香豆素分析（課堂PPT）

1、12l香豆素及其衍生物是中藥中的主要成分之一，香豆素及其衍生物是中藥中的主要成分之一，具有多種生理活性，臨床上用于止咳、利尿、具有多種生理活性，臨床上用于止咳、利尿、抗菌、抗放射、抗凝血等?？咕?、抗放射、抗凝血等。3舉例舉例定量分析定量分析定性分析定性分析定義、分布、性質(zhì)定義、分布、性質(zhì)4n香豆素從結(jié)構(gòu)上可看成是順式的鄰羥基桂皮酸香豆素從結(jié)構(gòu)上可看成是順式的鄰羥基桂皮酸脫水而成的內(nèi)酯，基本母核為苯并脫水而成的內(nèi)酯，基本母核為苯并- -吡喃酮。吡喃酮。n 分子中苯核或分子中苯核或- - 吡喃酮環(huán)上常有取代基存在，吡喃酮環(huán)上常有取代基存在，如羥基、烷氧基、苯基、異戊烯基等如羥基、烷氧基、苯基、異戊

2、烯基等OHCOOH-H2OOO123456785香豆素按結(jié)構(gòu)分為香豆素按結(jié)構(gòu)分為n 簡單香豆素簡單香豆素只在苯環(huán)上有取代基的只在苯環(huán)上有取代基的n呋喃香豆素呋喃香豆素 線型（線型（6 6、7 7）；）； 角型（角型（7 7、8 8）n吡喃香豆素吡喃香豆素線型（線型（6 6、7 7）；）； 角型（角型（7 7、8 8）n其他香豆素其他香豆素 吡喃酮環(huán)上有取代基的吡喃酮環(huán)上有取代基的6n基本結(jié)構(gòu)即苯并基本結(jié)構(gòu)即苯并- -吡喃酮。吡喃酮。n苯環(huán)上常見羥基、甲氧基、亞甲二氧基苯環(huán)上常見羥基、甲氧基、亞甲二氧基和異戊烯基等取代基。和異戊烯基等取代基。 OOHOOOHOROOOCH3OCH3O傘形花內(nèi)酯傘

3、形花內(nèi)酯 七葉內(nèi)酯七葉內(nèi)酯 R = H R = H 濱蒿內(nèi)酯濱蒿內(nèi)酯 七葉苷七葉苷 R = glc R = glc 7n基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與呋喃環(huán)稠合，基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與呋喃環(huán)稠合，根據(jù)稠合位置可分為線型與角型。根據(jù)稠合位置可分為線型與角型。 8nC C6 6、C C7 7位與呋喃環(huán)稠合（位與呋喃環(huán)稠合（6 6位異戊烯基位異戊烯基與與7 7位羥基環(huán)合，降解失去三個(gè)碳原子）位羥基環(huán)合，降解失去三個(gè)碳原子）的衍生物，稱為線型。的衍生物，稱為線型。 OOOOOOOCH3OOOH3CCH3HO 補(bǔ)骨脂內(nèi)酯補(bǔ)骨脂內(nèi)酯 花椒毒內(nèi)酯花椒毒內(nèi)酯 紫花前胡內(nèi)酯紫花前胡內(nèi)酯 9n C C7 7、C

4、C8 8位與呋喃環(huán)稠合（位與呋喃環(huán)稠合（8 8位異戊烯基位異戊烯基與與7 7位羥基環(huán)合）的衍生物，稱為角型。位羥基環(huán)合）的衍生物，稱為角型。 異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯 茴芹內(nèi)酯茴芹內(nèi)酯 異佛手內(nèi)酯異佛手內(nèi)酯 OOOOOOOCH3CH3O OOOOCH310n基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與吡喃環(huán)稠合，基本結(jié)構(gòu)為香豆素母核苯環(huán)與吡喃環(huán)稠合，也分為線型和角型。也分為線型和角型。11nC C6 6、C C7 7位與吡喃環(huán)稠合（位與吡喃環(huán)稠合（6 6位異戊烯位異戊烯基與基與7 7位羥基環(huán)合）的衍生物。位羥基環(huán)合）的衍生物。 花椒內(nèi)酯花椒內(nèi)酯 OOOOOOOCH3美花椒內(nèi)酯美花椒內(nèi)酯122 27,8-7,8-

