青霉素生產(chǎn)工藝

青霉素生產(chǎn)工藝摘要：青霉素是一種重要的抗生素，在目前的制藥工業(yè)中占有舉足輕重的地位，生產(chǎn)規(guī)模非常大。通過(guò)數(shù)十年的完善，青霉素針劑和口服青霉素已能分別治療肺炎、肺結(jié)核、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、白喉、炭疽等病，增強(qiáng)了人類(lèi)治療傳染性疾病的能力。研究和優(yōu)化其生產(chǎn)工藝對(duì)人類(lèi)健康有重要意義。關(guān)鍵詞:青霉素；生產(chǎn)工藝抗生素在目前的制藥工業(yè)中仍占有舉足輕重的地位，尤其是下游半合成抗生素的發(fā)展，進(jìn)一步刺激了上游的工業(yè)發(fā)酵。一些抗生素的工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模非常大，如-內(nèi)酰胺類(lèi)的青霉素、頭孢菌素C，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的紅霉素、利福霉素，氨基環(huán)醇類(lèi)的鏈霉素、慶大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四環(huán)素、金霉素、萬(wàn)古霉素等，單個(gè)發(fā)酵罐容積越來(lái)越大，100 m3的發(fā)酵罐被普遍采用，200 m3甚至更大容積的發(fā)酵罐經(jīng)常可見(jiàn)報(bào)道?？股氐墓I(yè)生產(chǎn)包括發(fā)酵和提取兩部分。工藝流程大致如下：菌種的保藏、孢子制備、種子制備、發(fā)酵、提取和精制。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有機(jī)酸等，主要為菌體生長(zhǎng)代謝提供能源，為合成菌體細(xì)胞和目的產(chǎn)物提供碳元素。有機(jī)氮源多用玉米漿、黃豆餅粉、麩質(zhì)粉、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉等，硫酸銨、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸銨則是常用的無(wú)機(jī)氮源。另外，培養(yǎng)基中還得添加無(wú)機(jī)鹽、微量元素以及消沫劑，部分抗生素還得加入特殊前體，如青霉素的前體是苯乙酸，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的前體是丙酸鹽。發(fā)酵過(guò)程普遍補(bǔ)加一種碳源、氮源物質(zhì)，如葡萄糖和硫酸銨。pH值通過(guò)流加氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，很多抗生素在發(fā)酵中后期流加前體，對(duì)提高產(chǎn)量非常有益?？股匕l(fā)酵絕大多數(shù)為好氧培養(yǎng)，必須連續(xù)通入大量無(wú)菌空氣，全過(guò)程大功率攪拌。發(fā)酵液的預(yù)處理，一般加絮凝劑沉淀蛋白，過(guò)濾去除菌絲體，發(fā)酵濾液的提取常用溶媒萃取法、離子交換樹(shù)脂法、沉淀法、吸附法等提純濃縮，然后結(jié)晶干燥得純品。一、青霉素的發(fā)酵工藝過(guò)程青霉素生產(chǎn)流程： 發(fā)酵工藝過(guò)程（1）生產(chǎn)孢子的制備將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化。最適生長(zhǎng)溫度在2526 ，培養(yǎng)68天，得單菌落，再傳斜面，培養(yǎng)7天，得斜面孢子。移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富的易利用的碳源和有機(jī)氮源。青霉素采用三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。通無(wú)菌空氣，空氣流量1：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00350r/min；4050小時(shí)；pH自然，溫度271。二級(jí)發(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，251；014h。三級(jí)發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀熧|(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，CaCO3等。接種量為1215%。青霉素的發(fā)酵對(duì)溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率攪拌，100 m3的發(fā)酵罐攪拌功率在200300 Kw，罐壓控制0.040.05 MPa，于2526 下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h為26，以后24。發(fā)酵過(guò)程控制反復(fù)分批式發(fā)酵，100m3發(fā)酵罐，裝料80m3，帶放610次，間隔24h。帶放量10，發(fā)酵時(shí)間204h。發(fā)酵過(guò)程需連續(xù)流加補(bǔ)入葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時(shí)期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，讓培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長(zhǎng)，而在40h后，靠低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖和氮源等，使菌半饑餓，延長(zhǎng)青霉素的合成期，大大提高了產(chǎn)量。所需營(yíng)養(yǎng)物限量的補(bǔ)加常用來(lái)控制營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌種，使代謝產(chǎn)物積累到最大。（1） 培養(yǎng)基青霉素發(fā)酵中采用補(bǔ)料分批操作法，對(duì)葡萄糖、銨、苯乙酸進(jìn)行緩慢流加，維持一定的最適濃度。葡萄糖的流加，波動(dòng)范圍較窄，濃度過(guò)低使抗生素合成速度減慢或停止，過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖濃度調(diào)節(jié)是根據(jù)pH，溶氧或CO2釋放率予以調(diào)節(jié)。碳源的選擇：生產(chǎn)菌能利用多種碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。經(jīng)濟(jì)核算問(wèn)題，生產(chǎn)成本中碳源占12以上，對(duì)工藝影響很大；糖與6-APA結(jié)合形成糖基-6-APA，影響青霉素的產(chǎn)量。