子宮內(nèi)膜癌I型和II型全基因表達(dá)譜初步分析

1、子宮內(nèi)膜癌I型和II型全基因表達(dá)譜初步分析 作者：郭遂群1；邢福祺1；龐占軍1；方唯意1；劉國炳1(南方醫(yī)科大學(xué)1南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，2腫瘤研究所，廣東  廣州  510515)摘要：目的  分析子宮內(nèi)膜癌I型和II型全基因表達(dá)譜。方法  利用6張Affymetrix全基因組基因芯片，分析兩者之間在表達(dá)譜上的差異，結(jié)合生物信息分析。 結(jié)果  許多基因明顯在雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，其中，一些基因涉及了雌激素依賴型中雌激素的代謝與轉(zhuǎn)化，另外一些基因可能為雌激素調(diào)節(jié)基因。CYP2C9參與了雌激素酮

2、硫酸鹽轉(zhuǎn)化為16-羥基硫酸鹽代謝；DDC能與類固醇受體結(jié)合，增強類固醇受體的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論  某些基因在雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，為進(jìn)一步研究此類基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過程的作用及預(yù)后奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：子宮內(nèi)膜腫瘤；基因芯片；生物信息分析；雌激素依賴型中圖分類號：R737.33; R392.3  文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A   文章編號：1673-4254(2006)06-0734-04Preliminary study of gene expression profiling in human type I and II endometr

3、ial carcinomaGUO Sui-qun1； XING Fu-qi1； PANG Zhan-jun1； FANG Wei-yi2； LIU Guo-bing11Department of Gynaecology and Obstetrics, Nanfang Hospital, 2Institute of Cancer Research, Southern Medical University, Guangzhou 510515, ChinaAbstract: Objective To study gene expression profiling in human type I an

4、d II endometrial carcinoma. Methods Six Affymetrix human genome genechips were utilized to investigate the differences in gene expression profiles between type I and II endometrial carcinoma with bioinformatic analysis. Results Many genes were highly expressed in estrogen-dependent endometrial carci

5、noma, and some of them were involved in the metabolism and conversion of estrogen, while some others in estrogen regulation. CYP2C9, for instance, was involved in the conversion of estrogen sulfate to 16-hydroxy sulfate metabolite, DDC in estrogen-dependent pathogenesis of endometrial carcinoma poss

6、ibly by DDC interaction with AR to enhance steroid receptor transcription. Conclusion High expression of these genes in estrogen-dependent endometrial carcinoma may provide insights into their roles in the pathogenesis and prognosis of this malignancy.Key words: endometrial neoplasm; genechips; bioi

7、nformatic analysis; estrogen-dependent收稿日期：2006-01-18基金項目：廣東省自然科學(xué)基金(5004777)Natural Science Foundation of Guangdong Province(5004777)作者簡介：郭遂群(1964-)，男，在讀博士研究生，副教授、副主任醫(yī)師，電話E-mail:guosq     在美國子宮內(nèi)膜癌是一種最常見的女性生殖道惡性腫瘤，在所有的腫瘤中排名第四，僅次于乳腺癌、肺癌和大腸癌1。在我國子宮內(nèi)膜癌也已成為女性最常見的惡性腫瘤之一。2

8、0多年前，Bohkman2就子宮內(nèi)膜癌提出了二元模型，即子宮內(nèi)膜癌I型和II型，現(xiàn)在已逐漸被人們所接受。DNA微陣列的運用目前在基因篩選3、目標(biāo)基因的鑒定4、路徑作圖5、毒理學(xué)6、分子診斷7等研究中發(fā)揮了較大的作用。本研究通過Affymetrix 全基因組基因芯片，整體上比較子宮內(nèi)膜癌兩種亞型之間的基因表達(dá)譜，希望能找到與雌激素代謝、轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)等相關(guān)的基因，為進(jìn)一步研究這些基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過程中的作用及預(yù)后奠定基礎(chǔ)。    1  資料和方法    1.1 標(biāo)本  

9、0; 雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)陽性的3例子宮內(nèi)膜癌和3例無ER和PR表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本，分別取自于圍絕經(jīng)期婦女和絕經(jīng)后婦女。標(biāo)本源于南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)臨床病理診斷為低分化子宮內(nèi)膜癌。    1.2 基因芯片實驗    6例低分化子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本常規(guī)用Trizol(Invitrogen公司)提取總RNA并純化后，mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA并用生物素標(biāo)記，與寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。芯片圖像掃描后經(jīng)軟件處理，雜交信號以數(shù)據(jù)的形式輸出。掃描后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)一步經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處

10、理后得到標(biāo)準(zhǔn)化的各探針組的“報告信號值”。當(dāng)探針組各PM-MM探針對表達(dá)信號檢驗P<0.04時，判定該基因或EST在樣品中表達(dá)；當(dāng)P>0.06時，判定該基因或EST在樣品中不表達(dá)。該基因或EST介于表達(dá)與不表達(dá)之間時以M代表。利用統(tǒng)計學(xué)方法比較子宮內(nèi)膜癌I型和II型兩種樣品之間探針雜交熒光強度比值，建立兩者之間的基因差異表達(dá)譜。整個雜交和分析實驗由上海晶泰公司完成。    1.3 Gostat分析    利用網(wǎng)站(.au/)可幫助分析這類基因，并提供關(guān)于包含這類