5、吡喃香豆素（角型）吡喃香豆素（角型） nC C7 7、C C8 8位與吡喃環(huán)稠合（位與吡喃環(huán)稠合（8 8位異戊烯基與位異戊烯基與7 7位羥基環(huán)合）的衍生物。位羥基環(huán)合）的衍生物。 邪蒿內(nèi)酯邪蒿內(nèi)酯 OOO OOOOOOCH3黃曲霉素黃曲霉素B1B113n具有抗凝血作用的紫苜蓿酚具有抗凝血作用的紫苜蓿酚( (sativolsativol) )屬雙屬雙香豆素類；茵陳炔香豆素類；茵陳炔( (capillonecapillone) )屬異香豆素屬異香豆素類。類。OOOHOHO O 紫苜蓿酚紫苜蓿酚 OO茵陳炔茵陳炔14n 香豆素類成分廣泛分布于植物界，如傘形香豆素類成分廣泛分布于植物界，如傘形科、夾竹

6、桃科、蘿藦科、菊科、十字花科、杜科、夾竹桃科、蘿藦科、菊科、十字花科、杜鵑花科、豆科、唇形科、蘭科、禾本科、蕓香鵑花科、豆科、唇形科、蘭科、禾本科、蕓香科、薔薇科、茄科、無患子科、瑞香科等植物科、薔薇科、茄科、無患子科、瑞香科等植物中均有較多分布。中均有較多分布。n 含有香豆素類化合物的常用中藥有白芷、秦含有香豆素類化合物的常用中藥有白芷、秦皮、獨(dú)活、前胡、阿魏、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、茵陳皮、獨(dú)活、前胡、阿魏、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、茵陳蒿、川芎、防風(fēng)、蛇床子等。蒿、川芎、防風(fēng)、蛇床子等。 1516171 12 23 34 418 多具芳香氣，能隨水蒸氣揮發(fā)或升華。多具芳香氣，能隨水蒸氣揮發(fā)或升華。 不溶于水或

7、難溶于水，可溶于石油醚、苯、不溶于水或難溶于水，可溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿或乙醇等溶劑中；一般含氧取乙醚、氯仿或乙醇等溶劑中；一般含氧取代基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解代基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解度比較小，冷的情況下更小。度比較小，冷的情況下更小。 在定量測定時(shí)，多用氯仿和乙醇來提取。在定量測定時(shí)，多用氯仿和乙醇來提取。 1 1192 2n香豆素類化合物分子中具香豆素類化合物分子中具,-,-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，具有內(nèi)酯化合物的通性。如在稀堿性條件下加具有內(nèi)酯化合物的通性。如在稀堿性條件下加熱可水解開環(huán)，生成易溶于水的順式鄰羥基桂熱可水解開環(huán)，生成易溶于水的順式鄰羥基桂

8、皮酸鹽。酸化后又閉環(huán)恢復(fù)為親脂性內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。皮酸鹽。酸化后又閉環(huán)恢復(fù)為親脂性內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。n與堿液長時(shí)間加熱，順式鄰羥基桂皮酸鹽則發(fā)與堿液長時(shí)間加熱，順式鄰羥基桂皮酸鹽則發(fā)生雙鍵構(gòu)型的異構(gòu)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的反式鄰羥生雙鍵構(gòu)型的異構(gòu)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的反式鄰羥基桂皮酸鹽，此時(shí)，再經(jīng)酸化也不能環(huán)合為內(nèi)基桂皮酸鹽，此時(shí)，再經(jīng)酸化也不能環(huán)合為內(nèi)酯。酯。 順式鄰羥基桂皮酸順式鄰羥基桂皮酸 反式鄰羥基桂皮酸反式鄰羥基桂皮酸OOOH-H+COO-O-OH-O-COO-203 3（1 1）異羥基肟酸鐵反應(yīng)：）異羥基肟酸鐵反應(yīng)： 因香豆素具有內(nèi)酯環(huán)，所以能與異羥基肟酸鐵因香豆素具有內(nèi)酯環(huán)，所以能與異羥基肟酸鐵反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅

9、色，可被用來鑒別和比色測定，反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色，可被用來鑒別和比色測定，其反應(yīng)如下：其反應(yīng)如下： OONH2OHNaOHONaNHOHOFe3+, H+ONaNHOOFe1321（2 2）酚類試劑反應(yīng)：）酚類試劑反應(yīng)： 因該類化合物多具酚羥基，能和常規(guī)酚類試劑因該類化合物多具酚羥基，能和常規(guī)酚類試劑反應(yīng)，如三氯化鐵、硝酸銀的氨溶液、三氯化鐵反應(yīng)，如三氯化鐵、硝酸銀的氨溶液、三氯化鐵- - 鐵氰化鉀。鐵氰化鉀。 如果香豆素化合物的如果香豆素化合物的C C6 6位上（即酚羥基的對位）位上（即酚羥基的對位）沒有取代基，則能和沒有取代基，則能和 EmersonEmerson試劑反應(yīng)現(xiàn)橙試劑反應(yīng)現(xiàn)橙 紅色