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強(qiáng)，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用快效的葡萄糖進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)葡萄糖耗竭后，利用緩效的乳糖，使pH穩(wěn)定，分泌青霉素?？筛鶕?jù)形態(tài)變化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加。降低成本。氮源：玉米漿是最好的，是玉米淀粉生產(chǎn)時(shí)的副產(chǎn)品，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。玉米漿質(zhì)量不穩(wěn)定，可用花生餅粉或棉籽餅粉取代。補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源。無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30g/ml以下。流加控制：補(bǔ)糖，根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)窃?.6左右，pH開(kāi)始升高時(shí)加糖。補(bǔ)氮：流加酸酸銨、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。添加前體：合成階段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側(cè)鏈的前體，直接摻入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但濃度大于0.19時(shí)對(duì)細(xì)胞和合成有毒性。還能被細(xì)胞氧化。策略是流加低濃度前體，一次加入量低于0.1%，保持供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。（2）溫度一生長(zhǎng)適宜溫度30，分泌青霉素溫度20。但20青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。生產(chǎn)中采用變溫控制，不同階段不同溫度。前期控制2526左右，后期降溫控制23。過(guò)高則會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)率，增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化得率。有的發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間，生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。（3）pH合成的適宜pH6.46.6左右，避免超過(guò)7.0，青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解。緩沖能力弱的培養(yǎng)基，pH降低，意味著加糖率過(guò)高造成酸性中間產(chǎn)物積累。pH上升，加糖率過(guò)低不足以中和蛋白產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)。前期pH控制在5.76.3，中后期pH控制6.36.6，通過(guò)補(bǔ)加氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH較低時(shí)，加入CaCO3、通氨調(diào)節(jié)或提高通氣量。pH上升時(shí)，加糖或天然油脂。一般直接加酸或堿自動(dòng)控制，流加葡萄糖控制。（4）溶氧溶氧30飽和度，產(chǎn)率急劇下降，低于10，則造成不可逆的損害。所以不能低于30飽和溶氧濃度。通氣比一般為1：0.8VVM。溶氧過(guò)高，菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低，呼吸強(qiáng)度下降，影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧，根據(jù)各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整。（5）菌絲生長(zhǎng)速度與形態(tài)、濃度對(duì)于每個(gè)有固定通氣和攪拌條件的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的特定好氧過(guò)程，都有一個(gè)使氧傳遞速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達(dá)到平衡的臨界菌絲濃，超過(guò)此濃度，OUROTR，溶氧水平下降，發(fā)酵產(chǎn)率下降。在發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃可達(dá)1520%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。另外，因補(bǔ)入物料較多，在發(fā)酵中后期一般每天帶放一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。有絲狀生長(zhǎng)和球狀生長(zhǎng)兩種。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸，比生產(chǎn)率高，發(fā)酵粘度低，氣/液兩相中氧的傳遞率提高，允許更多菌絲生長(zhǎng)。球狀菌絲形態(tài)的控制，與碳、氮源的流加狀況，攪拌的剪切強(qiáng)度及稀釋度相關(guān)。（6）消沫發(fā)酵過(guò)程泡沫較多，需補(bǔ)入消沫劑。天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。少量多次。不適在前期多加入，影響呼吸代謝。青霉素的發(fā)酵過(guò)程控制十分精細(xì)，一般2 h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌濃、殘?zhí)?、殘氮、苯乙酸濃度、青霉素效價(jià)等指標(biāo)，同時(shí)取樣做無(wú)菌檢查，發(fā)現(xiàn)染菌立即結(jié)束發(fā)酵，視情況放過(guò)濾提取，因?yàn)槿揪髉H值波動(dòng)大，青霉素在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)被全部破壞。相關(guān)設(shè)備（1）攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐械攪拌發(fā)酵罐是密閉式受壓設(shè)備，主要部件包括罐身、攪拌器、軸封、打泡器、中間軸承、空氣吹管（或空氣噴射管），擋板、冷卻裝置、人孔等.（2）冷卻結(jié)晶器冷卻結(jié)晶器是一種通過(guò)熱量交換使?jié)饪s液冷卻，濃縮液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，在熱交換面處產(chǎn)生結(jié)晶體，通過(guò)轉(zhuǎn)子的刮板連續(xù)不斷地把熱交換面處的結(jié)晶體剷刮下，并在熱交換面處產(chǎn)生新結(jié)晶體，濃縮液不斷地從進(jìn)料段輸入，經(jīng)過(guò)冷卻結(jié)晶段，剷刮下結(jié)晶體連同濃縮液從出料段輸出，經(jīng)過(guò)過(guò)濾機(jī)后，實(shí)現(xiàn)固液分離，母液重新從從進(jìn)料段輸入，而完成連續(xù)冷卻結(jié)晶的過(guò)程。 