【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）β2腎上腺素受體基因的克隆及表達(dá)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)碩士論文

密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 2腎上腺素受體基因的克隆及表達(dá) 2 o. 2 摘 要 畜產(chǎn)品安全問題越來越成為社會關(guān)注的的焦點問題。鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺等 2激動劑在飼喂家畜過程中的濫用，使這些物質(zhì)在動物內(nèi)臟、肌肉組織大量積累。這些畜產(chǎn)品加工的食物直接影響人的健康。建立多殘留的快速檢測技術(shù)，對我國這樣一個養(yǎng)殖量巨大、養(yǎng)殖單元小的國家十分迫切。 2 腎上腺素受體（ 2一種具有 7 個螺旋結(jié)構(gòu)的整合膜蛋白。天然激素或人工合成的 2 激動劑與 2異性結(jié)合后，能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生理變化。本研究的目的是克隆 2因，在大腸桿菌中表達(dá) 2白，為建立測定多組分 2 激動劑的殘留檢測方 法進(jìn)行基礎(chǔ)研究。 本研究從大倉鼠的肺細(xì)胞組織總 ，用特異性引物，通過 方法擴增得到 2因全序列。測序結(jié)果表明，該基因與 報道的 5 種動物的 2 96%的同源性，表明該基因?qū)儆?2族成員，大倉鼠 2因序列長度為1254碼 417 個氨基酸。 本研究將 2長基因（ 2 N 端和（或） C 端截短的 4 個不同長度的片段（2 2 2 2 C 端通過 建有 6簽的兩個長度 的片段（ 2 2建到表達(dá)載體 ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 后，經(jīng) 導(dǎo)與 測發(fā)現(xiàn) 合蛋白在體外能夠表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡實驗進(jìn)一步確認(rèn)了受體蛋白在體外的表達(dá)。 在原核表達(dá)的分析基礎(chǔ)上，將 2建到畢赤酵母表達(dá)載體 ，以建立酵母表達(dá)系統(tǒng)。已完成了 4 個表達(dá)載體的構(gòu)建，分別為： 序結(jié)果證實 2 因片段已正確插入表達(dá)載體中，為在畢赤酵母中表達(dá) 2造了條件。 關(guān)鍵詞 ：大倉鼠， 2 腎上腺素受體基因，克隆，表達(dá) he of by As in in of of in is a 2 to of 2 or a of at AR on is to 2 of in by of in by of In 2AR NA of as a of 96% in to 254 bp 17 In AR . in in of ST on 2AR to of AR 2AR in 2 目 錄 第一章 引言 . .1 腎上腺素受體 激動劑的研究進(jìn)展 1 腎上腺素受體 (研究進(jìn)展 . . 3 G 蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)的 研究進(jìn)展 . .研究內(nèi)容和技術(shù)路線 . . .本研究的目的和意義 . . 11 第二章 試驗材料與方法 . . .試驗材料與試劑 . 12 儀器與設(shè)備 . . . 13 研究方法 . . . . 13 第三章 試驗研究與結(jié)果分析 . . 27 大倉鼠 2 腎上腺素受體（ 2因的克隆 2 7 2 腎上腺素受體（ 2因表達(dá)載體的構(gòu)建 .3 4 2腎上腺素受體（ 2基因的體外表達(dá) .四章 討論 . 論 . . . 51 參考文獻(xiàn) . 52致 謝 . 57作者簡歷 . 