叢枝菌根研究方法.doc

叢枝菌根研究方法1.檢測孢子含量的方法（濕篩傾注蔗糖離心法）1.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-2442.劉潤進(jìn)，李曉林2000叢枝菌根及其應(yīng)用北京：科學(xué)出版社：190-194根據(jù)上述方法略有改動(dòng)1. 稱取10 g菌劑，置入大燒杯中加500 ml水，攪拌，靜置10 s。2. 先后過80目分樣篩、400目分樣篩，將400目篩子上的殘余物用藥匙轉(zhuǎn)入50ml 離心管中，后用清水沖洗篩子，將殘余物全部轉(zhuǎn)入離心管中，配平，3000轉(zhuǎn)/min 離心10 min。（注分樣篩最好直徑為12 cm左右，便于下面放置燒杯過篩）3. 去掉上清液，在離心管中加入預(yù)先配制好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的蔗糖溶液，玻璃棒攪勻，配平，3000轉(zhuǎn)/min 離心10 min（注意離心前離心管壁上不能有殘余物）。4. 將400目篩子呈一斜面放置，離心后的蔗糖溶液過篩子的下側(cè)，用水將篩子上的殘留物輕輕洗入劃線培養(yǎng)皿中。（注意水不能加太多以防影響檢測，培養(yǎng)皿劃線便于統(tǒng)計(jì)）。 5. 解剖鏡鏡檢統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中的孢子數(shù)目，計(jì)算出菌劑中的孢子含量。 注：溶于蔗糖溶液中的孢子仍可進(jìn)行接種。2.檢測菌根侵染率的方法（曲利苯藍(lán)染色法）Phillips J M，Hayman D S，1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158161 根據(jù)上述方法略有改動(dòng)1.將洗凈的幼苗根系剪成 1 cm左右的根段，用FAA固定液（70%酒精：甲醛：冰醋酸=90：5：5）固定24 h。2.加入10% KOH在 100的恒溫干燥箱內(nèi)反應(yīng)45 min(去除細(xì)胞質(zhì)，便于染色。一般來說，幼根需要時(shí)間較短，大約只要 0.5 h，老根需要時(shí)間長，大約1 h，以根系相對透明為標(biāo)準(zhǔn))。3.洗去堿液，加入10% H2O2漂白15 min，用蒸餾水清洗，加入0.2 molL-1鹽酸酸化 1h以上(可以延長，曲利苯藍(lán)為酸性染料，需酸化，酸化時(shí)間應(yīng)不少于30 min)。4.曲利苯藍(lán)(Trypan blue)乳酸酚溶液(乳酸 100 mL，甘油 100mL，苯酚 100 mL,蒸餾水 100 mL，曲利苯藍(lán) 0.2 g)染色 5 min。5.乳酸酚(乳酸 100 ml，甘油 100 mL，苯酚 100 mL,蒸餾水100 mL)脫色15min。6.制片，鏡檢。7.試驗(yàn)中可用自來水代替蒸餾水,苯酚有毒，進(jìn)行染色、脫色步驟時(shí)需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員需戴口罩。說明：常規(guī)制片用水即可，用封固劑（聚乙烯醇1.66g，甘油1 ml，乳酸20ml ，蒸餾水10ml）制片片子可以保存較長時(shí)間，但容易產(chǎn)生氣泡，另聚乙烯醇有毒需小心。 經(jīng)脫色后的植物根系可以在甘油中保存數(shù)月。3.統(tǒng)計(jì)方法 Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA dun systme radiculaire. Recherche de mthodes destimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221. Estimation of AMF colonisation Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al叢枝菌根真菌侵染性的評估方法(Trourelot等，1986)a. Mount 15 root fragments on one slide; prepare two slides (30 root fragments total).1.將15個(gè)根段固定在1張載玻片上，30個(gè)染色后的植物須根根段制2個(gè)片子。b. Observe these fragments under the microscope and rate according to the range of classes indicated in figure 1. These classes give a rapid estimation of the level of mycorrhizal colonisation of each root fragment and the abundance of arbuscules.2.在顯微鏡下觀察這些根段，按照圖1的分類方法確定分級，這種分級包括對每個(gè)根段菌根侵染率水平和叢枝豐度的快速評估。c. Put the values into the computer program Mycocalc to calculate the parameters: %F, %M, %m, %a and %A, according to Trouvelot et al. 1986. (see Figure 1 from Trouvelot et al 1986)3.將觀測值代入計(jì)算機(jī)軟件“Mycocale”中即可按照以下相關(guān)公式計(jì)算出相關(guān)的菌根侵染度參數(shù)：%F,%M,%m, %a和%A o Frequency of mycorrhiza in the root system根系中的菌根侵染率(%F)=有菌根根段數(shù)/總根段數(shù)*100o F% = ( nb of fragments myco/total nb)*100 o Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root system根系中的菌根侵染強(qiáng)度(%M)=( 95*侵染率90%以上根段數(shù)+70*侵染率50%至90%的根段數(shù)+30*侵染率10%至50%的根段數(shù)+ 5*侵染率10%以下1%以上根段數(shù)+ 侵染率1%以下根段數(shù))/總根段數(shù)*100o M% = (95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/(nb total)where n5 = number of fragments rated 5; n4 = number of fragments 4 etc. o Intensity of the mycorrhizal colonisation in the root fragments相對菌根強(qiáng)度即根段中的菌根侵染強(qiáng)度(%m)=M*總根段數(shù))/有菌根根段數(shù)o m% = M*(nb total)/(nb myco) o Arbuscule abundance in mycorrhizal parts of root fragmentsa% = (100mA3+50mA2+10mA1)/100(相對叢枝率)菌根根段叢枝率(%a)=( 100*mA3+50mA2 + 10mA1)/100,其中mA3,mA2,mA1分別是A3，A2，A1所對應(yīng)的菌根侵染強(qiáng)度o where mA3, mA2, mA1 are the % of m, rated A3, A2, A1, respectively, with mA3=(95n5A3+70n4A3+30n3A3+5n2A3+n1A3)/nb myco)*100/m and the same for A2 and A1. o Arbuscule abundance in the root system(絕對叢枝率)根系叢枝率(A%) = a*(M/100)Figure 1注：現(xiàn)在找不到“Mycocale”這個(gè)軟件了，我一般都是顯微鏡檢測后自己計(jì)算結(jié)果。統(tǒng)計(jì)菌根侵染率的方法有很多，有網(wǎng)格交叉法、頻率標(biāo)準(zhǔn)法等，可以搜一下相關(guān)文獻(xiàn)。另附叢枝菌根及其應(yīng)用（劉潤進(jìn)，李曉林主編，2000，科學(xué)出版社）的190-199頁。4