10、；紅色；與與GibbsGibbs試劑反應(yīng)現(xiàn)藍(lán)色。試劑反應(yīng)現(xiàn)藍(lán)色。 EmersonEmerson反應(yīng)是將香豆素類化合物溶于堿性溶液反應(yīng)是將香豆素類化合物溶于堿性溶液中，加入中，加入2% 4- 2% 4- 氨基安替比林溶液數(shù)滴及氨基安替比林溶液數(shù)滴及8%8%鐵氰化鐵氰化鉀溶液鉀溶液2323滴即可顯色，其反應(yīng)如下：滴即可顯色，其反應(yīng)如下： OOCOO-OHOH-+NNC6H5OCH3NCOO-OHNNC6H5OCH3NH2CH3CH3224 4（1 1）香豆素類化合物在紫外光的照射下顯藍(lán)色）香豆素類化合物在紫外光的照射下顯藍(lán)色熒光，不但作為定性鑒別，而且作為定量測定熒光，不但作為定性鑒別，而且作為定

11、量測定依據(jù)。依據(jù)。 但具有熒光的化合物不一定都是香豆素，如咖但具有熒光的化合物不一定都是香豆素，如咖啡酸、綠原酸等在啡酸、綠原酸等在UVUV下也能呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，二下也能呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，二氫黃酮?jiǎng)t呈天藍(lán)色熒光。氫黃酮?jiǎng)t呈天藍(lán)色熒光。 此外，個(gè)別的香豆素類化合物（如雙香豆素）此外，個(gè)別的香豆素類化合物（如雙香豆素）不產(chǎn)生熒光。不產(chǎn)生熒光。 23（2 2）羥基香豆素在紫外光下有強(qiáng)的熒光，不難辨）羥基香豆素在紫外光下有強(qiáng)的熒光，不難辨認(rèn)；呋喃香豆素較弱，但也能在紫外光下顯示藍(lán)、認(rèn)；呋喃香豆素較弱，但也能在紫外光下顯示藍(lán)、紫、棕、綠、黃等色。必要時(shí)可噴紫、棕、綠、黃等色。必要時(shí)可噴10% KOH10% K

12、OH醇液，醇液，或或20% SbCl20% SbCl3 3氯仿液以顯色。氯仿液以顯色。 （3 3）香豆素類化合物羥基和芳環(huán)形成的共軛體）香豆素類化合物羥基和芳環(huán)形成的共軛體系具較強(qiáng)的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物系具較強(qiáng)的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物在不同在不同pHpH條件下表現(xiàn)不同的光譜特性，對該類成條件下表現(xiàn)不同的光譜特性，對該類成分的分析具重要意義。分的分析具重要意義。 24 熒光法熒光法 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 薄層色譜法薄層色譜法 高效液相法高效液相法 氣相色譜法氣相色譜法251 1熒光反應(yīng)熒光反應(yīng) （1 1）秦皮的鑒別）秦皮的鑒別 取秦皮，加熱水浸泡，浸出液在日光下可見碧取秦皮，加

13、熱水浸泡，浸出液在日光下可見碧藍(lán)色熒光。藍(lán)色熒光。（2 2）前胡的鑒別）前胡的鑒別 取前胡粉末取前胡粉末1g1g，加乙醚，加乙醚10ml10ml，浸漬，浸漬2h2h后，取乙后，取乙醚液醚液2 2 滴，分別點(diǎn)于兩張小濾紙片上，置紫外滴，分別點(diǎn)于兩張小濾紙片上，置紫外光燈（光燈（365nm365nm）下觀察，顯淡天藍(lán)色熒光。然后）下觀察，顯淡天藍(lán)色熒光。然后滴加滴加1515氫氧化鈉溶液數(shù)滴，氫氧化鈉溶液數(shù)滴，2 min2 min后熒光消失后熒光消失。將一張濾紙片避光保存，另一張濾紙片曝光。將一張濾紙片避光保存，另一張濾紙片曝光，約，約3h3h后，置紫外光燈（后，置紫外光燈（365nm365nm）下

14、觀察，曝光）下觀察，曝光者天藍(lán)色熒光加強(qiáng)，避光者不顯熒光。者天藍(lán)色熒光加強(qiáng)，避光者不顯熒光。262 2顏色反應(yīng)顏色反應(yīng) （1 1）蛇床子的鑒別）蛇床子的鑒別 取蛇床子粉末取蛇床子粉末2g2g，加乙醇，加乙醇20ml20ml，加熱回流，加熱回流30min30min，濾過。取濾液數(shù)滴，點(diǎn)于白瓷板上，置紫外光，濾過。取濾液數(shù)滴，點(diǎn)于白瓷板上，置紫外光燈（燈（365nm365nm）下觀察，顯藍(lán)紫色熒光；）下觀察，顯藍(lán)紫色熒光； 另取濾液另取濾液 2ml2ml，加等量的，加等量的3 3碳酸鈉溶液，加熱碳酸鈉溶液，加熱5min5min，放冷，再加新制的重氮對硝基苯胺試液，放冷，再加新制的重氮對硝基苯胺試液