58 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 腎上腺素受體激動劑的研究進(jìn)展 腎上腺素受體激動劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機理 腎上腺素受體激動劑 (簡稱 激動劑 ) 是一類天然兒茶酚胺（如：腎上腺素（ 衍生合成的一類化合物。 激動劑一般可分為兩大類： 1）含取代基的苯胺型：如克侖特羅（ 和西馬特羅（ 化合物。 2）含取代基的苯酚型：如沙丁胺醇（ 特布他林（ 化合 物。 圖 1出了兩類激動劑中有代表性的化合物結(jié)構(gòu)。這些化合物在側(cè)鏈上都有共同的 亞氨基團(tuán)（ 六元芳香環(huán)；它們的區(qū)別在于苯環(huán)部分和亞氨基有不同的取代基。 2 3 激動劑 ) 上腺素 ) 丙腎上腺素 ) 羥甲苯腎上腺素 ) 布他林 ) 諾特羅 ) 克多巴胺 ) 丁胺醇 ) 布特羅 ) 馬特羅 ) 侖特羅 ) - 布特羅 ) 圖 1 1he 論是合成的激動劑（如：克侖特羅）還是 腎上腺髓質(zhì)分泌的天然激素（如：腎上腺素），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 都是通過與細(xì)胞膜上 腎上腺素受體（ （簡稱 合，來啟動一系列生化反應(yīng)的。激動劑與 結(jié)合使 象發(fā)生變化，激動劑 R 復(fù)合物與 G 蛋白發(fā)生偶聯(lián)，激活的 G 蛋白（ 與腺苷酸環(huán)化酶（ 聯(lián)。激活的 三磷酸腺苷（ 轉(zhuǎn)化為 3,5。 而激活蛋白激酶（ 或在磷酸二酯酶（ 作用下自身失活 誘發(fā)酶磷酸化反應(yīng)，觸發(fā)生理反應(yīng)。激活的 產(chǎn)生以下效應(yīng)：心率加快，支氣管、子宮和腸道平滑肌松弛，促進(jìn)胰島素釋放和 糖原分解等。 激動劑在動物飼料中的應(yīng)用 激動劑最初只是應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，屬于擬交感神經(jīng)作用藥物，能興奮支氣管平滑肌的 2 腎上腺素受體（簡稱 2使平滑肌松弛，支氣管擴張，用來治療支氣管哮喘?。▽O毓秀， 1996）。1965 年 表數(shù)據(jù)表明：咖啡因、茶堿、煙堿和 腎上腺素等藥物有可能改變哺乳動物的生長，它們可以直接或間接通過改變細(xì)胞膜的 度來發(fā)揮作用。 80 年代初期，美國司發(fā)表了用克侖特羅喂飼動物促進(jìn)生長的文章（ et 1984）。研究 者通過對類似腎上腺素物質(zhì)的大量篩選和對豬、雞、牛、羊、魚等的動物試驗，把 激動劑引入到畜禽飼養(yǎng)領(lǐng)域中。 80 年代以后， 2 激動劑在畜禽飼養(yǎng)領(lǐng)域中得到了應(yīng)用，最為常用的有： 克侖特羅 、萊克多巴胺、沙丁胺醇 、西馬特羅等 (王若軍， 1994)。 由于激動劑對動物具有促進(jìn)肌肉生長，減少胴體脂肪含量，改善生產(chǎn)性能等功能，因此 激動劑后來又被稱為營養(yǎng)重分配劑，俗稱瘦肉精。 90 年代前后， 隨著 激動劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用， 激動劑在飼養(yǎng)中的負(fù)效應(yīng)開始被人們所關(guān)注。 激動劑產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)有： 1）對動物生理產(chǎn)生不良作用，如：發(fā)現(xiàn)豬服用 激動劑后出現(xiàn)非病態(tài)的心率加快、血壓升高、血管擴張、呼吸加劇、心臟和腎臟負(fù)擔(dān)加重等現(xiàn)象； 2）肉品質(zhì)降低，口感變劣； 3）停藥后脂肪迅速補償性沉積； 4）動物對環(huán)境的調(diào)節(jié)能力降低等（屈健， 1998；朱愛民， 1996；王彥文， 1995）。