11、數(shù)據(jù)GO術(shù)語的統(tǒng)計表，分類GO注解，首先給出最有代表性的GO術(shù)語。隨后，我們將3組一致性差異表達(dá)基因在1倍以上的篩選出來，利用Gostat對其功能進(jìn)行了分析。    1.4  MILANO分析    MILANO89分析(http:/milano.md.huji.ac.il/)是一個在線網(wǎng)站，指能在PubMed中自動搜索文章里包含的搜索術(shù)語(例如來自于微陣列中的一列基因)共出現(xiàn)事件。通過這種方式，我們能快速找到所要的文獻(xiàn)，以了解基因的功能。    1.5

12、半定量RT-PCR驗證部分基因芯片實驗結(jié)果    6例子宮內(nèi)膜癌各100 mg于研缽里液氮中研碎后，常規(guī)Trizol提取總RNA。隨后DNaseI處理以消除痕量基因組DNA。6個基因被隨機選擇，分別為IFNG、FGF1、ORm2、CXCL5、LY6D和LEFTY1，選用的內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)基因為GAPDH。按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR操作流程完成實驗，采用電泳后灰度掃描測量每個樣品中目標(biāo)基因在特定循環(huán)條件下擴增得到的產(chǎn)物量，以各自的GAPDH讀數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)計算每個樣品的相對表達(dá)值，然后以對照樣品的數(shù)值計算實驗樣品的表達(dá)變化比值。   

13、60;2  結(jié)果    2.1  子宮內(nèi)膜癌I型與II型之間的表達(dá)譜差異    人類基因組(Human Genome)U133 Plus 2.0基因芯片一共有54 614個探針組，分析47 000個轉(zhuǎn)錄本和變異體，其中包括了可能的38 500個已知基因。我們利用該芯片比較了3組激素依賴型和激素非依賴性子宮內(nèi)膜癌基因表達(dá)差異變化(表1)，發(fā)現(xiàn)所有上調(diào)基因和EST序列為2971個，其中差異倍數(shù)在1倍以上者888，2倍以上者222個；下調(diào)基因和EST為3812，其中差異倍數(shù)在1倍以

14、上者2301個，2倍以上者742個。     2.2  Gostat分析結(jié)果    在線Gostat分析通過基因芯片分析得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能歸類，許多功能相同的基因聚在一起組成多個不同功能的基因群(表2)。    2.3  MILANO分析結(jié)果    我們在Primary Search Term框內(nèi)分別粘貼各組芯片中的差異表達(dá)基因，Secondary Search Term 框內(nèi)輸入estr

15、ogen和endometrial carcinoma，在子宮內(nèi)膜癌I型與II型差異上調(diào)表達(dá)基因中，一共有888個基因經(jīng)過2666次查詢，在下調(diào)表達(dá)基因中，一共有2300個基因經(jīng)過6904次查詢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，為數(shù)不多的基因在子宮內(nèi)膜癌與雌激素研究中出現(xiàn)過。    2.4半定量RT-PCR 比值及其與基因芯片比值比較    所有目標(biāo)基因都有明顯的特異性擴增產(chǎn)物，灰度比值與基因芯片的數(shù)據(jù)大致吻合，反應(yīng)了大體一致的變化趨勢，說明芯片的結(jié)果是基本可靠的。用半定量RT-PCR 比值與基因芯片比值比較，以了解兩者之間在定量水平以及

16、反應(yīng)變化的趨勢關(guān)系。我們比較了3張芯片中的T-ratio平均比值與半定量RT-PCR T-ratio平均比值，然后將兩者進(jìn)行了比較。從圖2可以看出，基因芯片所有6個基因，高表達(dá)基因的比值明顯高于半定量RT-PCR 比值，而低表達(dá)基因的比值也都低于半定量RT-PCR 比值，但相差程度不是很大，兩者的變化趨勢基本吻合。只是由于基因芯片檢測靈敏度更高，差異倍數(shù)也更高。     3  討論    早期研究中認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與無孕激素對抗的雌激素長期刺激有直接關(guān)系，是一種雌激素依賴性腫瘤，其發(fā)現(xiàn)較早

17、，預(yù)后較好。但是在臨床實際工作中發(fā)現(xiàn)部分患者，尤其是絕經(jīng)后患者，并無內(nèi)源性或外源性高雌激素的表現(xiàn)，而且激素治療效果不好，預(yù)后較差。新近Clement和Young10在Bohkman等研究的基礎(chǔ)上正式提出了可能存在兩種類型子宮內(nèi)膜癌的新的功能分型，即雌激素依賴型(I型)和非雌激素依賴型(II型)。這一新的功能分型對于子宮內(nèi)膜癌的治療、預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。兩種不同類型的子宮內(nèi)膜癌在臨床病理特征方面存在顯著差異，并可能是由腫瘤內(nèi)在生物學(xué)特性不同所決定的。漿液性腺癌和透明細(xì)胞癌多為非雌激素依賴型1112。子宮漿液性腺癌及大部分透明細(xì)胞癌的癌周內(nèi)膜萎縮，p53和ki-67表達(dá)高，ER、PR陰性。

