喇咕多糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制及其對(duì)糖尿病大鼠血糖影響的實(shí)驗(yàn)

1、喇咕多糖對(duì)-淀粉酶活性的抑制及其對(duì)糖尿病大鼠血糖影響的實(shí)驗(yàn)        【關(guān)鍵詞】  喇咕多糖 -淀粉酶活性 血糖    糖尿病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，并發(fā)癥、致殘率均較高，而且隨著全球老齡化趨勢(shì)的加劇，糖尿病的發(fā)病率還將逐年上升。植物提取物1，2降糖的研究已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)證實(shí)，且具有毒副作用小、療效確切的優(yōu)勢(shì)。我們觀察了喇咕多糖在體外對(duì)-淀粉酶活性的抑制作用及其對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響。1   材料與儀器1.1   喇咕多糖的制備

2、3取喇咕殼，用水洗凈，于室溫下在56HCl中攪拌浸漬24 h，過(guò)濾，收集濾渣，水洗后在34NaOH液(加少量肥皂)中熱回流46 h，重復(fù)2次。濾餅經(jīng)水洗，干燥即得粗制甲殼質(zhì)。粗品在0.5高錳酸鉀中攪拌浸漬約1 h，水洗后在1的草酸中于6070攪拌3040min，水洗、干燥即得白色精制甲殼質(zhì)，將其投入50NaOH 140加熱2 h，離心，收集沉淀，水洗干燥即得白色喇咕殼聚糖。1.2   動(dòng)物Wistar種成年大鼠，體重170190g，雌雄各半,由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3   儀器、試劑-淀粉酶凍干粉（醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：

3、F20021030）；麥芽糖（上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)：030125）；3,5-二硝基水楊酸（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：20030704）；阿卡波糖（中國(guó)北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品，批號(hào)：00102903）；D-860（甲苯磺丁脲，江蘇丹陽(yáng)市藥業(yè)有限責(zé)任公司出品，批號(hào)：0021056）；四氧嘧啶（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：73K1626）；AU-400全自動(dòng)生化分析儀（本奧林巴林公司出品）；穩(wěn)捷型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司提供）。稱取3,5-二硝基水楊酸1.0 g，加入1 mmol·L-1氫氧化鈉溶液20 ml超聲處理30 min, 成乳白色混懸液，再加入50 ml蒸

4、餾水,混勻即成黃色澄清液體，準(zhǔn)確稱量30.0 g酒石酸鉀鈉加入，振蕩混勻，待酒石酸鉀鈉完全溶解后用蒸餾水定容至100 ml，蓋緊瓶蓋,勿使CO2 進(jìn)入。2  方法2.1  樣品活性的測(cè)定7支試管編號(hào)，一支為對(duì)照管，另6支為測(cè)定管，對(duì)照管加入 0.2ml pH6.6 的0.2 mmol·L-1磷酸緩沖液,另6支試管分別加入濃度為0.001 6，0.008，0.04，0.2，1，5 mg·ml-1的喇咕多糖溶液（-淀粉酶及喇咕多糖溶液均用0.2 mmol·L-1 PH6.6的磷酸緩沖液配制）；7支試管依次加入0.2ml -淀粉酶溶液并及時(shí)混勻，各管

5、同時(shí)放入37恒溫水浴箱，分別加入37預(yù)熱的淀粉液0.4ml，充分混勻立即放入37恒溫水浴保溫5 min，然后取出迅速加入0.8 ml的0.4mmol·L-1氫氧化鈉溶液終止酶活性。以上實(shí)驗(yàn)分別設(shè)4組，將喇咕多糖與-淀粉酶的反應(yīng)時(shí)間設(shè)為10，20，30，40 min，同時(shí)本底基數(shù)的測(cè)定為喇咕多糖與-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間定在10 min，反應(yīng)后加入37預(yù)熱的磷酸緩沖液0.4 ml代替淀粉液，其他步驟同樣品的測(cè)定。2.2  OD值的測(cè)定樣品及本底基數(shù)測(cè)定各管中溶液各1 ml，放入10ml刻度試管，再分別加入1 ml DNS試劑混勻，置沸水浴8 min后，室溫下冷卻15 min，用蒸餾水

6、稀釋至10ml并混勻，用721分光光度計(jì)于520 nm 處測(cè)吸光度即OD值。抑制率（%）= 1-（樣品OD值-本底OD值）/ 對(duì)照管OD值。2.3  設(shè)陽(yáng)性對(duì)照即測(cè)定阿卡波糖對(duì)-淀粉酶的抑制率阿卡波糖溶液的濃度及抑制率的測(cè)定過(guò)程，與喇咕多糖抑制率的測(cè)定過(guò)程相同并同時(shí)進(jìn)行，阿卡波糖溶液與-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間定為25min，重復(fù)3次。2.4  喇咕多糖對(duì)四氧嘧啶糖尿病大鼠模型的降糖作用   按4方法造模，正常Wistar大鼠禁食12 h，按50mg·kg-1體重劑量尾靜脈快速注射2.5 %四氧嘧啶生理鹽水溶液。造模注射后96h尾靜脈采血用強(qiáng)生

7、穩(wěn)捷血糖儀測(cè)定空腹血糖（取血前禁食12h），血糖高于11.1mmol·L-1視為造模成功。將其隨機(jī)分為3組，每組11只，即造模組（Model）、喇咕多糖組（PP）、陽(yáng)性對(duì)照組。另設(shè)正常對(duì)照組（Normal）不予造模注射。即日開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d。正常對(duì)照組和造模組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予D-860 100mg·kg-1，喇咕多糖組給予喇咕多糖200mg·kg-1，每組灌胃按體積均為每只2 ml/次。給藥5 d并禁食10 h后眼眶采血葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖。然后，造模組及正常對(duì)照組灌胃7.5%（2ml）的淀粉糊精；多糖組灌胃7.5%淀粉糊精-2