更為嚴(yán)重的是，大量服用 激動劑，在動物組織中存在大量殘留，其中：眼睛中殘留量最高，其次是肝臟、腎臟、脾臟、毛發(fā)（楊志凌 ,2003）。 由于數(shù)倍于治療劑量的使用 激動劑， 90 年代后在世界范圍內(nèi)發(fā)生多次消費者食用含有 2激動劑類藥物較多的肉品，導(dǎo)致集體中毒的事件。 1990 年首次報道了西班牙中部 135 人由于食用了被克侖特羅污染的牛肝而集體中毒的事件。隨后歐洲發(fā)生多起食用被 激動劑污染的食物中毒事件（ 992； 991； 995）。近年來，我國也發(fā)生多起 食用被克侖特羅等 激動劑污染的食物而導(dǎo)致中毒的事件，如： 2002 年江蘇蘇州發(fā)生 26 人食用污染豬肝的中毒事件， 2003 年廣東佛山市順德區(qū)近 100 余人和遼寧遼陽市 39 人食用污染豬肉的中毒事件等。 所以，鑒于 激動劑 在 飼養(yǎng)中的負(fù)效應(yīng)和它大量使用后在 動物體內(nèi)的殘留問題，歐盟已 經(jīng)禁止使用 2 激動劑 作為動物生長促進(jìn)劑。 1997 年我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部和國家醫(yī)藥管理局共同發(fā)布了 176 號公告，禁止在飼料和動物飲水中使用 2 激動劑。 但是由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，違法濫用的現(xiàn)象仍然存在，中毒事件時有發(fā)生 (楊曙明， 2003)。 激動劑的殘留檢測技術(shù) 激動劑的殘留檢測方法的研究，國外有許多報道。 1996 年對生物基質(zhì)中 激動劑的檢測方法有詳細(xì)的綜述（常碧影等， 2002）。歐盟也建立了測定生物樣品或動物飼料中 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 激動劑單一組分或多組分的篩選方法（ 確證方法（ S， S）。我國于 2001 年建立了飼料、動物組織中鹽酸克侖特羅的測定方法。但是多組分殘留檢測技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于國外水平。 目前用于檢測 激動劑的方法主要分兩大類。一類為確證方法，有 S， S，S 等 (孫遠(yuǎn)明 ,2002；谷峰 ,2002)。通過質(zhì)譜檢測器對 激動劑類化合物結(jié)構(gòu)特征的分析，來確認(rèn)殘留物的存在。另一類為篩選檢測方法。主要是放射免疫分析法（ 酶聯(lián)免疫分析法（ （陳勇等， 2002）。 中的 法，由于其具有簡捷，快 速、省時、靈敏度高等優(yōu)點，近年來得到了廣泛的應(yīng)用，在大量樣品篩選工作中發(fā)揮重要的作用。 析法的局限性有： 1）在測定過程中由于多種原因會產(chǎn)生一定比例的假陽性。 2）每一種 針對一種 激動劑化合物的，不適用于多組分殘留檢測。 受體分析法是近年來提出的一種適用于多組分殘留檢測的方法，但由于其技術(shù)難度大，目前國內(nèi)外還未有商品化的產(chǎn)品用于檢測工作。在研究初期，受體的獲得是通過生物分離技術(shù)。分離動物體內(nèi)細(xì)胞膜上受體的辦法來獲得與 激動劑特異性結(jié)合的 于天然 非常低，提取和純化工作難度大， 且細(xì)胞膜上常常是同時存在著多種不同亞類的 以無法分離得到一種單一亞類的 使得受體分析法發(fā)展緩慢。隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展，多種動物的 外高效表達(dá) 為可能。本研究旨在通過克隆和體外表達(dá)技術(shù)得到 2 建立測定多組分 2 激動劑的殘留檢測方法進(jìn)行基礎(chǔ)研究。 腎上腺素受體（ 研究進(jìn)展 圖 1腎上腺素受體 1 結(jié)構(gòu) 圖 1鑲 嵌于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層中的整合糖蛋白， 64跨在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上，具有 G 蛋白偶聯(lián)受體的共性。 