基因組序列的功能解析.ppt

第一節(jié)在基因組中識別基因,一、識別候選基因,1.生物信息分析基因的序列特征,雙鏈DNA有6個ORFs閱讀方式,（1）開放閱讀框架(ORF，openreadingframe),從起始密碼至終止密碼,（2）ORF的平均長度,大腸桿菌：317個密碼,酵母菌：483個密碼,人：約450個密碼.,在原核生物中直接尋找ORF有效。,在真核生物中不能直接尋找ORF。,在真核生物中不能直接尋找ORF的原因：,62%的人類基因被間隔開,有內(nèi)含子，斷裂基因,許多外顯子短于100個密碼，甚至有些少于50個密碼,（3）對ORF掃描軟件的修正,1）密碼偏愛,在某種生物中并不是所有密碼都被均等使用。,2）外顯子-內(nèi)含子邊界,3）上游調(diào)控序列:,CpG島:4050%的人類基因和脊椎動物基因中，5上游的GC含量高,4）尋找同源序列,到其他模式生物中尋找同源序列。如果模式生物的同源序列已經(jīng)被鑒定為某個功能基因的話.,主要用途是對新序列進(jìn)行功能分析.,2.通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)識別基因,檢測是否轉(zhuǎn)錄RNA分子.,起始密碼上游的數(shù)10個堿基，終止密碼下游的上百個堿基.,包括：,（1）核酸雜交實(shí)驗(yàn),1）Northernblotting,選擇性剪接或者多基因家族都能產(chǎn)生多個RNA轉(zhuǎn)錄物,mRNA一般都是從一個組織或器官中得到的,2）zoo-blot(gardenblot）,用Southernblot把一個物種的DNA片斷與相關(guān)的其他物種的編碼基因DNA雜交,Probesample,（2）cDNA測序,（3）PCR技術(shù),從cDNA文庫（cDNAlibrary）中篩選。,1）RT-PCR(reversetranscriptasePCR),2）RACE(rapidamplificationofcDNAends),RACE,（3）尋找外顯子-內(nèi)含子邊界.,1）mRNA-DNA雜交,2）外顯子捕獲,需要特殊的載體,二、確定某個基因的功能,1.生物信息學(xué)分析預(yù)測基因功能,通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)研究.,同源性查詢:,原理：功能相似的基因具有相似的序列,（1）序列同源性反映了共同祖先的進(jìn)化關(guān)系,直系同源體（Orthologous）:來自不同的物種的同源基因,旁系同源體（Paraloguos）:來自同一個生物的同源基因,（2）同源性分析揭示基因或片斷的功能,可以分析DNA序列，但一般需要把DNA轉(zhuǎn)化成氨基酸序列進(jìn)行分析。,核酸序列76%相同(偶然事件),氨基酸序列只有28%相同！,1）完整序列比對,2）部分序列分析,尋找共同擁有的結(jié)構(gòu)域（domain）.,如tudordomain,結(jié)構(gòu)域是序列功能的核心。,（3）同源性分析在酵母基因組計劃中的應(yīng)用,30%是通過同源性分析預(yù)測的,酵母基因組含有約6000個基因,其中30%是通過常規(guī)的遺傳實(shí)驗(yàn)確定的.,2.用實(shí)驗(yàn)確定基因功能,（1）通過基因失活分析基因功能,將基因突變，觀察由此引起的表型變化。,1）同源重組失活,“Lossoffunction”,酵母的刪除盒,用抗生素抗性基因替換酵母的某一處基因組序列,基因敲除（knockout）小鼠,胚胎干細(xì)胞（EScells）,注射到小鼠胚胎,嵌合體,互相交配,純合體敲除小鼠,有些基因是至死基因，只能得到雜合體,2）非同源重組的基因失活,1）轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽：,把轉(zhuǎn)座序列插入到基因中，使基因失活。,讓轉(zhuǎn)座子帶上應(yīng)答元件，在外界的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)座。,缺點(diǎn)：不能準(zhǔn)確失活一個基因，因?yàn)檗D(zhuǎn)座是個隨機(jī)事件。,人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座：,給Ty1的上游加上半乳糖誘導(dǎo)的啟動子,2）RNA干涉（RNAinterference）,與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)的短雙鏈RNA能降解目標(biāo)基因的mRNA.,在線蟲1號染色體上，2769個預(yù)測的基因中的2500分別被進(jìn)行了RNA干涉,缺點(diǎn)：在哺乳動物中只能對單細(xì)胞進(jìn)行處理，因?yàn)镽NA在體內(nèi)的存在時間有限。,（2）通過基因超表達(dá)分析基因功能,“Gainoffunction”,3.未知基因編碼的蛋白質(zhì)功能的精細(xì)研究,（1）定向突變,刪除或改變基因序列中的一部分,Site-directedmutagenesis(體外定點(diǎn)突變):,刪除一段插入一段突變個別堿基,1）寡核苷酸定點(diǎn)突變,2）同源重組導(dǎo)入突變基因,兩步取代：,第一步:用標(biāo)記基因取代原基因,第二步:用突變基因取代標(biāo)記基因,失去標(biāo)記,獲得標(biāo)記,（2）報告基因（Reportergenes）和免疫組織化學(xué),reportergenes舉例,確定基因表達(dá)的部位和時空特征.,1）報告基因,2）免疫組織化學(xué),測定待測基因的啟動子,確定基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的位置,研究不同組織的不同發(fā)育階段、不同疾病的轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物,三、研究基因組的整體活性,1.研究轉(zhuǎn)錄物組,（1）基因表達(dá)系列分析（SAGE）,鑒定細(xì)胞中的全部mRNA的相對豐度。,把cDNA序列與基因組序列比較,把mRNA轉(zhuǎn)為cDNA,把cDNA文庫中的每個克隆都測序,轉(zhuǎn)錄物組學(xué)(transcriptomics)：,是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科.,基因表達(dá)系列分析(SAGE),12-bp短序列足夠特異,412=16777216bp,BsmFI切割1014bp的下游.,5-AGCT-3,從每個cDNA末端釋放平均長度12bp,（2）基因芯片,cDNA,DNA,2.研究蛋白質(zhì)組,研究一個細(xì)胞中全部蛋白質(zhì)的技術(shù)。,（1）蛋白質(zhì)組學(xué),蛋白質(zhì)電泳,第一向:區(qū)分分子量的標(biāo)準(zhǔn)電泳,第二向:區(qū)分電荷的標(biāo)準(zhǔn)電泳,雙向凝膠電泳:,質(zhì)譜,鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì).,基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF):,質(zhì)荷比（Mass-to-chargeratio）分析分子量，然后推導(dǎo)氨基酸組成,（2）鑒定蛋白質(zhì)的相互作用,如果知道位置蛋白與某個已知蛋白相互作用的話，就能推測其功能。,噬菌體展示,噬菌體展示文庫:,將未知基因與噬菌體表面蛋白融合，表達(dá)到噬菌體表面,酵母雙雜交系統(tǒng),（3）蛋白質(zhì)相互作用圖,畫出蛋白質(zhì)組中所有組分的相互作用圖。,細(xì)菌Helicobacterpylori:畫出了1200個相互作用(占蛋白質(zhì)組的一半）酵母1870個蛋白之間的2240個