15、1212滴，即顯櫻紅色。滴，即顯櫻紅色。27（2 2）白芷的鑒別）白芷的鑒別 取少量樣品粉末，加乙醚，振搖取少量樣品粉末，加乙醚，振搖5min5min后靜后靜置置20min20min，取上清液，取上清液 1ml1ml，加入，加入7%7%鹽酸羥胺鹽酸羥胺甲醇溶液甲醇溶液2323滴，滴，20%KOH20%KOH甲醇溶液甲醇溶液2323滴滴，搖勻，在水溶上微熱，冷卻后加稀鹽酸，搖勻，在水溶上微熱，冷卻后加稀鹽酸調(diào)到調(diào)到pH 3 4pH 3 4，然后加入，然后加入1%1%三氯化鐵乙醇三氯化鐵乙醇溶液溶液1212滴，溶液顯紫紅色。滴，溶液顯紫紅色。28 1 1應(yīng)用特點(diǎn)應(yīng)用特點(diǎn) 薄層色譜法可用于含多類成分

16、的中藥的鑒別，可用標(biāo)準(zhǔn)薄層色譜法可用于含多類成分的中藥的鑒別，可用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)藥材對照，再與上述熒光反應(yīng)、顏色反應(yīng)配品或標(biāo)準(zhǔn)藥材對照，再與上述熒光反應(yīng)、顏色反應(yīng)配合，即可方便、快速鑒別含香豆素類化合物的中藥。合，即可方便、快速鑒別含香豆素類化合物的中藥。 因香豆素類成分大都具熒光，含香豆素類中藥提取物，因香豆素類成分大都具熒光，含香豆素類中藥提取物，在硅膠板上的色譜指紋圖具一定的鑒別意義，在硅膠板上的色譜指紋圖具一定的鑒別意義， 可用化學(xué)對照品對照；可用化學(xué)對照品對照； 可以使用經(jīng)準(zhǔn)確鑒定學(xué)名的標(biāo)準(zhǔn)藥材做對照品；可以使用經(jīng)準(zhǔn)確鑒定學(xué)名的標(biāo)準(zhǔn)藥材做對照品；29 硅膠薄層色譜常用的展開系統(tǒng)有：硅膠

17、薄層色譜常用的展開系統(tǒng)有：n氯仿；氯仿；n含含1.5%1.5%乙醇氯仿；乙醇氯仿；n乙醚乙醚- - 苯（苯（1 1：1 1）；）；n乙醚乙醚- - 苯苯- 10%- 10%乙酸（乙酸（1 1：1 1：1 1）等）等30白芷的薄層定性分析白芷的薄層定性分析n 取白芷粉末取白芷粉末0.5g0.5g，加乙醚，加乙醚10ml10ml，浸泡，浸泡1h1h，時(shí)時(shí)振，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液揮干乙醚，殘?jiān)哟姿嵋阴u，濾過，濾液揮干乙醚，殘?jiān)哟姿嵋阴?ml1ml使使溶解，作為供試品溶液。另取歐前胡素、異歐前溶解，作為供試品溶液。另取歐前胡素、異歐前胡素對照品，加醋酸乙酯制成每胡素對照品，加醋酸乙酯制成每1ml

18、1ml各含各含1mg1mg的混的混合溶液，作為對照品溶液。合溶液，作為對照品溶液。n 吸取上述兩種溶液各吸取上述兩種溶液各4l4l，分別點(diǎn)于同一以羧甲，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G G薄層板上，以石油薄層板上，以石油醚（醚（30603060）- - 乙醚（乙醚（3 3：2 2）為展開劑，在）為展開劑，在2525以下展開，取出，晾干，置紫外光燈（以下展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。 31 含香豆素成

19、分的中藥定量測定方法有比色法、熒含香豆素成分的中藥定量測定方法有比色法、熒光法、極譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、高光法、極譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。效液相色譜法、氣相色譜法等。 每種方法都有其特點(diǎn)，有的簡單，有的操作麻煩，每種方法都有其特點(diǎn)，有的簡單，有的操作麻煩，有的則需要一定的儀器設(shè)備。有的則需要一定的儀器設(shè)備。 相比之下，因該類成分多具有較強(qiáng)的熒光，故可相比之下，因該類成分多具有較強(qiáng)的熒光，故可熒光分光光度法進(jìn)行定量分析；薄層掃描法測其紫熒光分光光度法進(jìn)行定量分析；薄層掃描法測其紫外吸收或熒光的方法較簡便快速，兼有分離功能，外吸收或熒光的方法較簡