它在細(xì)胞膜上的排列結(jié)構(gòu)可以看到三個顯著特征：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 1） 7 個平行排列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，每個螺旋均由 20疏水氨基酸殘基組成，這個區(qū)域的氨基酸殘基同源性和序列保守性最高； 2） N 端含兩個糖基化位點和三個親水性聯(lián)結(jié)環(huán)位于細(xì)胞膜外； 3） C 端和三個親水性環(huán)狀序列位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，其中 C 端富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，構(gòu)成潛在的磷酸化調(diào)節(jié)位點。腎上腺素的結(jié)合位點處于跨膜螺旋所形成的一個“口袋”內(nèi)。 功能域 跨膜結(jié)構(gòu)域 在 G 蛋白偶聯(lián)受體中， 7 個跨膜域中氨基酸的同源性和保守性最高，目前認(rèn)為這些跨膜域共同參與形成一個“口袋”狀配基結(jié)合位點，任何一個跨膜結(jié)構(gòu)或其與膜外側(cè)環(huán)狀之間的聯(lián)結(jié)序列缺失或突變，均可影響 折疊，如位于，螺旋上的第 274氨基酸缺失的倉鼠 2突變受體不能與配基結(jié)合，但膜兩側(cè)的親水性環(huán)狀區(qū)氨基酸缺失的突變受體一般不改變配基結(jié)合特性?？梢娺@些跨膜結(jié)構(gòu)為維持 級結(jié)構(gòu)所必需，且構(gòu)成了配基結(jié)合位點。用胰蛋白酶處理 125親和標(biāo)記的倉鼠 2 現(xiàn)其烷基化共價結(jié)合位點位于第條螺旋的 基上。第、和條螺旋上的個別氨基酸殘基的改變，也會顯著地影響配基結(jié)合特性，如位于第螺旋上的 代后，與激動劑的親和力下降，但不影響拮抗劑的結(jié)合能力；位于第螺旋上的 代后，對激動劑和拮抗劑的親和力均下降 （ ， 1987）。 基在所有的以具有潛在質(zhì)子化的氨基化合物為特異配基的受體中呈高度保守性，說明酸性氨基酸側(cè)鏈可能與質(zhì)子化的氨基陽離子配基 形成離子鍵結(jié)合。 激動劑 分子是含有兒茶酚結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)，其中的酚羥基可能與第、螺旋上的 鏈上的羥基形成氫鍵結(jié)合， 激動劑 分子中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可與第、螺旋中的 疏水側(cè)鏈形成疏水鍵結(jié)合。 某些跨膜結(jié)構(gòu)中也呈高度保守，它們可誘導(dǎo)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生彎折，與其他氨基酸殘基 激動劑 結(jié)合位點 (， 1997； ， 2001)。 氨基端和膜外側(cè)結(jié)構(gòu)域 N 端有兩個典型的糖基化位點 有糖基，并對內(nèi)切糖苷酶 F 敏感，這些寡糖基鏈不參與受體與配基的識別和結(jié)合過程，但能增加受體的分子量，影響受體蛋白的折疊，促進(jìn)新生受體插入細(xì)胞膜。此外，受體糖基化可以保護(hù)受體分子免受蛋白酶作用而過早降解。G 蛋白偶聯(lián)受體含有 10胱氨酸殘基，位于第一外側(cè)環(huán)上 第二個外側(cè)環(huán)上 蛋白偶聯(lián)受體中是絕對保守的，它們在兩個外側(cè)環(huán)之間形成二硫鍵，對維持受體三 級結(jié)構(gòu)有重要作用，若被其他氨基酸取代，可使受體結(jié)合特性發(fā)生顯著變化。第二外側(cè)環(huán)上的第 179氨基酸殘基缺失的倉鼠 2 突變受體，不能形成二硫鍵，從而導(dǎo)致配基與突變受體親和力的降低。