TSH熒光酶免疫分析法

1、相關(guān)幫助 需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎 fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評(píng)估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺(tái) 需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進(jìn)行咨詢，期待您的加入第1頁/共55頁一、先天性甲低的新生兒篩查方法 1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoas

2、say，EIA) 2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) 3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA)第2頁/共55頁一、先天性甲低的新生兒篩查方法 4、時(shí)間分辨熒光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoassay 5、熒光酶免疫分析法FEIA fluoreseenceenzymeimmunoassay 6、自動(dòng)新生兒疾病篩查系統(tǒng)(automatednewbornscreeningsystem)第3頁/共55頁TSH熒光酶免疫分析法第4頁/共55頁1、原 理第5頁/共55頁1原理 熒光酶免疫分析

3、法(FEIA)是一種高度靈敏的檢測(cè)方法，用FEIA測(cè)定血hTSH基于一步夾心法原理，采用固相、雙位點(diǎn)熒光酶免疫分析法。 干血斑中洗滌出的hTSH，同時(shí)與包被在酶標(biāo)板上抗hTSH的單克隆抗體分子和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗hTSH亞基的第二抗體結(jié)合。第6頁/共55頁被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原有兩個(gè)抗原決定簇 故叫雙位點(diǎn)位點(diǎn)位點(diǎn)第7頁/共55頁TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體包被在反應(yīng)板上的TSH單克隆抗體故叫固相第8頁/共55頁HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP位點(diǎn)第9頁/共55頁TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH

4、抗原HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HRPHRPHRPTSHTSH單克隆抗體的酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)。（一步法）單克隆抗體的酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)。（一步法）PH：6.5第10頁/共55頁TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HRPHRPHRPHPR標(biāo)記的抗T

5、SH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HRPHRP第11頁/共55頁TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRPHRPHRP第12頁/共55頁TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRPHRPHRPPH：7.8第13頁/共55頁2HPPA+H2O2

6、DPDPA+2H2OHRP第14頁/共55頁原理 以甘氨酸緩沖液終止酶反應(yīng)。PH：10.3第15頁/共55頁原理 用熒光讀數(shù)儀以320nm為激發(fā)光，405nm為發(fā)射光測(cè)定熒光值。由于熒光強(qiáng)度與酶標(biāo)反應(yīng)板上結(jié)合的hTSH數(shù)量成正比，因此，通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)血斑熒光值和樣本的熒光值，也就可換算出樣本血斑中hTSH的含量。第16頁/共55頁特點(diǎn)： 熒光物質(zhì)為DPDPA，是由HPPA與雙氧水在HRP的作用下脫氫結(jié)合而成，它吸收特定波長（320nm）的光能后，發(fā)生原子重排，同時(shí)發(fā)射出更長波長（405nm）的光。 激發(fā)光波長320nm發(fā)光波長405nm第17頁/共55頁特點(diǎn)： 鑒于HPPA（3-P-羥基苯

7、丙酸）敏感性高、動(dòng)力學(xué)范圍廣，已被廣泛用于替代傳統(tǒng)EIA顯色劑，作為辣根過氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可檢測(cè)極低和極高濃度，具有明顯優(yōu)勢(shì)，由于hTSH樣本正常值與非正常值之間差異大，故該法特別適用于hTSH檢測(cè)。第18頁/共55頁特點(diǎn)： HPPAH2O2反應(yīng)生成的熒光強(qiáng)度的影響因素中，最重要的是底物濃度、反應(yīng)液和終止液的pH值。酶反應(yīng)最佳pH值為7.8。加入堿性緩沖液終止酶反應(yīng)，又可顯著增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。經(jīng)測(cè)定，使用pH10.3、1.5 molL甘氨酸緩沖液可獲得最大熒光強(qiáng)度。在低濃度hTSH下，該緩沖液可使熒光強(qiáng)度增加5倍，當(dāng)hTSH濃度高于80mIUL時(shí)，增強(qiáng)作用依次減弱。第19