20、便快速，兼有分離功能，應(yīng)用日趨普遍；近年來又有了分離效率較高的高效應(yīng)用日趨普遍；近年來又有了分離效率較高的高效液相色譜技術(shù)，對復(fù)雜的中藥樣品更為合適。液相色譜技術(shù)，對復(fù)雜的中藥樣品更為合適。 32一熒光分光光度法一熒光分光光度法 n香豆素類化合物在紫外光的照射下顯藍(lán)色熒光，香豆素類化合物在紫外光的照射下顯藍(lán)色熒光，可用熒光分光光度法測定。如可用熒光分光光度法測定。如 7- 7- 羥基香豆素和香羥基香豆素和香豆素混合物的測定，前者用豆素混合物的測定，前者用370nm370nm激發(fā)，在激發(fā)，在450nm450nm測定，濃度為測定，濃度為110g110gmlml時(shí)熒光與濃度成線性失時(shí)熒光與濃度成線性

21、失系。后者用系。后者用361nm361nm激發(fā)，在激發(fā)，在491nm491nm測熒光。測熒光。n如果香豆素如果香豆素7 7位上有乙氧基（代謝產(chǎn)物）可使其變位上有乙氧基（代謝產(chǎn)物）可使其變?yōu)闉?- 7- 羥基香豆素用羥基香豆素用390nm390nm激發(fā)，激發(fā)，440nm440nm測定。測定。 1 1、應(yīng)用概況、應(yīng)用概況33 2 2應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例 （1 1）佛手油中的香豆素分析）佛手油中的香豆素分析 可用硅膠可用硅膠GFGF254254薄層分離，以己烷薄層分離，以己烷- - 醋酸乙酯醋酸乙酯（3 3：1 1）展開，分出）展開，分出4 4個(gè)熒光點(diǎn)即：檸美內(nèi)酯（個(gè)熒光點(diǎn)即：檸美內(nèi)酯（Citropte

22、nCitropten）；5- 5- 牻牛兒氧基牻牛兒氧基-7-7-甲氧基香豆素（甲氧基香豆素（5- 5-geranyloxy-7-methydroxycoumaringeranyloxy-7-methydroxycoumarin）；佛手內(nèi)酯；佛手內(nèi)酯和佛手柑亭（和佛手柑亭（bergamottinbergamottin），可直接在薄層上進(jìn)，可直接在薄層上進(jìn)行熒光測定，對于行熒光測定，對于和和用用330nm330nm激發(fā)，激發(fā)，424nm424nm測測定熒光，定熒光，和和用用272nm272nm激發(fā)，激發(fā)，520nm520nm測定。測定。 34二薄層色譜法二薄層色譜法 1 1熒光掃描法測定蛇床子中

23、蛇床子素含量熒光掃描法測定蛇床子中蛇床子素含量n 精密稱取在精密稱取在P P2 2O O5 5干燥器中減壓干燥至恒重的蛇干燥器中減壓干燥至恒重的蛇床子粉末床子粉末1g1g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20ml20ml，振搖后放置過夜，濾過，取續(xù)濾液，作為，振搖后放置過夜，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取蛇床子素對照品適量，精密稱供試品溶液。另取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加乙醇制定，加乙醇制1mg/ml1mg/ml的溶液，作為對照品溶液。的溶液，作為對照品溶液。n 精密吸取上述兩種溶液各精密吸取上述兩種溶液各1l1l，分別交叉點(diǎn)于同，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠薄層

24、板上，以苯一硅膠薄層板上，以苯- - 乙酸乙酯（乙酸乙酯（3030：1 1）為）為展開劑，展開，取出，晾干。展開劑，展開，取出，晾干。n 照 薄 層 色 譜 法 進(jìn) 行 熒 光 掃 描 ， 激 發(fā) 波 長照 薄 層 色 譜 法 進(jìn) 行 熒 光 掃 描 ， 激 發(fā) 波 長 X X365nm365nm，測量供試品與對照品熒光強(qiáng)度積分值，測量供試品與對照品熒光強(qiáng)度積分值. .n 本品含蛇床子素（本品含蛇床子素（C C1515H H1616O O3 3）不得少于）不得少于1.01.0 。 352 2紫外光區(qū)掃描法測定獨(dú)活中蛇床子素含量紫外光區(qū)掃描法測定獨(dú)活中蛇床子素含量 取獨(dú)活粗粉約取獨(dú)活粗粉約1g1