對于 激動劑 和 結(jié)合位點和作用機理的研究對更好的利用受體提供了依據(jù)。 羧基端和膜內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)域 細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)親水性環(huán)狀序列和羧基端的一個重要功能是構(gòu)成 G 蛋白偶聯(lián)域。第一，二內(nèi)側(cè)環(huán)的氨基酸殘基在 G 蛋白偶聯(lián)受體中保守性較高，第三內(nèi)側(cè)環(huán)上的氨基酸殘基在不同受體中的變化較大，說明受體與各種 G 蛋白相互作用的特異 性第三環(huán)起著關(guān)鍵性作用，而第一，二環(huán)無決定性作用。在 2 G 蛋白偶聯(lián)中絕對必需的第 221氨基酸殘基在溶液中能形成一種雙親中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 螺旋結(jié)構(gòu)，雙親螺旋結(jié)構(gòu)在受體與 G 蛋白的偶聯(lián)過程中具有重要作用， 激動劑 結(jié)合，導(dǎo)致受體構(gòu)象變化，從而使螺旋結(jié)構(gòu)適應(yīng) G 蛋白偶聯(lián)反應(yīng)（呂志良等， 1992）。 分型和分布 20 世紀(jì) 40 年代晚期科學(xué)家系統(tǒng)地研究了腎上腺素，去甲腎上腺素和幾種化合物激活或阻礙 酸化，對受體和 了進(jìn)一步了解。 （ 1967）根據(jù)對腎上腺素和異 丙腎上腺素結(jié)合力的大小、將組織中的 為 1 和 2 兩種亞型。 （ 1984）在大鼠脂肪組織中發(fā)現(xiàn)一種“非典型”的激動劑位點，與常規(guī)的激動劑結(jié)合力低，而與 激動劑的親和力較高，這種 稱為 3 1要分布于心臟和脂肪細(xì)胞膜上，與心臟刺激和脂肪分解有關(guān)； 2要分布于骨骼肌、平滑肌、胰島的 ， 1987），與氣管擴張及血管抑制有關(guān)。 （ 1989）認(rèn)為，大部分器官組織中 1 2有可能存在。只是受體種類和數(shù)量存 在差異。心臟組織不僅含有 1時存在 2骼肌細(xì)胞膜上也存在少量有功能的 1 3研究始于 70 年代中期。陸續(xù)克隆出了人（ 989），大鼠 (991)和小鼠 (991)的 3因。通過 交分析技術(shù)對 3轉(zhuǎn)錄本（ 行研究發(fā)現(xiàn)，人、大鼠、小鼠和豬的白色脂肪組織中以及大鼠、小鼠的棕色脂肪組織中分布了大量的 3外，大鼠的肝臟、骨骼肌和回腸以及人的消化系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)和骨骼肌中存在 3（ 1999）研究 3豬體組織中的分布時發(fā)現(xiàn)， 3豬皮下脂肪組織中含量最多，心臟和骨骼肌中的含量高于肺中的含量，而肝臟中未檢測到 3轉(zhuǎn)錄本。研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠脂肪組織中的 3多，而豬脂肪組織中的優(yōu)勢亞型為 1 G 蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)的研究進(jìn)展 G 蛋白偶聯(lián)受體屬于一類整合膜蛋白超家族，由于它對外界刺激細(xì)胞反應(yīng)調(diào)節(jié)作用中的重要性，使它在藥理學(xué)上有著重要地位 (. 996)。為了研究 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)， 20世紀(jì) 70代，科學(xué)家從動物的細(xì)胞膜上分離純化 et 1979； et 1981；et 1984），這種方法制備的 非常少，不足以滿足研究受體蛋白所需要的量?