8、頁/共55頁特點(diǎn)： 熒光產(chǎn)物穩(wěn)定，可放置過夜后測(cè)定。無論在室溫(2025)或30孵育用FEIA測(cè)定hTSH的敏感性無變化；而在37條件下孵育會(huì)增加背景熒光，降低靈敏度。建議底物孵育溫度為2030。第20頁/共55頁特點(diǎn) FEIA檢測(cè)法方法先進(jìn)，重復(fù)性高。 一般情況下，批內(nèi)分析變異系數(shù)和批間分析變異系數(shù)均小于10。第21頁/共55頁特點(diǎn) 應(yīng)用FEIA法進(jìn)行hTSH檢測(cè)時(shí)，其他垂體激素和人絨毛膜促性腺激素(HCG)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾極小。第22頁/共55頁2、儀器和試劑第23頁/共55頁以下儀器均由芬蘭Labsystems公司提供第24頁/共55頁(1)、儀器： 、熒光讀數(shù)儀；、孵育振蕩儀；、自動(dòng)洗板儀

9、；、3mm打孔器，或打孔鉗；、加樣器；八道加樣器。以上儀器均由芬蘭Labsystems公司提供。、3mm實(shí)驗(yàn)血片塑料支架；、電腦、打印機(jī)；、冰箱。第25頁/共55頁材料 、新生兒篩查濾紙干血斑標(biāo)本：用S&S903濾紙，按新生兒疾病篩查濾紙干血斑標(biāo)本采集方法采集；第26頁/共55頁試劑第27頁/共55頁試劑 、抗hTSH包被的酶標(biāo)板（1）：抗hTSH抗體IgG(小鼠單克隆抗體)包被的酶標(biāo)板，濃度1.0g/m1。所有包被酶標(biāo)板均置于有干燥劑的錫箔密封袋中以防止潮濕。潮濕將破壞酶標(biāo)板的包被，嚴(yán)重縮短試劑盒保存期。試劑盒通常儲(chǔ)存在28，為防止打開錫箔密封袋時(shí)水蒸氣凝結(jié)破壞酶標(biāo)板性能，試劑盒使用

10、前需置室溫半小時(shí)后再打開。若錫箔密封袋在使用前受損或干燥劑變色，請(qǐng)勿使用；第28頁/共55頁 、抗hTSHHRP酶結(jié)合物（2） ：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗hTSH(小鼠單克隆抗體濃度50ngIgGm1)抗體，加02的KathonCGe作為防腐劑；第29頁/共55頁 、酶結(jié)合物稀釋液（3） ：緩沖鹽溶液，pH6.5，加0.2的KathonCG作為防腐劑。用于酶結(jié)合物的稀釋；試劑第30頁/共55頁 、HPPA熒光底物（4a） ：3P羥基苯丙酸溶于Tris緩沖液(pH7.8)中，加0.2的KathonCGe作為防腐劑；第31頁/共55頁 、H2O2溶液（4b） ：檸檬酸醋酸緩沖液，pH6.0，含過氧化

11、氫。避免與氧化還原劑接觸；第32頁/共55頁 、終止液：甘氨酸緩沖液（5） ，pH10.3；第33頁/共55頁 、洗滌液（6） ：含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液，加入0.05Bronidox作為防腐劑。按1:9比例加入蒸餾水稀釋。由于儲(chǔ)于4可能形成結(jié)晶，稀釋前溫度需達(dá)1830；第34頁/共55頁 、hTSH標(biāo)準(zhǔn)品（7） ：TSH存在于干血濾紙片的血斑中，包括一個(gè)零空白。存于裝有干燥劑的鋁箔袋中。加入0.05Bronidox作為防腐劑。標(biāo)準(zhǔn)品由紅細(xì)胞壓積為50一55的人血液制得，所含的hTSH濃度經(jīng)過WHO2nd IRP(80558)校正；第35頁/共55頁 、質(zhì)控物（8） ：hTSH存在于濾紙上的