25、g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇加乙醇20ml20ml，超聲處理，超聲處理30min30min，放冷，濾過，濾液，放冷，濾過，濾液置置25ml25ml量瓶中，用少量乙醇分次洗殘?jiān)?，洗液并入量瓶中，用少量乙醇分次洗殘?jiān)?，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加乙醇液。另取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每制成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液，作為對照品溶液。的溶液，作為對照品溶液。 精密吸取供試品溶液精密吸取供試品溶液2l2l、對照品溶液、對照品溶液1l1l與

26、與2l2l，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G G薄層板上，以苯薄層板上，以苯- -乙酸乙酯乙酸乙酯（3030：1 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（光燈（365nm365nm）下檢視定位，照薄層色譜法進(jìn)行掃）下檢視定位，照薄層色譜法進(jìn)行掃描，描，s322nms322nm， R R370nm370nm，測量供試品吸收度積分值，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。與對照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。 本品含蛇床子素（本品含蛇床子素（C C1515H H1616O O3 3）不得少于）不得少于0.30%0.30%。 361 1

27、白芷中白芷中3 3種香豆素的測定種香豆素的測定 測定氧化前胡素（測定氧化前胡素（oxypeucedaninoxypeucedanin，），），歐前胡素（歐前胡素（imperatorinimperatorin，）和異歐前胡素（）和異歐前胡素（isoimperatorinisoimperatorin，），其方法是：準(zhǔn)確稱?。?，其方法是：準(zhǔn)確稱取、標(biāo)準(zhǔn)品各標(biāo)準(zhǔn)品各5mg5mg，用乙酸乙酯溶解，定，用乙酸乙酯溶解，定容至容至50ml50ml，分別取此溶液，分別取此溶液0.50.5、1.01.0、1.51.5、2.02.0、2.52.5、3.0ml3.0ml，均用乙酸乙酯定容至，均用乙酸乙酯定容至10m

28、110m1，制得，制得 6 6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 37 按下述條件進(jìn)行按下述條件進(jìn)行HPLCHPLC分析：以分析：以-Bondapak C-Bondapak C1818柱為色譜柱為色譜分離柱，加預(yù)柱以防樣品污染分析柱，流動(dòng)相為甲醇分離柱，加預(yù)柱以防樣品污染分析柱，流動(dòng)相為甲醇- - 水（水（7070：3030），流速），流速1.0ml1.0mlminmin，UV 254nmUV 254nm檢測各組分檢測各組分峰，進(jìn)樣峰，進(jìn)樣10l10l，以峰面積為縱坐標(biāo)，各成分濃度為橫坐，以峰面積為縱坐標(biāo)，各成分濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)，得3 3條通過原點(diǎn)的直線，線性范圍條通過原點(diǎn)的直線，

29、線性范圍0.005 0.05mg0.005 0.05mgmlml，其回歸方程如下：，其回歸方程如下： 氧化前胡素氧化前胡素 Y = 1521X + 25.40Y = 1521X + 25.40， r = 0.999r = 0.999 歐前胡素歐前胡素 Y = 1953X + 76.53Y = 1953X + 76.53， r = 1.000r = 1.000 異歐前胡素異歐前胡素 Y = 1930X + 53.73Y = 1930X + 53.73， r = 0.999r = 0.999 精密稱取白芷粉（精密稱取白芷粉（4040目）目）2g2g，置索氏提取器中，用乙，置索氏提取器中，用乙醚提取

30、醚提取9h9h，回收乙醚，真空干燥，殘?jiān)苡谝宜嵋阴ゲⅲ厥找颐?，真空干燥，殘?jiān)苡谝宜嵋阴ゲ⒍ㄈ莩啥ㄈ莩?5ml25ml，經(jīng)，經(jīng)MilliporeMillipore樣品過濾器過濾，同上色譜條件樣品過濾器過濾，同上色譜條件測定。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品分離情況（見圖測定。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品分離情況（見圖 13-113-1）較好。）較好。 3839四其它定量分析方法四其它定量分析方法 （一）比色法（一）比色法（1 1）該方法基于香豆素類化合物的內(nèi)酯環(huán)官能團(tuán)和）該方法基于香豆素類化合物的內(nèi)酯環(huán)官能團(tuán)和苯環(huán)上的羥基的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑反應(yīng)產(chǎn)苯環(huán)上的羥基的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色來進(jìn)行比色的方法。如異羥肟