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，這種天然制備的膜蛋白是多種受體蛋白亞類的復(fù)合物，多種受體有著相似的藥理學(xué)性質(zhì)，多種受體的共存使得研究組織中一種特定的受體十分困難。隨著 G 蛋白偶聯(lián)受體基因克隆技術(shù)的發(fā)展，異源表達(dá)一種特定的受體蛋白，成為研究單一受體蛋白亞類的有效手段（ ,1998； ,1996）。 1986 年 在 志上發(fā)表了第一個 G 蛋白偶聯(lián)受體：金色中倉鼠的 2 基因后，隨后人的 2et 987），挪威鼠的 2et 1987)，家鼠的2et 1989)，牛的 2et 2003）基因等許多 G 蛋白偶聯(lián)受體的基因被克隆出來。異源表達(dá)受體主要用于三個方面的研究： 1) 受體與配體結(jié)合性質(zhì)的研究； 2）受體與 G 蛋白偶聯(lián)的研究； 3）受體結(jié)構(gòu)的 研究。 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌，酵母，桿狀病毒和哺乳動物等幾乎所有的表達(dá)系統(tǒng)中都可以表中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 6 達(dá)出有功能活性的蛋白，但成功的程度因受體的種類不同和宿主細(xì)胞特點的不同而有差異(. 996)。真核動物的 G 蛋白偶聯(lián)受體在哺乳動物細(xì)胞和桿狀病毒中表達(dá)有其優(yōu)勢，但由于操作復(fù)雜，所以更多的科學(xué)家選擇在大腸桿菌和酵母中表達(dá) G 蛋白偶聯(lián)受體。即使在同一種表達(dá)體系中，不同的 G 蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)的水平差異在 2 個數(shù)量級以上。不同類的 G 蛋白偶聯(lián)受體或同一類不同亞類的 G 蛋白偶聯(lián)受體的 7 個跨膜域的氨基酸是 很保守的，主要差異在于 N 端， C 端和膜外膜內(nèi)環(huán)部分。所以可以得出這樣的結(jié)論：對表達(dá)水平的影響主要就是這些保守性不強的部分。下面介紹 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌和酵母中的表達(dá)。 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達(dá) 通常 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達(dá)量非常低，因為大腸桿菌自身不具有 G 蛋白偶聯(lián)受體，蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中表達(dá)，對大腸桿菌來講是一種毒性蛋白。許多科學(xué)家通過嘗試，采取了一些策略和方法，改善了 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達(dá)量。采取的策略有：融合表達(dá)，截去受體基因的非跨膜域，在受體基因的外側(cè)環(huán) 中導(dǎo)入正電荷， C 端融合 6多達(dá)十幾種標(biāo)簽，誘導(dǎo)條件的優(yōu)化等多種方法，使受體蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)。下面就從這幾個方面作詳細(xì)的介紹。 外源基因在大腸桿菌中表達(dá)常用的策略是構(gòu)建融合基因。融合蛋白比天然蛋白更加穩(wěn)定，還可以提供蛋白純化的方法。 在 1995 年對膜蛋白的表達(dá)有詳細(xì)的綜述。目前用于受體表達(dá)構(gòu)建的融合表達(dá)載體有：麥芽糖結(jié)合蛋白（ 統(tǒng)，谷胱甘肽 統(tǒng)。一種大腸桿菌中具有的膜蛋白（ 1993），受體蛋白融 合在 面，使表達(dá)出的融合蛋白能正確插入到大腸桿菌的膜組織中，提取膜組織和溶解膜蛋白后可以得到表達(dá)的受體蛋白。 