抗氧化試驗(yàn)方法

1、1還原力的測(cè)定樣品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2ml 1%的鐵氤化鉀溶液的混合液 中?；旌衔镌?0C保溫20min,然后在反應(yīng)混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm離心10min,取上清液2ml與2ml蒸儲(chǔ)水以及0.4ml 0.1%氯化鐵在反應(yīng)試管中反應(yīng)，10min后測(cè)定其在700nm處的吸光值。吸光值越大表明還原力越強(qiáng)。注意：建議蛋白濃度以5mg/ml左右變化，例如2.5, 5之類變化。但具體情況應(yīng)根據(jù)吸 光值大小而定。0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液的配制見附表。鐵停化鉀溶液應(yīng)盛裝在棕色瓶中。比色皿的用法：可見光（400nm）

2、用玻璃比色皿（即沒有標(biāo)字母或者標(biāo)G的比色皿），紫外光時(shí)（400nm）用石英比色皿（即標(biāo)Q字比色皿）。2 DPPH白由基清除活性的測(cè)定將1.5ml樣品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇中，混合，振蕩，在 室溫下放置30min，然后在波長(zhǎng)517nm處檢測(cè)（Ai）。清除率計(jì)算公式為：磯） = 1-（ M - A圳AxlOO%空白為1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸儲(chǔ)水調(diào)零。式中：Ac對(duì)照為1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸儲(chǔ)水在517nm處的吸光值；Aj-1.5ml樣品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm處的吸光值；Ai 1.5ml樣品液加上1

3、.5 ml DPPH溶液在517nm處的吸光值； 注意：建議酶解液蛋白濃度以2mg/ml左右變化，如0.5,1,2,2.5之類變化，但是具體情況應(yīng)視清除率而定，最終結(jié)果應(yīng)有清除率大于50%和小于50%的情況。DPPH樣品有毒，需戴口罩和手套進(jìn)行操作。而且DPPH試劑很昂貴，用時(shí)注意節(jié)約。0.1m mol/L DPPH乙醇溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定 容到100ml。3在卵黃磷脂體系中抗氧化能力的測(cè)定以卵黃脂蛋白為底物的LPO模型反應(yīng)體系包括：體積比為1:25稀釋的卵黃懸液（卵黃用等體積的pH7.45 , 0.lmol/LPBS配成，使用前磁力攪拌10

4、min）0.2 mL、一定濃度的樣品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL,用PBS緩沖液補(bǔ)足至2.0mL。對(duì)照管除不加樣液外 其他試劑同前。將上述2種試管同時(shí)置37C恒溫水浴鍋中保溫培養(yǎng)1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，靜置10 min后，與對(duì)照管于3500r/min離心10min,取2.0mL上清液，分 別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL,加塞于100C水浴15min,取出冷 卻。 空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下測(cè)定吸光度，樣品對(duì)卵黃脂蛋白LPO的抑制率表示為：SA（%）=（Ac一AS）/A CX 100式中:Ac一

5、不加樣品的吸光度As加入樣品的吸光度注意：卵黃溶液不用時(shí)應(yīng)放置冰箱保存。酶解液蛋白濃度以5mg/ml左右調(diào)整，但具體應(yīng)視清除率大小而定，對(duì)酶解液蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整。硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶?jī)?nèi)保存。并以50m mol/L NaOH溶液配制。再在50 C水浴溶解。FeSO4溶液應(yīng)以棕色瓶盛裝。4過氧化值的測(cè)定參照本食品學(xué)院林華娟等老師主編的食品分析實(shí)驗(yàn)講義一書。5超氧陰離子白由基清除率的測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率（V對(duì)照）：對(duì)照組和空白對(duì)照組加入4ml蒸儲(chǔ)水（去離子水）和，0.1 mol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2）4.5ml， 在25C水浴20min后， 樣品組加入0.2ml（或0.

