病毒TCID50測定參考模板

1、病毒TCID50測定操作步驟(1) 準(zhǔn)備細(xì)胞 取出一塊細(xì)胞培養(yǎng)板，每個孔大約傳800010000個細(xì)胞（一個T25瓶的細(xì)胞消化后加10ml培養(yǎng)液正好傳一塊96孔板，要傳勻）。每個孔的細(xì)胞鋪成單層大約60豐度即可接種病毒（下午傳好板第二天早上就能用）。細(xì)胞對照選取16個孔即可。滴定與對照可以在一塊培養(yǎng)板上進(jìn)行，操作中注意不要竄孔。也可以分別在不同的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，但要保證實驗條件一致。(2) 稀釋待測病毒液。A法為參考書上標(biāo)準(zhǔn)的操作方法B法參照書將液體量減少后的結(jié)果病毒稀釋液根據(jù)是否需要胰酶來選擇適合的液體，無論哪種都無血清。A向每支試管中加入1.8ml病毒稀釋液。向1號試管中加入0.2ml病

2、毒，依次10倍系列稀釋至適宜濃度，最后一支試管。B在EP管中用無血清的孵育液10倍倍比稀釋病毒原液(10-1，10-210-10等)，根據(jù)病毒大致的滴度確定稀釋的倍數(shù)。首次滴定可以多稀釋幾個滴度。根據(jù)接種的孔數(shù)稀釋病毒，常規(guī)每個稀釋度接種4孔，則每個稀釋度配500µl，即10-1為50µl加入450µl的孵育液中；如每個稀釋度接種8個孔，則各配制1ml，即10-1為100µl加入900µl孵育液中。若接種8個孔，則相應(yīng)增加液體量。上述的配液并不是固定不變的，可以根據(jù)接種的量自行調(diào)整?！?！此步操作注意事項：1）建議每個稀釋度接種8個孔，若要統(tǒng)計分

3、析則還要增加至16個孔。2）病毒稀釋過程中一定將病毒液與孵育液充分混勻。2）此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，并用紫外線照射20min，確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺（或安全柜中打開）?！?3) 接種取細(xì)胞培養(yǎng)板，用多道加樣器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根據(jù)觀察的習(xí)慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度（10-1，10-2 ）到原液加樣。【切記：設(shè)置正常的細(xì)胞對照。每次實

4、驗要重復(fù)4次，計算標(biāo)準(zhǔn)差。】37CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，取出培養(yǎng)板吸去病毒液（從低濃度向高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200µl繼續(xù)在37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4) 培養(yǎng)1 / 7將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)溫度     ，培養(yǎng)    天。(5) 測定結(jié)果取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。計算方法1) Spearman-Karber 法    LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×R1/N1）    

5、0;    X0 = 全部病變最低稀釋度對數(shù)     d = 稀釋因數(shù)對數(shù)     N1 = 每個稀釋度所種的孔數(shù)     R1 = 病變孔數(shù)                       = 積和 LgCCID50 /ml = L

6、gCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench法觀察CPE, 找出能引起半數(shù)細(xì)胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數(shù)，按計算出該病毒液的TCID50TCID50 是指組織培養(yǎng)物（細(xì)胞）半數(shù)致死計量。它有幾個性質(zhì)我們必須明白：1）它表示的是計量，不是濃度； 2）它是一個單位；3）它的值等于1，實際上問它的值等于多少是一個沒有意義的問題，就像問km的值等于多少一樣，如果非要說出的的值等于多少，那我們只能說它的值在任何情況下都等于1。理解這三個性質(zhì)對于理解TCID50非常重要，但是這三個性質(zhì)經(jīng)常被誤解，所以導(dǎo)致對TCID50的理解出現(xiàn)偏差。首先我們來看一下這個表示法的意思：病毒濃度為108.

7、2TCID50/ml它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2個TCID50的病毒，這和氯化鈉的濃度為4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5個mol的氯化鈉是一樣的道理。經(jīng)常可以聽到人說我的病毒的TCID50是10xx。這個說法是不科學(xué)的，應(yīng)該說我這個溶液里含有多少個TCID50的病毒或者說我這個溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.理解了TCID50的概念之后，我們再來看看TCID50是如何計算的？請看例子： 每個所加液體的體積是0.08ml。圖中給出的計算方法是有問題的，請先忽略不看。從圖中我們可以知道半數(shù)致死的稀釋度肯定是介于10-6到107之間，肯定可以表示成10-6.xx。那么這個

8、.xx到到底是多少呢？這實際上是一個線性插值的問題。求解見下圖： PD/log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)=(%next above 50%)-50%/(%next above 50%)-(%next below 50%)注意：如果你的病毒是以3倍3倍地稀釋那么上面這個公式的log就應(yīng)該是以3為底的log，其他稀釋度與此相類似。在本例子中PD/(-6)-(-7)=(80%-50%)/(80%-0%)PD=0.375log(50的致死的稀釋度)=-6-0.375=-6.375求解得到50的致死的稀釋度為10-6.375根據(jù)TCID50的

9、定義，就把這個稀釋度所含的病毒的量定義為1個TCID50.在本例中即定義把病毒稀釋到106.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量為1個TCID50.接下來我們就可以根據(jù)這個定義來求原液的病毒溶度。通常求解每ml含有多少個TCID50的病毒。我們先要來求解這個問題：已知把病毒稀釋到106.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量為1個TCID50，那么病毒原液直接取0.080ml有多少個TCID50.很顯然0.080ml病毒原液有106.375個TCID50。再求解1ml有多少個TCID50就簡單了：設(shè)1ml這樣的病毒原液就有x個TCID50x/1ml106.375/0.080mlx=1

10、06.375/0.08=2.9*108所以每ml這樣的病毒原液有2.9108個TCID50，即該病毒原液的溶度為2.9*108TCID50/ml如果對于上面我說的“很顯然“你一時顯然不起來的話，我可以幫你舉這樣的一個例子：你把溶度未知的DNA溶液稀釋100倍(即稀釋到10-2稀釋度)后取 0.080ml去測0D值結(jié)果發(fā)現(xiàn)這0.08ml的稀釋液含有1個ug的DNA，那么很顯然可以知道如果直接取0.080ml的原液就應(yīng)該含有100ug 的DNA，該DNA 溶液的溶度為100ug/0.080ml=1250ug/ml。如果你還很顯然不起來的話，建議你不要從事和理工科相關(guān)的工作，你可去當(dāng)總統(tǒng)什么的，千萬別當(dāng)財政部部長！說明：我們已經(jīng)證實，TCID50法測到的滴度d=log10值比標(biāo)準(zhǔn)空斑法高0.7。將TCID50/ml轉(zhuǎn)換為PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml4×107 PFU/ml。兩次重復(fù)試驗得到的滴度值應(yīng)相差0.7個log1