18、雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌ER、PR表達(dá)較高，p53和ki-67表達(dá)低。Tritz13對子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行了基因雜合性缺失研究發(fā)現(xiàn)，雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌的雜合性缺失率為44.44%(8/18)，最常見的缺失部位是17、13、12號染色體，發(fā)生率分別為22%、20%和19%，而非雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌的雜合性缺失率為100%(13/13)，最常見的缺失部位是17、14、12號染色體，發(fā)生率分別為83%、77%和44%。由此可見兩種類型子宮內(nèi)膜癌在基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)等方面均存在著明顯差異。    雖然對雌激素依賴型和非雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌的組織類型、DNA倍體、

19、細(xì)胞分化程度、子宮肌層浸潤深度、激素受體、激素水平、細(xì)胞增殖因子、基因雜合性缺失以及一些常見的分子標(biāo)記如p53、ras等進(jìn)行了初步研究15，但有關(guān)兩種類型子宮內(nèi)膜癌的基因水平的比較研究還甚為少見，更未見有關(guān)從基因組水平探討兩種類型子宮內(nèi)膜癌基因表達(dá)譜研究的報道。我們利用Affymetrix全基因組芯片一共找到所有上調(diào)基因和EST序列為2971個，下調(diào)基因和EST為3812個，說明兩者在基因表達(dá)譜上差異較大。隨后，Gostat分析發(fā)現(xiàn)在50個主要GOs分類中，子宮內(nèi)膜癌I型與II型差異表達(dá)基因的上調(diào)基因主要涉及了氨基酸及其衍生物代謝、細(xì)胞外腔隙、核酸結(jié)合生長因子活性及氧化還原酶活性，對供體CH-

20、OH基的作用，作為受體的 NAD 或 NADP等。而在下調(diào)基因中，這些基因主要涉及了免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘連、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淋巴細(xì)胞激活及細(xì)胞交流等。上調(diào)與下調(diào)基因共同涉及了細(xì)胞增殖、趨化性、炎性反應(yīng)、器官發(fā)育、細(xì)胞外腔隙及對有害物質(zhì)病原或寄生蟲的反應(yīng)等。子宮內(nèi)膜癌I型與II型差異表達(dá)基因功能存在著如此大的差別，提示這兩型子宮內(nèi)膜癌在生物學(xué)的特性上也存在著較大差異。    在隨后MILANO分析中，一些基因涉及了雌激素的代謝，還有一些為雌激素調(diào)節(jié)基因。如CYP2C9基因，編碼了細(xì)胞色素P450超家族酶成員中的一員，涉及代謝、合成膽固醇、類固醇和其他脂質(zhì)。Modug

21、no等15利用半定量RT-PCR分析29對乳腺癌及非癌旁臨近組織CYPs mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)僅僅只有4個CYPs( CYP1A1、CYPB1、CYP2C9、CYP3A4)在乳腺癌及非癌旁臨近組織能檢測到表達(dá)，其中CYP1A1、CYPB1、CYP3A4涉及了雌二醇羥基化作用，CYP2C9參與了雌激素酮硫酸鹽轉(zhuǎn)化為16-羥基硫酸鹽代謝。CYP2C9高表達(dá)是由于雌激素的高表達(dá)而誘導(dǎo)，參與了雌激素的代謝。Wafa16利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，L-dopa decarboxylase(DDC)能與androgen受體(AR)相互作用，增強類固醇受體的轉(zhuǎn)錄活性，或許與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。該基因在子宮內(nèi)膜癌I

22、型中表達(dá)，或許也是通過類似作用，參與了雌激素(類固醇激素)依賴的子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。SOCS-3是細(xì)胞信號蛋白家族抑制子，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子作用。Matthews等17研究發(fā)現(xiàn)ER-alpha能直接調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞中人SOCS-3啟動子的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性。Leong等18發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人肝細(xì)胞中，雌激素能以時間和劑量依賴的方式增加SOCS-3的表達(dá)。用雌激素長期處理野生型和ER-beta基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，肝臟SOCS-3被誘導(dǎo)表達(dá)升高23倍，而ER-alpha基因敲除小鼠卻無SOCS-3表達(dá)上調(diào)。這提示雌激素通過ER-alpha上調(diào)肝細(xì)胞SOCS-3的表達(dá)。該基因在子宮內(nèi)膜癌I型中高表

23、達(dá)，主要也是由于雌激素誘導(dǎo)所致，可能參與腫瘤的發(fā)病過程。    參考文獻(xiàn)：    1Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005J. CA Cancer J Clin, 2005, 55(1): 10-30.    2Bokhman JV. Two pathogenetic types of endometrial carcinomaJ.  Gynecol Oncol, 1983, 15

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