一種胞內(nèi)表達(dá)的蛋白， G 蛋白偶聯(lián)受體與 合后，表達(dá)的融合受體蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)松散的聚集在膜上，用柔和的條件可以分離受體蛋白（見表 1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 7 表 1G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達(dá) 蛋白名稱 N 端融合伴侶 C 端融合伴侶 啟動子 蛋白細(xì)胞中定位 參考文獻(xiàn) 6 細(xì)胞膜上 993 神經(jīng)緊張素受體 io 996 細(xì)胞膜上 994 神經(jīng)緊張素受體 2a 10 細(xì)胞膜上 H 2002 苷受體 5 6 細(xì)胞膜上 999 五羥色胺受體 . 1 細(xì)胞膜上 989 1 腎上腺素受體 6 胞內(nèi) 1996 嗅覺受體 1B 6 胞內(nèi) 2000 1 of 在 1987 年法國人 將 1 和 2一種膜蛋白 合后，在大腸桿菌中表達(dá)，并將表達(dá)的融合蛋白與同位素標(biāo)記的激素做了結(jié)合試驗，得出結(jié)論融合表達(dá)的蛋白與配體有結(jié)合活性，他提出表達(dá)的融合蛋白可以作為一種有效的篩選配體的工具。英國劍橋大學(xué) 在 1993 年將 鼠神經(jīng)緊張素受體 （ 合在麥芽糖結(jié)合酶（ 后面，在大腸桿菌中得到表達(dá)。 1996 年 在進(jìn)一步的研究中，截短了鼠 神經(jīng)緊張素受體，在 N 端融合麥芽糖結(jié)合 蛋白 C 端融合了 18 種 不同的標(biāo)簽。他們的研究結(jié)論是 ： 1）受體蛋白 N 端蛋白酶敏感區(qū)的去除可以防止融合蛋白被蛋白酶水解；2） C 端標(biāo)簽的加入對表達(dá)量有影響，同一受體不同標(biāo)簽造成的表達(dá)量差異在 2 個數(shù)量級以上。他們認(rèn)為在大腸桿菌中高效表達(dá)受體蛋白的關(guān)鍵因素很多，不僅僅是一方面的因素。主要因素有：1）受體蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性； 2） C 端序列的特點； 3） N 端氨基酸對表達(dá)來說是不穩(wěn)定因素， 4） C 端標(biāo)簽的影響是復(fù)雜的。在此之后德國人 002年在英國劍橋 驗室用同樣的表達(dá)系統(tǒng)完成了在大腸桿菌 2 腺苷受體。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 8 將受體蛋白與谷胱甘肽 合后，在大腸桿菌中表達(dá)的策略也有應(yīng)用。 1996 年）在大腸桿菌 表達(dá)了 N 端融合 C 端結(jié)合 6簽的的嗅覺受體。表達(dá)的融合蛋白，由于受體蛋白的疏水性使其聚集在大腸桿菌的細(xì)胞膜的內(nèi)壁上，而并未整合到細(xì)胞膜上。將表達(dá)的蛋白與膜組織重組后，能表現(xiàn)出與配體的結(jié)合特性。 2000 年）進(jìn)一步在大腸桿菌 表達(dá)了 11 種 G 蛋白偶聯(lián)受體 和其中 2 種 G 蛋白偶聯(lián)受體突變體（見表 1 表 1 融合 13 種 G 蛋白偶聯(lián)受體 3 ST 體 名 稱 全長 構(gòu)建中殘基 1B 倉鼠的 1B 腎上腺素受體野生型 515 32 1B 108R/ 515 32鼠 1B 腎上腺素受體 110R 突變體 A0 鯊魚 嘌呤核苷受體 352 15 人的黑色素 體 317 179R/鼠的神經(jīng)緊張素 80R 突變體 424 43鼠的神經(jīng)緊張素 生型 424 43-1( 人的神經(jīng)肽 體 384 22-2( 人的神經(jīng)肽 體 381 39 人的后葉催產(chǎn)素受體 389 29R5(52鼠的嗅覺受體 變體 314 18R5(鼠的嗅覺受體野生型 314 18視紫紅質(zhì) 348 1魚視紫紅質(zhì) 455 1 1受體及其突變體，構(gòu)建在 C 端，并在受體基因的 C 端連上 6簽。