8、00 mg·kg-1喇咕多糖混合物（2 ml）；陽(yáng)性對(duì)照組灌2 ml 7.5% 淀粉糊精及100 mg·kg-1劑量的D-860混合物。測(cè)定給淀粉后0.5，1，2 h的血糖值，采血及測(cè)定方法同空腹血糖。2.5   統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量資料用±s表示，t檢驗(yàn)。 1         3  結(jié)果3.1  喇咕多糖體外對(duì)-淀粉酶活性的抑制作用喇咕多糖10，20，30，40 min 4個(gè)時(shí)間段的量效曲線接近直線，呈劑量依賴性； 6個(gè)濃度組均于20 min

9、時(shí)間段達(dá)最大抑制率，在30 min段抑制率下降，40 min稍回升，提示各濃度組存在相近的時(shí)效關(guān)系,且存在最佳作用時(shí)間。阿卡波糖的量效曲線也接近直線，并隨藥物濃度增加而遞增，最大抑制率70.9%。見(jiàn)圖12。3.2   喇咕多糖對(duì)四氧嘧啶糖尿病大鼠血糖水平的影響四氧嘧啶糖尿病大鼠，多糖組后的空腹血糖值明顯低于造模組，差異有極顯著性意義（P0.01），多糖組的餐后2h血糖明顯低于造模組，差異有顯著性意義（P0.05）。多糖組的血糖水平與造模組相比均顯著降低（P0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。表1  喇咕多糖對(duì)糖尿病大鼠空腹及餐后血糖的影響（略）與模型組比較，*P0.01

10、， *P0.05；n=114  討論    糖尿病的藥物治療分為兩類：胰島素治療及口服降糖藥物治療。但大多數(shù)藥物治療均有一定的副作用，患者難以堅(jiān)持治療,因此探索新的降糖藥物勢(shì)在必行。淀粉酶抑制劑降血糖是20世紀(jì)70年代后興起的新的降血糖思路。-葡萄糖苷酶抑制劑副作用較小，此類物質(zhì)可抑制消化道，尤其是十二指腸的淀粉酶活性，因而減少或延緩消化道淀粉水解為單糖，使單糖的吸收減少而降低血糖，所以對(duì)糖尿病病人餐后高血糖以及過(guò)食碳水化合物引起的脂肪增加有對(duì)抗作用。據(jù)國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道，一些多糖類化合物有體外抑制淀粉酶活性作用5，6。kobayashi k7篩選了40種生藥

11、提取物對(duì)小鼠血漿中淀粉酶活性和餐后血糖的影響。這些天然物質(zhì)可抑制胃腸道中-淀粉酶的活性，有望改善糖尿病患者餐后的血糖升高。    甲殼素是一種天然直鏈狀酰胺類多糖，化學(xué)名為l,4-二乙酰胺基-2-脫氧-p-D-葡聚糖。殼聚糖是甲殼素的主要衍生物，是由甲殼素經(jīng)脫乙酰基后得到的一種高分子氨基多糖?；瘜W(xué)名稱為(1-4)2-氨基-2-脫氧-B-D-葡萄糖，或簡(jiǎn)稱聚氨基葡萄糖。由于這種殼聚糖的大分子結(jié)構(gòu)中存在大量氨基，從而大大改善了甲殼素的溶解性和化學(xué)活性，因此使它在醫(yī)療、營(yíng)養(yǎng)和保健等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外的家都將它作為人體第六生命要素進(jìn)行深入研究和開(kāi)發(fā)。&

12、#160;   本研究顯示，喇咕多糖在體外對(duì)-淀粉酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴性，0.001 6（5 mg·ml-1）喇咕多糖溶液抑制率的量效曲線近似直線，其抑制率相當(dāng)于同等濃度阿卡波糖抑制作用的50%左右。喇咕多糖抑制率的時(shí)效曲線提示喇咕多糖對(duì)-淀粉酶的抑制作用可能是可逆的，并可能存在時(shí)間依賴性，即存在最佳作用時(shí)間。    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，喇咕多糖可顯著降低四氧嘧啶高血糖大鼠的空腹血糖及餐后血糖，其降低空腹血糖水平與D-860（甲苯磺丁脲）相當(dāng)，其降低餐后2h血糖效果明顯優(yōu)于D-860；且對(duì)正常大鼠血糖水平無(wú)顯著影響，表明喇

13、咕多糖可降低四氧嘧啶大鼠的空腹血糖及改善餐后血糖過(guò)度升高，而不會(huì)導(dǎo)致低血糖，其降血糖機(jī)制可能與其抑制-淀粉酶活性、延緩碳水化合物在腸道的吸收有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。【】  1徐仲溪,王坤波.茶多糖化學(xué)及生物活性的研究J.茶葉科學(xué),2004,24（2）：75.2付海平,黃懷生,胡孟陽(yáng)，等. 茶多糖生物活性及提取純化的研究進(jìn)展J.茶葉通訊,2006,33（2）：24.3侯惠民甲殼質(zhì) 一種具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的新材料J.醫(yī)藥，1988，19(7)：328.4張均田.藥理實(shí)驗(yàn)方法M.北京：北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1998：982.5劉華珍,江紅磊,楊勁松.微生物產(chǎn)生的淀粉酶抑制劑研究·發(fā)酵、分離與理化性質(zhì)J.中