31、酸鐵、生顏色來進(jìn)行比色的方法。如異羥肟酸鐵、4- 4- 氨氨基安替比林或氨基比林、三氯化鐵、三氯化鐵基安替比林或氨基比林、三氯化鐵、三氯化鐵- - 鐵氰化鉀、磷鉬酸、磷鎢酸。鐵氰化鉀、磷鉬酸、磷鎢酸。n 例如短茶素片中巖白菜素的測定例如短茶素片中巖白菜素的測定40（2 2）如果酚羥基的對位或鄰位未被取代，在堿性溶）如果酚羥基的對位或鄰位未被取代，在堿性溶液中則能和重氮化的對氨基苯磺酸反應(yīng)生成紫色液中則能和重氮化的對氨基苯磺酸反應(yīng)生成紫色或紅色?；蚣t色。 如佛手內(nèi)酯（如佛手內(nèi)酯（bergaptenbergapten）、傘花內(nèi)酯（）、傘花內(nèi)酯（umbelliferoneumbelliferone）

32、都能和重氮化對氨基苯磺酸反應(yīng)呈）都能和重氮化對氨基苯磺酸反應(yīng)呈色。色。 OOOH3CO+N NSO3HOH-COOHOH3COOHN NSO3H41（3 3）若香豆素衍生物）若香豆素衍生物C C6 6位上沒有取代基，則能與位上沒有取代基，則能與GibbsGibbs試劑反應(yīng)生成藍(lán)色。試劑反應(yīng)生成藍(lán)色。 OH-OOOHCOO-+NClOClClOClClNO-OOC42（二）紫外分光光度法（二）紫外分光光度法 1 1應(yīng)用原理應(yīng)用原理 （1 1）香豆素類衍生物的紫外吸收光譜一般表現(xiàn)為）香豆素類衍生物的紫外吸收光譜一般表現(xiàn)為 minmin244244士士4nm4nm（log3.26 3.54log3.

33、26 3.54）；）； maxmax275275士士4nm4nm（log3.98 4.10log3.98 4.10）；）； minmin300300士士5nm5nm（log3.52 3.8log3.52 3.8）；）； maxmax315315士士8nm8nm（log3.70 3.95log3.70 3.95）。）。 （2 2）如果分子中有羥基存在，特別在）如果分子中有羥基存在，特別在 C C6 6或或 C C7 7上，上，其主要最大吸收峰向紅位移。其主要最大吸收峰向紅位移。 43（3 3）呋喃香豆素的吸收峰向紫位移，它的）呋喃香豆素的吸收峰向紫位移，它的 maxmax在在 220 230nm

34、220 230nm及及250nm250nm。 （4 4）pHpH影響：在堿性溶液中香豆素的最大影響：在堿性溶液中香豆素的最大吸收峰位置較其在中性或酸性溶液中多數(shù)有吸收峰位置較其在中性或酸性溶液中多數(shù)有顯著地向紅位移現(xiàn)象，且吸收系數(shù)也有所增顯著地向紅位移現(xiàn)象，且吸收系數(shù)也有所增大。例如傘形花內(nèi)酯大。例如傘形花內(nèi)酯 maxmax325nm325nm（log4.15log4.15），），但在堿性溶液中，其但在堿性溶液中，其 maxmax 372nm 372nm（log4.23log4.23）。）。 44 秦皮為木犀科植物白蠟樹秦皮為木犀科植物白蠟樹Fraxinus chinensis Roxb.、苦

35、栃白蠟樹苦栃白蠟樹F. rhynchophylla Hance、尖葉白蠟樹、尖葉白蠟樹F. chinensis Roxb. var. acuminata Lingelsh.、宿柱白蠟樹、宿柱白蠟樹F. stylosa Ungelsh .等的干燥樹皮或干皮。具清熱燥濕、等的干燥樹皮或干皮。具清熱燥濕、收澀明目之功效。收澀明目之功效。454647主含香豆素類成分七葉樹苷（主含香豆素類成分七葉樹苷（aesculinaesculin，秦皮甲，秦皮甲素）及其苷元七葉樹內(nèi)酯（素）及其苷元七葉樹內(nèi)酯（aesculetinaesculetin，秦皮，秦皮乙素），并含白蠟樹苷（乙素），并含白蠟樹苷（fraxin

36、fraxin）、白蠟樹內(nèi)）、白蠟樹內(nèi)酯（酯（fraxetinfraxetin）、紫丁香苷（）、紫丁香苷（syringinsyringin）等。）等。 OOOglcHOaesculinOOHOHOaesculetinOOH3COHOO glcfraxin48n 取秦皮粉末取秦皮粉末1g1g，加乙醇，加乙醇10ml10ml，加熱回流，加熱回流10min10min，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取秦皮甲放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取秦皮甲素與秦皮乙素對照品，加乙醇制成每素與秦皮乙素對照品，加乙醇制成每1ml1ml各含各含5mg 5mg 的混合溶液，作為對照品溶液。的混合溶液，作為對照品溶液