在 13種被表達(dá)的 G 蛋白偶聯(lián)受體中， 1B 腎上腺素受體及其突變體的 515 個氨基酸只將 32基酸構(gòu)建在載體中，去掉了 N 端和 C 端的部分序列；鯊魚 嘌呤核苷受體 等 7 種受體和一個突變體，去掉了 N 端部分序列；只有視紫紅質(zhì)（ 3 種受體是將全長構(gòu)建到表達(dá)載體中去的。 現(xiàn)在同一標(biāo)簽（ 6同的受體在同樣的表達(dá)條件下，表達(dá)量差異在兩個數(shù)量級，表達(dá)量從 10%全細(xì)胞蛋白。表達(dá)水平與蛋白表達(dá)過程中表現(xiàn)出的毒性是相一致的。用多線性衰退分析方法研究了受體環(huán)區(qū)域的正電荷氨基酸數(shù)量與表達(dá)水平的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在環(huán)區(qū)域正電荷數(shù)量多的受體，表達(dá)量相應(yīng)就高，分析結(jié)果表明： 44%的表達(dá)量可能是由受體蛋白膜外 3 個環(huán)和膜內(nèi) 3 個環(huán)的正電荷數(shù)量決定的。將兩個低表達(dá)量的受體 1B 腎上腺素受體（ 1B 嗅覺受體（ R5 過環(huán)區(qū)域?qū)胝姾傻霓k法使表達(dá)量提高了 5。 融合表達(dá)受體蛋白策略是改善 G 蛋白偶聯(lián)受體在大 腸桿菌中的表達(dá)量的總原則。不同受體主要的差異在于非跨膜域，這些區(qū)域是影響表達(dá)的主要因素。對這些區(qū)域的改造是科學(xué)家研究的重點之一。 表達(dá)嗅覺受體時截掉了 N 端 52 個氨基酸，在表達(dá)腎上腺素受體時截掉了 第一章 引言 9 端 31 個氨基酸和 319 以后的氨基酸，這些改變都提高了受體蛋白的表達(dá)量。 嘗試了在受體基因的外側(cè)環(huán)中導(dǎo)入正電荷的辦法，同樣得到了好的結(jié)果。 C 端融合標(biāo)簽的研究近年來也有許多進(jìn)展，帶正電荷的標(biāo)簽，帶負(fù)電荷的標(biāo)簽和中型電荷的標(biāo)簽都有所研究。 對融合受體蛋白的誘導(dǎo)條件的選擇和優(yōu)化，也有許多報道。 er 1998)發(fā)表文章談到，用透性酶缺失（ 大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌，是解決毒性蛋白表達(dá)問題的有效途徑。 et 002)報道，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入 葡萄糖能有效抑制大腸桿菌本底表達(dá)量，因為本底表達(dá)量高不利于外源蛋白的表達(dá)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入激動劑的拮抗劑，可是提高表達(dá)后的受體蛋白與激動劑的結(jié)合能力。 受體蛋白是一種親脂性的蛋白，疏水的氨基酸非常多，在檢測表達(dá)產(chǎn)物的過程中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌裂解液的上清中沒 有受體蛋白，將不溶的部分用相應(yīng)的試劑處理后，檢測到表達(dá)的受體蛋白（ 996）。受體蛋白與 膜蛋白融合表達(dá)時，在 作用下，受體蛋白能插入到大腸桿菌的細(xì)胞膜上，在溶解受體蛋白時多種去污劑被嘗試過： 1,2，8 等。其中 污劑的效果要好于其他，特別是將這三種去污劑混合后使用，效果會更好。在受體蛋白與 合表達(dá)時，超速離心得到的大腸桿菌細(xì)胞膜和受體蛋白的復(fù)合物處理起來就沒有那么復(fù)雜，用 2% 液處理超速離心后的沉淀物，就可以把受體蛋白溶解下來。這說明與 合的受體蛋白可能沒有正確的插入到細(xì)胞膜上，而是