12、干血濾紙血斑中。加入005Bronidox作為防腐劑。1張濾紙中具有5套2種濃度質(zhì)控物(品)，存于裝有干燥劑的鋁箔袋中。 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控物(品)的TSH濃度有批號(hào)差異，需參照每一試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控物(品)的記錄單。第36頁/共55頁試劑盒內(nèi)的TSH標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控物的濃度第37頁/共55頁3、實(shí)驗(yàn)操作第38頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (1)用編碼機(jī)給每一張血片按次序蓋上卡片號(hào)，此卡片號(hào)也就是我們的檢驗(yàn)編號(hào)。 在檢驗(yàn)前，所有的試劑和酶標(biāo)反應(yīng)板應(yīng)放置室溫平衡30分鐘。第39頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (2)做好實(shí)驗(yàn)登記，包括檢測(cè)日期、檢測(cè)區(qū)間、復(fù)查樣本號(hào)等。 編寫好實(shí)驗(yàn)操作卡；把本次實(shí)驗(yàn)要做的標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控

13、、復(fù)查標(biāo)本、重查標(biāo)本及常規(guī)標(biāo)本的卡片號(hào)在電腦中用不同的顏色的字打印出來，看上去一目了然，嚴(yán)防打孔時(shí)張冠李戴。第40頁/共55頁試劑批號(hào)：163ZC1 標(biāo)準(zhǔn)濃度：1、9、20、44、66、87。質(zhì)控批號(hào)：163ZC1 范 圍：高值：14-37，中值26。低值：0-5，中值3.0。佛山市新生兒疾病篩查中心實(shí)驗(yàn)操作卡 檢測(cè)項(xiàng)目: TSH 檢測(cè)時(shí)間: 2003年11月11日 操作者：第41頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 （3）對(duì)照操作卡在濾紙血斑上打下直徑3mm的標(biāo)準(zhǔn)品(雙孔)、質(zhì)控物(品)(雙孔)和標(biāo)本，并依次放置到抗hTSH包被的酶標(biāo)板孔內(nèi)。注意：為避免層析效應(yīng)，應(yīng)圍繞血樣點(diǎn)中央對(duì)稱地打孔。第42頁/共

14、55頁血斑打孔的位置打孔時(shí)要選擇合格的血斑，同時(shí)要選擇合適的地方，兩面都要看一下。由于層析效應(yīng)中心位比周邊位的濃度要高10%左右。正確太靠邊太中心第43頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (4)加入200l抗hTSHHRP酶結(jié)合物。然后用膠膜覆蓋密封。 配制抗hTSHHRP酶結(jié)合物溶液：一個(gè)酶標(biāo)反應(yīng)板需配量，200l酶結(jié)合物（2號(hào)溶液）加20ml酶結(jié)合物稀釋液（3號(hào)溶液）。第44頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (5)選擇以下步驟進(jìn)行孵育：過程A：室溫(1830)振蕩孵育3小時(shí)，振蕩速率650轉(zhuǎn)分。過程B：室溫(1830)振蕩15分鐘，4過夜孵育。備注：室溫超過30，最好選擇過程B孵育，以避免高本底干擾。第45

15、頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (6)洗板 手工洗滌：去掉溶液和濾紙片， 每孔加入300l的洗滌液，倒去孔內(nèi)液體并拍打，使孔內(nèi)無殘液，重復(fù)操作4次，倒置于紙巾上； 洗板儀洗滌：洗滌液每孔400l，先洗滌一次，甩掉溶液和濾紙片，再重復(fù)洗滌4次。 使用電動(dòng)打孔去紙片系統(tǒng)可簡化實(shí)驗(yàn)操作。如Labsystems公司的電動(dòng)打孔器可將樣品固定在一次性塑料支架上，將帶有樣品紙片的支架插入酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。孵育結(jié)束后，樣品紙片和支架一同去除。第46頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟 (7)每孔加入200l底物溶液。底物溶液的配制：每個(gè)3酶標(biāo)反應(yīng)板配60ml，即50mlHPPA溶液（4a溶液）加10ml雙氧水溶液（4b溶