冷卻介質(zhì)常用乙烯、氟里昂等碳?xì)浠衔锒栊砸后w。 直接冷卻結(jié)晶器有釜狀、回轉(zhuǎn)式、濕壁塔式等多種。 (3)消泡裝置：采用消泡劑罐加注消泡劑或機(jī)械消泡裝置。機(jī)械消泡裝置一類(lèi)為內(nèi)置，它是在攪拌軸或罐頂另外引入的軸（指攪拌軸由罐底伸入時(shí)）上裝上消沫槳。另一類(lèi)置于罐外，目的是從排氣中分離已溢出的泡沫使之破碎后將液體部分返回罐內(nèi)。二、青霉素的提煉工藝過(guò)程青霉素提純工藝流程簡(jiǎn)圖：青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過(guò)程要條件溫和、快速，防止降解。1.預(yù)處理發(fā)酵液結(jié)束后，目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，而且濃度較低，如抗生素只有1030Kg/m3，含有大量雜質(zhì)，它們影響后續(xù)工藝的有效提取，因此必須對(duì)其進(jìn)行的預(yù)處理，目的在于濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。是進(jìn)行分離純化的一個(gè)工序。2.過(guò)濾發(fā)酵液在萃取之前需預(yù)處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾或板框過(guò)濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷至10 以下，過(guò)濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長(zhǎng)10m，采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2，蛋白質(zhì)含量0.05-0.2%。需要進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)。（2）改善過(guò)濾和除去蛋白質(zhì)的措施：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土為助濾劑。再通過(guò)板框式過(guò)濾機(jī)。濾液澄清透明，進(jìn)行萃取。3.萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時(shí)，pH選擇1.8-2.0，從乙酸丁酯反萃到水相時(shí)，pH選擇6.8-7.4。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯的體積比為1.5-2.1，即一次濃縮倍數(shù)為1.5-2.1。為了避免pH波動(dòng)，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。發(fā)酵液與溶劑比例為34。幾次萃取后，濃縮10倍，濃度幾乎達(dá)到結(jié)晶要求。萃取總收率在85左右。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)pH2.03.0，加入醋酸丁酯，用量為濾液體積的三分之一，反萃取時(shí)常用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH7.08.0。在一次丁酯萃取時(shí)，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取條件：為減少青霉素降解，整個(gè)萃取過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行（10 以下）。萃取罐冷凍鹽水冷卻。4.脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過(guò)濾，除去活性炭。5.結(jié)晶萃取液一般通過(guò)結(jié)晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采用重結(jié)晶方法，進(jìn)一步提高純度，將鉀鹽溶于KOH溶液，調(diào)pH至中性，加無(wú)水丁醇，在真空條件下，共沸蒸餾結(jié)晶得純品。直接結(jié)晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉乙醇溶液反應(yīng)，得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀乙醇溶液，得到青霉素鉀鹽。共沸蒸餾結(jié)晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4-4.8下得到鈉鹽水濃縮液。加2.5倍體積丁醇，1626，0.67-1.3KPa下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過(guò)洗滌、干燥后，得到青霉素產(chǎn)品。相關(guān)設(shè)備（1）732氫型離子交換樹(shù)脂柱這類(lèi)樹(shù)脂含有大量的強(qiáng)酸性基團(tuán)，如磺酸基SO3H，容易在溶液中離解出H+，故呈強(qiáng)酸性。樹(shù)脂離解后，本體所含的負(fù)電基團(tuán)，如SO3，能吸附結(jié)合溶液中的其他陽(yáng)離子。這兩個(gè)反應(yīng)使樹(shù)脂中的H+與溶液中的陽(yáng)離子互相交換。強(qiáng)酸性樹(shù)脂的離解能力很強(qiáng)，在酸性或堿性溶液中均能離解和產(chǎn)生離子交換作用。樹(shù)脂在使用一段時(shí)間后，要進(jìn)行再生處理，即用化學(xué)藥品使離子交換反應(yīng)以相反方向進(jìn)行，使樹(shù)脂的官能基團(tuán)回復(fù)原來(lái)狀態(tài)，以供再次使用。如上述的陽(yáng)離子樹(shù)脂是用強(qiáng)酸進(jìn)行再生處理，此時(shí)樹(shù)脂放出被吸附的陽(yáng)離子，再與H+結(jié)合而恢復(fù)原來(lái)的組成。（2）高速離心過(guò)濾設(shè)備離心過(guò)濾原理：離心過(guò)濾是將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓并利用離心力場(chǎng)進(jìn)行過(guò)濾的過(guò)程，以離心力為推動(dòng)力完成過(guò)濾作業(yè)，兼有離心和過(guò)濾的雙重作用。以間歇離心過(guò)濾為例，料液首先進(jìn)入裝有過(guò)濾介質(zhì)的裝鼓中，然后被加速到轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)速度，形成附著在轉(zhuǎn)鼓壁上的液環(huán)，與沉降式離心機(jī)一樣，粒子受到離心力而沉降，過(guò)濾介質(zhì)阻礙粒子通過(guò)，形成濾餅。接著，懸浮液的固體顆粒截留而沉積下來(lái)，濾餅表面生成了澄清液，該濾液透