組織細胞原位凋亡實驗

1、 TUNEL 法測凋亡操作步驟一、TUNEL檢測原理 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒是采用非同位素方法來檢測細胞在凋亡過程中DNA 的斷裂情況，可在原位快速準確地檢測單個凋亡細胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。 其原理是細胞凋亡發(fā)生時，內(nèi)源性核酸酶激活，使DNA的雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）作用下，組織細胞原位DNA切口可被標記上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End L

2、abeling），可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，顯示為棕色（過氧化物酶活性），特異準確地定位正在凋亡的細胞，在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞；由于正的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH 形成，很少能夠被染色。二、試劑盒組份 組 份 10 assays 25 assays 儲存條件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 L 25 L -20 C：TdT

3、Enzyme 10 L 25 L -20 D：500×Proteinase K 10 L 25 L -20 20×SSC 15 mL 38 mL 4 E：Streptavidin-HRP 10 L 25 L 4 F：20×DAB Substrate Buffer 50 L 125 L 4 G：20×DAB Chromogen 50 L 125 L 4 H：20×Hydrogen Peroxide 50 L 125 L 4 三、操作流程1.操作流程概覽2.細胞樣本制備準備： PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2H

4、PO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去離子水中，HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1L。 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制； 封閉液：3%H2O2溶于甲醇； 細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；操作步驟：1)經(jīng)過實驗處理的細胞爬片或細胞涂片，自然晾干；2)室溫固定15min30min；PBS漂洗3×5min；3)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；4)浸入細胞膜通透液中，室溫30sec2min；5)進行標記反應(yīng)。3.石蠟包埋組織切片預(yù)處理準備： 石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟2×10

5、min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）； 蛋白酶K工作液：2 L500×蛋白酶K + 998 L PBS； 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制； 封閉液：3%H2O2溶于甲醇。操作步驟：1)石蠟包埋的組織切片按常規(guī)方法脫蠟至水；2)PBS漂洗3×5min；3)加入蛋白酶K工作液，37反應(yīng)1530min；PBS漂洗3×5min；4)（選擇進行）室溫固定15min30min；PBS漂洗3×5min；5)浸入封閉液中，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min；6)進行標記反應(yīng)。4.冰凍組織切片預(yù)處理準備

6、： 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制； 封閉液：3%H2O2溶于甲醇； 細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；操作步驟：1)冰凍切片浸入固定液，室溫固定10min；PBS漂洗3×5min；2)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；3)浸入通透液中，室溫30sec2min；4)進行標記反應(yīng)。5.陽性對照和陰性對照的準備TUNEL檢測時需要設(shè)立陽性對照和陰性對照，以顯示實驗的客觀性和準確性。1)陽性對照樣本的處理（選擇進行） DNaseI反應(yīng)液（用戶自備）： （10U-3000U DNase I；40mM T

7、ris-HCl pH 7.9； 10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）組織樣本經(jīng)過蛋白酶K處理或者通透液處理，PBS浸洗后，加入100 L DNaseI反應(yīng)液，室溫孵育1030min，用去離子水徹底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，進行標記反應(yīng)。2)陰性對照樣本的處理 在進行標記反應(yīng)過程配制TdT酶反應(yīng)液時，不加入TdT酶，其余步驟相同。四、標記和顯色反應(yīng)以下操作在濕盒內(nèi)進行。1.預(yù)處理好的樣本經(jīng)過PBS漂洗后，用濾紙輕輕吸去樣本周圍液體；2.每個樣本滴加100 L TdT酶反應(yīng)液，于37#61616;C避光反應(yīng)60min；TdT酶反應(yīng)液的準備（即用即配）： 成分 標

8、準100 L/片 切片數(shù) 總體積 Equilibration Buffer 98 L × = Biotinylated Nucleotide Mix 1 L × = TdT Enzyme 1 L × =陰性對照片不加TdT酶。3.用去離子水按1：10稀釋20×SSC，進行終止反應(yīng)，室溫15min；然后PBS漂洗3×5min；4.浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育35min；PBS漂洗3×5min；5.滴加100 L Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀釋為工作液），于37反應(yīng)3060min；6.PBS漂洗3×5min；7.滴加DAB顯色液： 成分 100 L/片 切片數(shù) 總體積 20×DAB Substrate Buffer 5 × = 20×DAB Chromogen 5 × = 20×Hydrogen Peroxide 5 × = ddH2O 85 × =8.用去離子水漂洗數(shù)