16、液）。 (8)室溫1830振蕩孵育l小時(shí)。 (9)每孔加入100l終止液，即甘氨酸緩沖液（5號(hào)溶液） 。 (10)在60分鐘內(nèi)，用熒光讀數(shù)儀測(cè)定各孔的熒光值。第47頁/共55頁實(shí)驗(yàn)操作步驟打孔第48頁/共55頁4、結(jié)果計(jì)算第49頁/共55頁結(jié)果計(jì)算 測(cè)量結(jié)束后，可利用電腦工作軟進(jìn)行自動(dòng)處理繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推薦使用線性坐標(biāo)，選擇光滑曲線。也可使用手工計(jì)算。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控物和標(biāo)本的TSH濃度。在試劑盒中均應(yīng)有質(zhì)控物(品)和其期望值，只有當(dāng)質(zhì)控物(品)測(cè)定值在其范圍內(nèi)，該次實(shí)驗(yàn)才能視為合格。第50頁/共55頁結(jié)果計(jì)算 發(fā)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 做好結(jié)果的登記。 保存好結(jié)果的原始資料。第51頁/共55頁5注

17、意事項(xiàng)第52頁/共55頁注意事項(xiàng) (1)所用試劑需正確儲(chǔ)存，不恰當(dāng)?shù)谋４娣绞娇赡茉斐蔁晒獗尘霸黾?，?biāo)準(zhǔn)曲線斜率降低，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)精確度。試劑一般儲(chǔ)存在28。 (2)勿使用過期試劑。 (3)不同批次試劑不可混合或互換。 (4)開始檢測(cè)前，把試劑盒內(nèi)所用的試劑和酶標(biāo)板放置室溫平衡30分鐘。 (5)建議每塊酶標(biāo)板都使用標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控物(品)，并作雙孔。 (6)勿互換試劑瓶蓋。第53頁/共55頁注意事項(xiàng) (7)從試劑瓶中轉(zhuǎn)移液體時(shí)，使用無菌的移液管以避免污染，否則由于試劑污染可能產(chǎn)生不正確的結(jié)果。 (8)檢測(cè)一旦開始，隨后的步驟應(yīng)連續(xù)地進(jìn)行下去，不要中斷。 (9)加樣時(shí)勿接觸孔壁，以避免孔間交叉污染。(

18、10)孵育時(shí)間的輕微變化是允許的，首次孵育和二次孵育許可時(shí)間分別為：3小時(shí)土10分鐘和1小時(shí)土5分鐘。 (11)使用過夜孵育過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可獲得較高的重復(fù)性。 (12)空氣的潔凈度可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第54頁/共55頁 第55頁/共55頁TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標(biāo)記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測(cè)TSH抗原被測(cè)TSH抗原HRPHRPHRPTSHTSH單克隆抗體的酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)。（一步法）單克隆抗體的酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)。（一步法）PH：6.5第10頁/共55頁原理 用熒光讀數(shù)儀以320nm為激發(fā)光，405nm為發(fā)射光測(cè)定熒光值。由于熒光強(qiáng)度與酶標(biāo)反應(yīng)板上結(jié)合的hTSH數(shù)量成正比，因此，通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)血斑熒光值和樣本的熒光值，也就可換算出樣本血斑中hTSH的含量。第16頁/共55頁特點(diǎn)： 鑒于HPPA（3-P-羥基苯丙酸）敏感性高、動(dòng)力學(xué)范圍廣，已被廣泛用于替代傳統(tǒng)EIA顯色劑，作為辣根過氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可檢測(cè)極低和極高濃度，具有明顯優(yōu)勢(shì)，由于hTSH樣本正常值與非正常值之間差異大，故該法特別適用于hTSH檢測(cè)。第18頁/共55頁以下儀器均由芬蘭Labsy