37、。n 吸取上述兩種溶液各吸取上述兩種溶液各3l3l，分別點(diǎn)于同一硅膠，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以甲苯薄層板上，以甲苯- - 乙酸乙酯乙酸乙酯- - 乙醇乙醇- - 甲酸（甲酸（3 3：4 4：2 2：1 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（光燈（365nm365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 49502定量分析定量分析 （1 1）薄層）薄層- -分光光度法分光光度法n 對照品溶液的制備：對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)精密稱取經(jīng)808

38、0干燥至恒干燥至恒重的秦皮甲素對照品重的秦皮甲素對照品20mg20mg，置，置10ml10ml量瓶中，加乙量瓶中，加乙醇適量，振搖使溶解，必要時(shí)可微溫加熱，放冷醇適量，振搖使溶解，必要時(shí)可微溫加熱，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，即得。，加乙醇至刻度，搖勻，即得。 51n標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取對照品溶液精密吸取對照品溶液3030、5050、7070、9090與與 110l110l，照薄層色譜法試驗(yàn)，沿硅膠薄，照薄層色譜法試驗(yàn)，沿硅膠薄層板的起始線分別點(diǎn)成層板的起始線分別點(diǎn)成 35cm35cm的長條（據(jù)點(diǎn)樣量的長條（據(jù)點(diǎn)樣量的多少而定），以正丁醇的多少而定），以正丁醇- - 氯仿氯仿

39、- - 甲苯甲苯- - 甲酸（甲酸（8 8：1 1：1 1：1 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（光燈（365nm365nm） 下檢視定位，分別刮取對照品條下檢視定位，分別刮取對照品條斑置具塞錐形瓶中。同時(shí)刮取同一薄層板下端與斑置具塞錐形瓶中。同時(shí)刮取同一薄層板下端與條斑等面積的硅膠作為空白，置另一具塞錐形條斑等面積的硅膠作為空白，置另一具塞錐形瓶中，各瓶均精密加入乙醇瓶中，各瓶均精密加入乙醇10ml10ml，4545水浴小心水浴小心加熱加熱30min30min，放冷，濾過，取續(xù)濾液，照分光光度，放冷，濾過，取續(xù)濾液，照分光光度法，在法，在336n

40、m336nm的波長處測定吸收度，以吸收度為的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 52n 測定法：測定法：取秦皮粉末約取秦皮粉末約1g1g，精密稱定，置，精密稱定，置50ml50ml具塞錐形瓶中，精密加入乙醇具塞錐形瓶中，精密加入乙醇10ml10ml，稱定重量，稱定重量，加熱回流加熱回流30min30min，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。溶液。53 照薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液照薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取供試

41、品溶液50l50l，沿硅膠薄層板的起始線點(diǎn)成沿硅膠薄層板的起始線點(diǎn)成5cm5cm的長條，另精的長條，另精密吸取對照品溶液密吸取對照品溶液5l5l，點(diǎn)于供試品條斑一側(cè)間，點(diǎn)于供試品條斑一側(cè)間隔隔1.5cm1.5cm處，作為對照。以正丁醇處，作為對照。以正丁醇- - 氯仿氯仿- - 甲苯甲苯- - 甲酸（甲酸（8 8：1 1：1 1：1 1）為展開劑，展開，取出，晾）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈干，置紫外光燈(365nm)(365nm)下檢視，刮取與對照品下檢視，刮取與對照品色譜中斑點(diǎn)相應(yīng)位置上的供試品色譜中的條斑，色譜中斑點(diǎn)相應(yīng)位置上的供試品色譜中的條斑，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自

42、照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“置具塞錐置具塞錐形瓶中形瓶中”起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中秦皮甲素的重量，計(jì)算，即讀出供試品溶液中秦皮甲素的重量，計(jì)算，即得。得。 本品含秦皮甲素（本品含秦皮甲素（C C1515H H1616O O9 9）不得少于）不得少于1.36%1.36%。 54 補(bǔ)骨脂補(bǔ)骨脂: : 為豆科植物補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea Psoralea corylifolia corylifolia L. L. 的果實(shí)。具的果實(shí)。具溫腎助陽、納氣、溫腎助陽、納氣、止瀉功效。止瀉功效。55n主含香豆素類成分補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（主含香豆素類成分補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（psoralenpsoralen）、異補(bǔ)）、異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（骨脂內(nèi)酯（isopsoralenisopsoralen）、補(bǔ)骨脂