的含量，對水相中的檢測提供一些實踐基礎(chǔ)和理論意義。 參考文獻： 劉漢霞，張慶華，江桂斌多溴聯(lián)苯醚及其環(huán)境問題化學進展，（）： ，：（）（）：，（）： 董洪梅，魏東洋，萬大娟，等多溴聯(lián)苯醚的環(huán)境行為及其降解研究進展安徽農(nóng)業(yè)科學，（17）：，9429. ，l，（）： ，（）USa，（）： ，（）： 李英明，王亞韋華，江桂斌新型持久性有機污染物概述實驗與分析，（）： ，：，（）： ，of，（）： ，（）： 任金亮，王平多溴聯(lián)苯醚環(huán)境行為的特征與研究進展化學進展，（）： ，（）： 薛錚然，李海靜高效溴系阻燃劑十溴聯(lián)苯醚生產(chǎn)工藝研究山東化工，（）：