6、3ml）3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸儲(chǔ)水（去離子水）代替。震勻后馬上在320nm處測(cè)定吸光值。迅速混勻并開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀取吸光值，4 min后結(jié)束，以空白對(duì)照管調(diào)零。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V對(duì)照。（V對(duì)照在0.05A/min0.065A/min之間，否則應(yīng)調(diào)整鄰苯三酚加入量）樣品自氧化速率（V樣品）：樣品組和空白組均加入一定濃度的樣品溶液4ml , 0.1mol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2） 4.5ml ,在25 C水浴20min后，樣品組加入0.2ml（或0.3ml）3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸儲(chǔ)水

7、（去離子水）代替。震勻后馬上在320nm處測(cè)定吸光值。迅速混勻并開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀取吸光值,4 min后結(jié)束，以空白管調(diào)零。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V樣品，按下式計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的抑制率：式中：抑制率（%）=（V對(duì)照-V樣品）/V對(duì)照X 100V對(duì)照一對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率（ A/min）V樣品一樣品組鄰苯三酚自氧化速率（ A/min）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料：摘自鷹嘴豆：抗氧化劑的抗氧化效果受到多種因素的影響， 只有在生物體內(nèi)具有抗氧化作 用的物質(zhì)才能有效的活除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基， 才能表現(xiàn)出一定的生物活性。由于 體外抗氧化測(cè)定方法容易操作，周期短，因此評(píng)價(jià)一種

8、物質(zhì)的抗氧化效果往往首 先采用體外抗氧化體系。但體外抗氧化體系往往與人體內(nèi)的生理環(huán)境相差太大， 許多研究結(jié)果表明采用體外方法評(píng)價(jià)有效的抗氧化劑進(jìn)入人體后卻表現(xiàn)不出應(yīng) 有的抗氧化效果，因此抗氧化劑的抗氧化效果在采用體外方法進(jìn)行初步評(píng)價(jià)后應(yīng) 采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。人體在正常生理代謝過程中會(huì)產(chǎn)生少量的含氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等，這些自由基通過自然存在于體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化 酶（SOD）、過氧化氫酶及抗氧化劑如抗壞血酸、維生素E組成的抗氧化系統(tǒng)來消 除。因此，在正常狀態(tài)下，體內(nèi)自由基維持在一定水平并處于動(dòng)態(tài)平衡中，正常 量的自由基對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、解蠹等具有有益的作用

9、，在殺菌、免疫調(diào)節(jié)等 方面具有積極而重要的意義。然而，隨著增齡或在某些病理狀態(tài)下以及機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)， 體內(nèi)抗氧化酶活 性下降，從而導(dǎo)致機(jī)體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量活性氧自由基； 或由于機(jī)體抗氧 化物質(zhì)不足，使促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡失常， 致使自由基與機(jī)的一些生 物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，生成大量氧化物或過氧化物，并進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡和組織損傷。業(yè)已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、 動(dòng)脈硬化、神經(jīng)退行性病變以及人類免疫缺陷病蠹(HIV)感染等均有密切關(guān)系D-半乳糖誘導(dǎo)的業(yè)急性衰老模型是按照衰老的代謝學(xué)說建立的，其機(jī)制與糖 代謝紊亂6、D-半乳糖醇中蠹7和活性氧自由基過剩有關(guān)；眾多研究表明是生 物體內(nèi)含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖時(shí)可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2 -)和H2O2;如果長(zhǎng)期人為地給予過量D-半乳糖，使機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生過量， 除了造成組織細(xì)胞直接損傷外，還導(dǎo)致抗氧化酶活力下降和過氧化產(chǎn)物積累，從 而表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的生化變化、免疫功能低下、基因表達(dá)與調(diào)控異常 細(xì)胞繁殖力下降及細(xì)胞退化性衰變等。有研究表明，D-半乳糖可降低人胚肺二倍 體成纖維細(xì)胞(HBS),從而使該細(xì)胞SOD活力降低和過氧化產(chǎn)物MDA增多，從 而起到加速細(xì)胞老化的作用。本文在前述章節(jié)已經(jīng)表明，鷹嘴豆蛋白酶解物具有體外抗氧化活性，但其在生物 體內(nèi)的作用效